TW201732033A - 細胞捕捉過濾器、細胞捕捉裝置、細胞捕捉方法、細胞觀察方法及細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

一種用於細胞捕捉裝置的過濾器105，其包括：片狀的本體部分（卑金屬鍍敷層5），鎳或銅為主成分、且於厚度方向上形成有多個貫穿孔；鈀層7，鈀為主成分、且覆蓋所述本體部分的表面；以及金層8，金為主成分、且覆蓋所述鈀層的表面。

Description

細胞捕捉過濾器、細胞捕捉裝置、細胞捕捉方法、細胞觀察方法及細胞培養方法

本發明是有關於一種可高效率地捕獲以血中循環癌細胞（Circulating Tumor Cell：CTC）為首的血中的稀少細胞的細胞捕捉過濾器、細胞捕捉裝置、細胞捕捉方法、細胞觀察方法及細胞培養方法。

於世界各國中，癌佔據死因的上位，在日本每年30萬人以上因癌而死亡，而期望癌的早期發現及治療。由癌所引起的人的死亡大部分是由癌的轉移復發所引起的死亡。癌的轉移復發是因癌細胞自原發灶起經由血管或淋巴管，固定、浸潤於其他臟器組織的血管壁中並形成微小轉移灶而產生。此種穿過血管或淋巴管的於人的體內循環的癌細胞被稱為血中循環癌細胞。

於血液中含有許多紅血球、白血球及血小板等血球成分，亦有其個數於血液1 mL中為3.5×10⁹ 個～9×10⁹ 個的說法。其中，CTC僅存在幾個左右。為了自血球成分中有效率地檢測CTC，必須分離血球成分。相對於此，正在研究應用機械過濾法來去除該些血球成分，並對癌細胞進行濃縮。作為用以進行此種機械過濾法的過濾器，考慮使用金屬過濾器。作為金屬過濾器的製造方法，已知有例如利用光微影的電鑄造（電鑄）鍍敷的方法（專利文獻1）。 現有技術文獻 專利文獻

專利文獻1：日本專利特開2011-163830號公報

[發明所欲解決之課題] 當使用金屬過濾器來捕捉CTC等稀少細胞時，存在所述稀少細胞源自血液等試樣液且金屬過濾器溶出的情況。當金屬過濾器的材料為具有細胞毒性的成分時，可想到對於藉由過濾器捕捉到的細胞亦產生影響的可能性。作為防止該情況的方法，考慮藉由鍍金來覆蓋過濾器的表面，但亦可想到所述方法有時並不充分。

本發明是鑒於所述情況而成者，其目的在於提供一種可一面抑制捕捉到的細胞的損傷，一面適宜地進行稀少細胞的捕捉的細胞捕捉過濾器，以及使用該細胞捕捉過濾器的細胞捕捉裝置、細胞捕捉方法、細胞觀察方法及細胞培養方法。 [解決課題之手段]

為了達成所述目的，本發明的一形態的細胞捕捉過濾器包括：片狀的本體部分，鎳或銅為主成分、且於厚度方向上形成有多個貫穿孔；鈀層，鈀為主成分、且覆蓋所述本體部分的表面；以及金層，金為主成分、且覆蓋所述鈀層的表面。

如上所述，於本體部分的表面上積層有鈀層與金層，藉此可防止細胞捕捉過濾器的本體部分露出至外部。若本體部分露出至外部，則本體部分的金屬離子流出（溶出），因此存在捕捉到的細胞損傷的可能性。相對於此，藉由將鈀層設置於金層的內側，可防止鈀層的內側的本體部分露出至外部，因此可適宜地進行稀少細胞的捕捉，並且可防止細胞捕捉過濾器上捕捉到的細胞因本體部分的金屬離子的流出而損傷。

此處，可設為所述鈀層的膜厚為0.1 μm～1 μm的形態。

如上所述，藉由將鈀層的厚度設為0.1 μm～1 μm，可進一步防止細胞捕捉過濾器的本體部分的金屬離子的流出（溶出）。

另外，可設為更包括藉由在骨架的一部分中具有磷脂質的表面處理劑而形成於所述金層的表面上的疏水化層的形態。

如上所述，當於細胞捕捉過濾器的金層的表面上具有藉由在主要的骨架中含有磷脂質的表面處理劑所形成的疏水化層時，可防止稀少細胞及其他細胞附著於細胞捕捉過濾器的表面上，並可提高稀少細胞的捕捉效率。

另外，本發明的一形態的細胞捕捉裝置包括：框體，具有用以朝內部導入試樣液的導入流路、及用以朝外部排出所述試樣液的排出流路；以及所述細胞捕捉過濾器，以所述試樣穿過所述貫穿孔的方式設置於所述導入流路與所述排出流路之間的所述框體的內部的流路上。

於所述細胞捕捉裝置中，藉由在細胞捕捉過濾器的本體部分的表面上積層有鈀層與金層，可防止細胞捕捉過濾器的本體部分露出至外部。因此，可適宜地進行稀少細胞的捕捉，並且可防止細胞捕捉過濾器上捕捉到的細胞因本體部分的金屬離子的流出而損傷。

另外，本發明的一形態的細胞捕捉方法利用所述細胞捕捉過濾器進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞。

藉由利用所述細胞捕捉過濾器進行過濾，可一面防止由本體部分的金屬離子的流出所引起的細胞的損傷等，一面選擇性地捕捉特定的細胞。

另外，本發明的一形態的細胞觀察方法利用所述細胞捕捉過濾器進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞，使用固定液固定所述細胞捕捉過濾器上捕捉到的所述特定的細胞後，利用電子顯微鏡進行觀察。

於所述細胞觀察方法中，可一面防止由來自細胞捕捉過濾器的本體部分的金屬離子的流出所引起的細胞的損傷等，一面適宜地進行特定的細胞的觀察。

另外，本發明的一形態的細胞培養方法利用所述細胞捕捉過濾器進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞，並利用培養液對所述細胞捕捉過濾器上捕捉到的所述特定的細胞進行培養。

於所述細胞培養方法中，可一面防止由來自細胞捕捉過濾器的本體部分的金屬離子的流出所引起的細胞的損傷等，一面於過濾器上對特定的細胞進行培養。 [發明的效果]

根據本發明，提供一種可一面抑制捕捉到的細胞的損傷，一面適宜地進行稀少細胞的捕捉的細胞捕捉過濾器，以及使用該細胞捕捉過濾器的細胞捕捉裝置、細胞捕捉方法、細胞觀察方法及細胞培養方法。

以下，參照隨附圖式對用以實施本發明的形態進行詳細說明。再者，於圖式的說明中對同一要素標註同一符號，並省略重複的說明。

一面參照圖1，一面對應用本發明的一實施形態的細胞捕捉過濾器的細胞捕捉裝置進行說明。如圖1所示，細胞捕捉裝置100包括：框體120，具有連接有包含捕捉對象的稀少細胞的試樣液所流入的流入管125（導入流路）的流入口130、及連接有試樣液所流出的流出管135（排出流路）的流出口140；以及過濾器105（細胞捕捉過濾器），配置於框體120內，並具有捕捉試樣液中所含有的稀少細胞的捕捉區域。

作為細胞捕捉裝置100中的過濾器105進行捕捉的對象的「稀少細胞」是指生物試樣中所含有的特定種類的細胞。作為此種稀少細胞，例如可列舉：血液中所含有的血中循環癌細胞（CTC：Circulating Tumor Cell）、及循環血管內皮細胞（CEC：Circulating Endothelial Cell）。CTC是血液中的癌症（癌）細胞。另外，CEC是血管的內皮細胞，且是成為藉由代謝而自血管壁上剝落的成熟細胞者。CTC據說於循環系統的疾病（心肌梗塞等）等病狀下會增加。於細胞捕捉裝置100中，具有選擇性地捕獲如CTC及CEC等般包含於試樣液中的特定種類的稀少細胞的功能。再者，當CTC或CEC為捕捉對象時，作為試樣液，可使用血液或對血液添加緩衝液等添加劑而成的液體，但並不限定於此。例如，當以經播種及微轉移的癌細胞的檢測為目的時，亦可將淋巴液等體液及含有該些的液體用作試樣液。另外，於利用細胞捕捉裝置100捕捉稀少細胞之前，亦可對試樣液中所含有的捕捉對象的稀少細胞實施標誌化等修飾。

框體120是用於保持用以捕捉稀少細胞的過濾器105的構件，包含上部構件110及下部構件115。框體120的形狀可為長方體或圓筒等，並無特別限制。

於流入管125的上游連接例如與試樣液或清洗液等處理液相關的容器或配管。另外，於流出管135的下游連接泵P，藉此利用泵P的驅動而自流入管125朝框體120的內部供給試樣液等。另外，藉由泵P的驅動，試樣液等被自流出管135排出至外部。

於過濾器105中形成有多個貫穿孔106。當將血液作為試樣液導入至細胞捕捉裝置100內時，血液的紅血球等穿過貫穿孔106，但捕捉對象的稀少細胞無法穿過貫穿孔106，而滯留於過濾器105表面上。藉此，可回收血中的稀少細胞。再者，亦可對藉由過濾器105捕捉到的細胞進行染色等追加處理。於此情況下，可使緩衝液、染色液、培養液等追加的液體穿過捕捉到細胞的過濾器105，藉此進行各種處理。

再者，細胞捕捉裝置100的形狀並不限定於所述形狀。只要可使包含捕捉對象的稀少細胞的試樣液穿過設置於過濾器105中的多個貫穿孔106，則細胞捕捉裝置100的具體的構成並無特別限定。

對過濾器105進一步進行說明。圖2是示意性地表示過濾器105的上表面的圖。細胞捕捉裝置100中所使用的過濾器105的特徵在於：於鎳或銅為主成分、且在厚度方向上形成有多個貫穿孔的片狀的本體部分的外側形成有將鈀作為主成分的鍍鈀層，進而於鍍鈀層的外側形成有將金作為主成分的鍍金層。即，於過濾器105中，本體部分的表面由鍍鈀層覆蓋，並且鍍鈀層的表面由鍍金層覆蓋。再者，於本實施形態中，特定的材料為「主成分」表示該材料的含量為50質量%以上。

過濾器105藉由本體部分的主成分為鎳或銅，而具有如下的優點。首先，鎳或銅的加工性優異，因此可提高過濾器的加工精度。藉此，可進一步提昇作為捕獲對象的成分的捕獲率。另外，金屬比塑膠等其他材料剛直，因此即便自外部施加力，其尺寸或形狀亦得到維持。因此，使比貫穿孔略大的血液成分（特別是白血球）變形後穿過，並可進行高精度的分離・濃縮。

過濾器105的厚度較佳為3 μm～50 μm，更佳為5 μm～40 μm，特佳為5 μm～30 μm。當過濾器105的膜厚未滿3 μm時，存在過濾器105的強度下降，處理性變得困難的情況。相反地，若超過50 μm，則擔憂由加工時間變長所引起的生產性下降、由過度的材料消耗所引起的成本的不利或微細加工本身變得困難。

再者，過濾器105之中，鍍鈀層（於圖3及圖4中作為鍍鈀層7來表示）的厚度較佳為0.1 μm～1 μm。另外，形成於鍍鈀層的外側的鍍金層（於圖3及圖4中作為鍍金層8來表示）的厚度較佳為0.5 μm～0.8 μm。藉由將鍍鈀層設為所述範圍，可進一步防止由鍍鈀層所覆蓋的過濾器105的本體部分的金屬離子的流出（溶出）。另外，藉由將鍍金層的厚度設為所述範圍，可進一步降低由過濾器本體部分的金屬所產生的對於細胞的影響。

作為設置於過濾器105中的多個貫穿孔106的開口形狀，可例示：圓、橢圓、圓角長方形、長方形、正方形、波形等。於圖2中，表示貫穿孔106的開口形狀為圓角長方形的例子。於圖2中，表示圓角長方形的貫穿孔106沿著一方向排列的例子，但排列等並無特別限定。就可高效率地捕獲癌細胞的觀點而言，較佳為圓、圓角長方形、長方形或波形。另外，就防止過濾器105的堵塞的觀點而言，特佳為圓角長方形或長方形。

過濾器105的貫穿孔106的孔徑等對應於作為捕捉對象的稀少細胞的尺寸而設定。再者，於開口形狀為橢圓、長方形、波形等圓以外的形狀的貫穿孔106中，所謂孔徑，是指可穿過各個貫穿孔106的不變形的球的直徑的最大值。即，例如當開口形狀為長方形或圓角長方形時，貫穿孔106的孔徑成為該長方形或圓角長方形的短邊的長度。於圖2所示的過濾器105的貫穿孔106的情況下，邊L1相當於短邊，邊L2相當於長邊。

當捕捉對象的細胞為血中循環癌細胞（CTC）時，於過濾器105的入口側，過濾器105的貫穿孔106的孔徑較佳為5 μm～100 μm，更佳為5 μm～50 μm，特佳為5 μm～30 μm。此處，所謂貫穿孔106的入口側，是指血液等試樣穿過過濾器105時的流入側。另外，當捕捉對象的細胞為循環血管內皮細胞（CEC）時，於過濾器105的入口側，過濾器105的貫穿孔106的孔徑較佳為5 μm～100 μm，更佳為5 μm～50 μm，特佳為5 μm～30 μm。

另外，於貫穿孔106的剖面形狀中，只要出口側最窄部的孔徑為入口側最窄部的孔徑以上的大小，則亦可為貫穿孔中央部的孔徑超過出口側最窄部的孔徑的形狀（中央部膨脹的形狀）。

過濾器105的貫穿孔106的平均開口率較佳為5%～50%，更佳為10%～40%，特佳為10%～30%。所謂過濾器105中的貫穿孔106的開口率，如圖2所示，是指過濾器105之中，試樣液實際穿過的區域的整體的面積A1中的貫穿孔106所佔的面積的比例。如圖1所示，過濾器105的周緣部分由上部構件110及下部構件115保持，因此存在試樣液實際上不穿過周緣部分的過濾器105的貫穿孔106的情況。因此，於算出開口率時，特別規定試樣液實際穿過的區域，並算出該區域A1中的貫穿孔106所佔的比例。再者，就防止堵塞的觀點而言，平均開口率越大越佳，但若超過50%，則存在過濾器105的強度下降、或加工變得困難的情況。另外，若小於5%，則容易產生堵塞，因此存在過濾器105的稀少細胞的濃縮性能下降的情況。

於本實施形態中，將使用細胞捕捉裝置100，並使試樣液穿過過濾器105的步驟稱為過濾。藉由過濾，無法穿過貫穿孔106的稀少細胞等細胞殘存於過濾器105上。藉此，可使用過濾器105選擇性地捕捉特定的細胞。

繼而，對過濾器105的製造方法進行說明。

本實施形態的過濾器105（細胞捕捉過濾器）的製造方法包括：積層步驟，於銅基板上積層感光性樹脂組成物而形成感光性樹脂組成物層；曝光步驟，利用光化射線對感光性樹脂組成物層的規定部分進行曝光，而形成感光性樹脂組成物的硬化物；顯影步驟，藉由顯影來去除感光性樹脂組成物層中的除感光性樹脂組成物的硬化物以外的部分，而於銅基板上形成包含感光性樹脂組成物的硬化物的抗蝕劑圖案；卑金屬鍍敷步驟，對形成有抗蝕劑圖案的銅基板進行卑金屬鍍敷；溶解步驟，藉由化學溶解來去除銅基板，而獲得包含抗蝕劑圖案及卑金屬鍍敷層的結構物；剝離步驟，自結構物中去除抗蝕劑圖案，而獲得所述卑金屬鍍敷層；以及貴金屬鍍敷步驟，對剝離步驟後的卑金屬鍍敷層進行貴金屬鍍敷。

圖3的（A）～圖3的（I）是說明過濾器105的製造方法的一實施形態的步驟圖。於本實施形態中，對使用可剝離銅箔作為銅基板，並且過濾器105的本體部分將鎳作為主成分的情況進行說明。

圖3的（A）表示包含載體層1及銅箔層2的可剝離銅箔。於圖3的（B）所示的積層步驟中，於銅箔層2上積層感光性樹脂組成物，而形成感光性樹脂組成物層3。繼而，於圖3的（C）所示的曝光步驟中，透過光罩4對感光性樹脂組成物層3照射光化射線（紫外線（Ultraviolet，UV）光等），使經曝光的部分光硬化而形成感光性樹脂組成物的硬化物3a。繼而，於圖3的（D）所示的顯影步驟中，去除感光性樹脂組成物層3中的除感光性樹脂組成物的硬化物3a以外的部分3b，而形成包含感光性樹脂組成物的硬化物3a的抗蝕劑圖案。繼而，於圖3的（E）所示的卑金屬鍍敷步驟中，於形成有包含感光性樹脂組成物的硬化物3a的抗蝕劑圖案的銅箔層2上形成卑金屬鍍敷層5。繼而，如圖3的（F）所示，將可剝離銅箔的銅箔層2與載體層1剝離。繼而，於圖3的（G）所示的溶解步驟中，藉由化學溶解來去除銅箔層2。其結果，感光性樹脂組成物的硬化物3a及卑金屬鍍敷層5殘留。繼而，於圖3的（H）所示的剝離步驟中，去除包含感光性樹脂組成物的硬化物3a的抗蝕劑圖案，而獲得包含卑金屬鍍敷層5的過濾器的本體部分。於過濾器的本體部分中形成有貫穿孔6。繼而，於圖3的（G）所示的貴金屬鍍敷步驟中，於卑金屬鍍敷層5的外側形成鍍鈀層7及鍍金層8。藉此，可獲得過濾器105。

圖4的（A）～圖4的（H）是說明本實施形態的過濾器105的製造方法的其他例的步驟圖。圖4所示的製造方法除使用銅基板2'來代替圖3所示的製造方法中所使用的可剝離銅箔這一點以外，與圖4所示的過濾器105的製造方法相同。圖4所示的過濾器105的製造方法除不存在圖3的（F）所示的將可剝離銅箔的銅箔層2與載體層1剝離的步驟這一點以外，與所述實施形態相同。再者，銅基板2'比圖3所示的可剝離銅箔中的銅箔層2厚，因此於溶解步驟中，在藉由化學溶解來去除銅基板2'的步驟中，需要比所述實施形態多的化學溶解劑與時間。

繼而，更詳細地說明所述過濾器105的製造方法的各步驟。

（積層步驟） 首先，對積層步驟進行說明。當過濾器的本體部分的主成分為鎳時，基板使用銅基板。藉此，可藉由化學溶解來去除基板。因此，於後述的溶解步驟中，當去除基板時，不會對過濾器的本體部分造成損害，並可抑制過濾器的貫穿孔的變形。因此，可實現貫穿孔的高加工精度。另外，銅與感光性樹脂組成物的密接力優異，因此即便密接面積小，亦可形成抗蝕劑圖案。因此，可形成微細的貫穿孔。再者，當過濾器的本體部分的主成分為銅時，基板較佳為使用鎳基板。

作為銅基板，只要是銅或於表面上具有銅者，則並無特別限制，例如可列舉：厚度為1 μm～100 μm的銅箔、銅箔膠帶、可剝離銅箔等。就作業性的觀點而言，較佳為可剝離銅箔。藉由使用可剝離銅箔，於後述的溶解步驟中，可縮短藉由化學溶解來去除銅基板的時間。

作為感光性樹脂組成物，可使用負型及正型的任一種，較佳為負型感光性樹脂組成物。負型感光性樹脂組成物較佳為至少包含黏合劑樹脂、具有不飽和鍵的光聚合性化合物、光聚合起始劑者。再者，當使用正型的感光性樹脂組成物時，感光性樹脂組成物層之中，藉由光化射線的照射而得到曝光的部分對於顯影液的溶解性增大，因此於顯影步驟中，經曝光的部分被去除。以下，對使用負型感光性樹脂組成物的情況進行說明。

所製造的過濾器的本體部分的厚度變得比感光性樹脂組成物層小。因此，必須形成適合於作為目標的過濾器的本體部分的厚度的膜厚的感光性樹脂組成物層。例如，當將本體部分的厚度設為15 μm以下時，感光性樹脂組成物的厚度必須設為15 μm以上。

感光性樹脂組成物朝銅基板上的積層例如可藉由如下方式來進行：於去除包含支撐膜、感光性樹脂組成物及保護膜的片狀的感光性元件的保護膜後，一面對感光性元件的感光性樹脂組成物層進行加熱一面壓接於銅基板上。藉此，可獲得包含銅基板與感光性樹脂組成物層及支撐膜、且該些依次積層的積層體。

就密接性及追隨性的觀點而言，該積層作業較佳為於減壓下進行。壓接時的對於感光性樹脂組成物層及/或銅基板的加熱溫度、壓力等條件並無特別限制，但較佳為於70℃～130℃的溫度下進行，且較佳為於100 kPa～1000 kPa左右的壓力下進行壓接。再者，於感光性樹脂組成物層的壓接時，為了提昇積層性，亦可對銅基板進行預熱處理。

（曝光步驟） 繼而，對曝光步驟進行說明。對銅基板上的感光性樹脂組成物層的規定部分照射光化射線，使經曝光的部分光硬化而形成感光性樹脂組成物的硬化物。此時，當存在於感光性樹脂組成物層上的支撐膜對於光化射線具有透過性時，可透過支撐膜來照射光化射線。另一方面，當支撐膜對於光化射線具有遮光性時，於去除支撐膜後對感光性樹脂組成物層照射光化射線。

作為曝光方法，可列舉：透過被稱為工藝圖（artwork）的負型遮罩圖案或正型遮罩圖案，呈圖像狀地照射光化射線的方法（遮罩曝光法）。另外，亦可採用藉由雷射直接成像（Laser Direct Imaging，LDI）曝光法、或數位光學處理（Digital Light Processing，DLP）曝光法等直接描繪曝光法，而呈圖像狀地照射光化射線的方法。

作為光化射線的光源，可使用一般的光源，例如可列舉：碳弧燈、水銀蒸氣弧燈、高壓水銀燈、氙燈、氬氣雷射等氣體雷射、釔鋁石榴石（Yttrium Aluminium Garnet，YAG）雷射等固態雷射、半導體雷射等有效地放射紫外線、可見光等者。

作為光化射線的波長（曝光波長），較佳為設為350 nm～410 nm的範圍內，更佳為設為390 nm～410 nm的範圍內。

（顯影步驟） 繼而，對顯影步驟進行說明。於顯影步驟中，自銅基板上去除感光性樹脂組成物層中的除感光性樹脂組成物的硬化物以外的部分，藉此於銅基板上形成包含感光性樹脂組成物的硬化物的抗蝕劑圖案。當於感光性樹脂組成物層上存在支撐膜時，去除支撐膜後，進行所述感光性樹脂組成物的硬化物以外的部分的去除（顯影）。顯影方法有濕式顯影與乾式顯影，但廣泛地使用濕式顯影。

於利用濕式顯影的情況下，使用對應於感光性樹脂組成物的顯影液，並藉由一般的顯影方法來進行顯影。作為顯影方法，可列舉浸漬方式，覆液方式，噴霧方式，利用刷洗、拍擊、刮削、搖動浸漬等的方法，就提昇解析性的觀點而言，最合適的是高壓噴霧方式。亦可將兩種以上的方法加以組合來進行顯影。

作為顯影液，可列舉：鹼性水溶液、水系顯影液、有機溶劑系顯影液等。當將鹼性水溶液用作顯影液時，安全且穩定，操作性良好。作為鹼性水溶液的鹼，可使用：鋰、鈉或鉀的氫氧化物等鹼金屬氫氧化物；鋰、鈉、鉀或銨的碳酸鹽或碳酸氫鹽；磷酸鉀、磷酸鈉等鹼金屬磷酸鹽；焦磷酸鈉、焦磷酸鉀等鹼金屬焦磷酸鹽等。

作為鹼性水溶液，較佳為0.1質量%～5質量%碳酸鈉的稀薄溶液、0.1質量%～5質量%碳酸鉀的稀薄溶液、0.1質量%～5質量%氫氧化鈉的稀薄溶液、0.1質量%～5質量%四硼酸鈉的稀薄溶液等。鹼性水溶液的pH較佳為設為9～11的範圍，其溫度結合感光性樹脂組成物層的鹼顯影性來調節。於鹼性水溶液中，亦可混入表面活性劑、消泡劑、用以促進顯影的少量的有機溶劑等。

藉由顯影來去除感光性樹脂組成物的硬化物以外的部分，於銅基板上形成包含感光性樹脂組成物的硬化物的抗蝕劑圖案後，視需要進行60℃～250℃左右的加熱或0.2 J/cm² ～10 J/cm² 左右的曝光，藉此可使抗蝕劑圖案進一步硬化。

藉由所述積層步驟、曝光步驟、顯影步驟的條件，所製造的本體部分的貫穿孔的剖面變成錐狀。因此，有時需要積層步驟、曝光步驟、顯影步驟的條件的最佳化。另外，反言之，藉由所述製造方法，亦可製造具有剖面為錐狀的貫穿孔的本體部分。

（卑金屬鍍敷步驟） 對卑金屬鍍敷步驟進行說明。於顯影步驟後，在銅基板上進行卑金屬鍍敷，而形成卑金屬鍍敷層。當於銅基板上進行卑金屬鍍敷時，可進行鍍鎳。卑金屬鍍敷步驟中所形成的卑金屬鍍敷層最終成為過濾器的本體部分。

如上所述，過濾器的本體部分的材質自將鎳或銅作為主成分的金屬中選擇。

雖然是鍍敷的形態，但亦可為電鍍或無電解鍍敷的任一種。例如作為電解鍍鎳，可列舉：瓦特浴（watts bath）（硫酸鎳、氯化鎳、硼酸為主成分）、磺胺酸浴（磺胺酸鎳、硼酸為主成分）、衝擊浴（strike bath）（氯化鎳、氯化氫為主成分）等。

於電解鍍敷的情況下，銅基板變成供電層，且鍍敷析出至銅的表面上。

當藉由無電解鍍敷來形成時，較佳為利用酸或鹼等對表面進行脫脂。其後，較佳為對表面賦予觸媒，而使表面活化。作為觸媒，主要使用Pd、Au及Pt等貴金屬。

用於無電解鍍敷的鍍敷液除金屬離子（鍍敷成分）以外，可含有錯合劑及還原劑。當藉由無電解鍍敷來形成將鎳（Ni）的合金作為主成分的鍍敷層時，作為Ni的合金，例如可列舉：Ni-P、Ni-B、Ni-W、Ni-Pd及Ni-Cu等。作為Ni離子的還原劑，可使用次亞磷酸或其鹽類、亞磷酸或其鹽類、肼、氫化硼、及二甲基胺硼烷等。該些之中，較佳為使用次亞磷酸鹽的無電解鍍Ni。藉由使用次亞磷酸鹽作為還原劑，可自結晶質至非晶質為止控制Ni的結晶度。

於電鍍的情況下，鍍敷液的pH範圍較佳為4.0～6.0，於無電解鍍敷的情況下，鍍敷液的pH範圍較佳為4.0～9.0。另外，於電鍍的情況下，鍍敷液的溫度較佳為40℃～60℃，於無電解鍍敷的情況下，鍍敷液的溫度較佳為60℃～95℃。

較佳為電鍍及無電解鍍敷均進行清潔及調節。進行鍍敷的面必須是清潔的面。若於受到污染的面上進行鍍敷，則會產生剝離、變色或未析出等問題。

（溶解步驟） 繼而，對溶解步驟進行說明。於形成卑金屬鍍敷層（此處為鍍鎳層）後，對銅基板進行化學溶解來去除。藉此，可不藉由人工作業（手剝）而回收包含成為過濾器的本體部分的卑金屬鍍敷層及感光性樹脂組成物的硬化物的結構物。因此，可不產生皺褶・折斷・傷痕・捲曲等損害及微細的貫穿孔的變形，而製造過濾器的本體部分。作為溶解銅基板的化學溶解劑，可使用美格布萊特（MECBRITE）SF-5420B（美格（MEC）股份有限公司製造）、銅選擇蝕刻液-CSS（日本化學產業股份有限公司製造）等。

再者，當溶解對象的基板的材質為鎳時，作為化學溶解劑，可使用鎳選擇蝕刻液NC（日本化學產業股份有限公司製造）、美格里姆瓦（MEC REMOVER）NH-1860（MEC股份有限公司製造）等。

（剝離步驟） 繼而，對剝離步驟進行說明。於溶解步驟後，例如藉由鹼性比用於顯影的鹼性水溶液更強的水溶液來剝離抗蝕劑圖案（感光性樹脂組成物的硬化物）。作為該強鹼性的水溶液，例如較佳為使用1質量%～10質量%氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液，更佳為使用1質量%～5質量%氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液。藉由剝離抗蝕劑圖案，可僅將卑金屬鍍敷層作為過濾器的本體部分進行回收。

作為抗蝕劑圖案的剝離方式，可列舉浸漬方式、噴霧方式、利用超音波的方式等，該些方式可單獨使用，亦可併用。

（貴金屬鍍敷步驟-鍍鈀） 繼而，對貴金屬鍍敷步驟進行說明。針對藉由剝離步驟所獲得的本體部分，藉由貴金屬鍍敷來形成鍍鈀層及鍍金層。

首先，對本體部分進行鍍鈀。鍍鈀的具體的方法並無特別限定，可藉由無電解鍍鈀或電解鍍敷來進行。藉由無電解鍍鈀所形成的鍍鈀層是無電解鍍鈀用的鍍敷液中的鈀離子因還原劑的作用，作為鈀而析出至將鎳作為主成分的本體部分的表面上者。

於藉由無電解鍍鈀所形成的鍍鈀層7中，除鈀以外，有時含有磷、硼等。但是，純度為99質量%以上的鍍鈀層7較佳為藉由使用甲酸化合物作為還原劑的無電解鍍鈀來形成。藉由使用甲酸化合物，可特別容易地使高純度的鍍敷被膜更均勻地析出。純度越接近100質量%，鈀的析出形態的均勻性越優異。

鈀的純度為90質量%以上、未滿99質量%的鍍鈀層7通常可使用含有次亞磷酸、亞磷酸等含磷的化合物，或含硼的化合物作為還原劑的鍍敷液來形成。使用該些鍍敷液而分別形成鈀-磷鍍敷合金被膜或鈀-硼合金被膜。對鍍敷液中的還原劑的濃度、pH、浴溫等進行調節以使鈀的純度變成90質量%以上～未滿99質量%。具體而言，例如當使用次亞磷酸作為還原劑時，可於0.005 mol/L～0.3 mol/L、pH7.5～11.5、溫度40℃～80℃的範圍內，形成鈀的純度為90質量%以上、未滿99質量%的鍍鈀層7。

再者，亦可藉由電鍍鈀來形成鍍鈀層7。電鍍鈀只要是藉由電來將鍍敷液中的鈀離子還原成金屬鈀，並使鈀析出至鎳表面上者即可，並無特別限定。

（貴金屬鍍敷步驟-鍍金） 繼而，藉由鍍金而於鍍鈀層7的表面上形成鍍金層。鍍金可藉由無電解來進行，亦可藉由電解來進行。當藉由電解來進行，厚度不均變大，容易對過濾器的孔徑精度造成影響，因此理想的是藉由無電解來進行。

鍍金前的本體部分有時表面已氧化。因此，亦可添加進行氧化皮膜的去除的前處理步驟。氧化皮膜的去除可藉由加入有與金屬離子形成錯合物的化合物的水溶液來進行清洗。具體而言，可為加入有氰化物類、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）類、或檸檬酸類的水溶液。

其中，檸檬酸類最適合作為鍍金的前處理。具體而言，只要是檸檬酸的酐、檸檬酸的水合物、檸檬酸鹽或檸檬酸鹽的水合物即可，具體而言，可使用檸檬酸酐、檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀等。其濃度較佳為0.01 mol/L～3 mol/L，更佳為0.03 mol/L～2 mol/L，特佳為0.05 mol/L～1 mol/L的範圍。藉由將檸檬酸類的濃度設為0.01 mol/L以上，鍍金層與鍍鈀層的密接性提昇。再者，當檸檬酸類的濃度超過3 mol/L時，效果不會提昇，而且就經濟性而言不佳。朝含有檸檬酸的溶液中的浸漬可於70℃℃～95℃下進行1分鐘～20分鐘。

於可獲得發明的效果的範圍內，含有檸檬酸的溶液亦可添加鍍敷液等中所含有的還原劑、pH調整劑等緩衝劑，但還原劑、pH調整劑等理想的是少量，最佳為僅為檸檬酸的水溶液。含有檸檬酸的溶液的pH較佳為5～10，更佳為6～9。

作為pH調整劑，只要是酸或鹼，則並無特別限定，作為酸，可使用鹽酸、硫酸、硝酸等，作為鹼，可列舉氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉等鹼金屬或鹼土金屬的氫氧化物溶液。如上所述，可於不阻礙檸檬酸的效果的範圍內使用。另外，若於含有檸檬酸的溶液中，以100 ml/L的高濃度含有硝酸，則與利用僅含有檸檬酸的溶液進行處理的情況相比，改善接著性的效果下降。

作為還原劑，只要是具有還原性者，則並無特別限定，可列舉：次亞磷酸、甲醛、二甲基胺硼烷、硼氫化鈉等。

於進行所述前處理後，進行置換鍍金。就置換鍍金而言有氰化物浴與非氰化物浴，若考慮環境負荷或殘存時的細胞毒性，則理想的是非氰化物浴。作為非氰化物浴中所含有的金鹽，可例示：氯金酸鹽、亞硫酸金鹽、硫代硫酸金鹽、硫代蘋果酸金鹽。金鹽可僅使用一種，亦可將兩種以上組合使用。

作為金的供給源，特佳為亞硫酸金。作為亞硫酸金，可為亞硫酸金鈉、亞硫酸金鉀、亞硫酸金銨等。

金濃度較佳為0.1 g/L～5 g/L的範圍。若未滿0.1 g/L，則金難以析出，若超過5 g/L，則液體容易分解。

於置換鍍金浴中，可加入銨鹽或乙二胺四乙酸鹽作為金的錯合劑。作為銨鹽，可列舉氯化銨、硫酸銨，作為乙二胺四乙酸鹽，使用乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸鈉、乙二胺四乙酸鉀、乙二胺四乙酸銨。銨鹽的濃度較佳為於7×10^-3 mol/L～0.4 mol/L的範圍內使用，若銨鹽的濃度為該範圍外，則存在液體變得不穩定的傾向。乙二胺四乙酸鹽的濃度較佳為於2×10^-3 mol/L～0.2 mol/L的範圍內使用，若銨鹽的濃度為該範圍外，則存在液體變得不穩定的傾向。

為了穩定地保持鍍敷液，可加入0.1 g/L～50 g/L的亞硫酸鹽。作為亞硫酸鹽，可列舉：亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、或亞硫酸銨等。

作為pH調整劑，當要降低pH時，較佳為使用鹽酸或者硫酸。另外，當要提高pH時，較佳為使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水。pH可調整成6～7。若為該範圍外，則對液體的穩定性或鍍敷的外觀造成不良影響。

置換鍍敷較佳為於液溫30℃～80℃下使用，若為該範圍外，則對液體的穩定性或鍍敷的外觀造成不良影響。

能夠以如上方式進行置換鍍敷，但置換鍍敷難以完全地覆蓋金屬。因此，較佳為繼而進行加入有還原劑的還原型的無電解鍍金。置換鍍敷的厚度較佳為0.02 μm～0.1 μm的範圍。作為加入有還原劑的還原型的無電解鍍金，可使用公知的方法。另外，進行還原型的無電解鍍金時的條件可適宜變更。

以所述方式形成的最外層的鍍金層8較佳為包含99質量%以上的純度的金。若鍍金層7的金的純度未滿99質量%，則接觸部的細胞毒性變高。就提高可靠性的觀點而言，鍍金層8的金的純度更佳為99.5質量%以上。

（後處理步驟） 針對藉由所述步驟所製造的過濾器105，亦可添加進行表面處理的後處理步驟。具體而言，使用在主要的骨架中含有磷脂質的表面處理劑亦較佳。其具有藉由將過濾器表面加以疏水化，而防止稀少細胞及其他細胞（白血球、紅血球、血小板等）附著於過濾器105的表面上的效果。若經過後處理步驟，則於過濾器105的鍍金層8的表面上形成疏水化層。

作為用於過濾器105的表面處理的表面處理劑，例如可使用生物適合性聚合物。藉由使過濾器105浸漬於含有生物適合性聚合物的溶液中，可對過濾器105的表面進行疏水處理。

作為含有生物適合性聚合物的溶媒，可列舉脊椎動物的白蛋白。其中，理想的是血清白蛋白。血清白蛋白是於血清中大量存在的蛋白質的一種，分子量約為6萬6千。於血清中存在許多蛋白質，但血清白蛋白約佔50%～65%。

白蛋白因連結有許多胺基酸，故具有許多胺基。胺基對貴金屬（金、鉑、鈀）進行牢固的配位鍵結。尤其，金因幾乎不存在氧化皮膜，故即便不進行特別的前處理，亦與白蛋白形成牢固的鍵結。

再者，作為表面處理劑，可適宜地使用脊椎動物的血清白蛋白，但於白蛋白之中，牛血清白蛋白的價格低而較佳。另外，血清白蛋白之中，無脂肪酸（fatty acid free）的類型抑制白血球、紅血球、血小板的吸附的效果大。

另外，近年來合成有許多模仿源自生物的生物適合性聚合物的人工合成聚合物。但是，活的細胞可感知源自生物的生物適合性聚合物與人工合成聚合物的差異。因此，嚴格而言，與人工合成聚合物相比，源自生物的生物適合性聚合物抑制細胞的附著的效果更優異。

作為人工合成聚合物，可列舉矽酮、各種聚胺基甲酸酯、聚磷腈等，特別優異的是2-甲基丙烯醯氧基乙基磷醯基膽鹼（2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，簡稱：MPC）的均聚物、或含有MPC的共聚物。以下表示其結構式。

[化1]

再者，所述化學式是表示MPC聚合物者，R可應用烷基、氫、胺基、羥基烷基等。

另外，亦可使用市售的MPC聚合物。作為市售的MPC聚合物，可列舉：萊皮哲（Lipidure）-BL103、萊皮哲（Lipidure）-BL203、萊皮哲（Lipidure）-BL206、萊皮哲（Lipidure）-BL405、萊皮哲（Lipidure）-BL502、萊皮哲（Lipidure）-BL702、萊皮哲（Lipidure）-BL802、萊皮哲（Lipidure）-BL1002、萊皮哲（Lipidure）-BL1201、萊皮哲（Lipidure）-BL1301、萊皮哲（Lipidure）-CM5206（萊皮哲（Lipidure）為註冊商標，均為日油股份有限公司製造）等。

使過濾器105浸漬於對此種生物適合性聚合物進行稀釋的溶液中。含有生物適合性聚合物的溶液的濃度較佳為0.1%～5.0%的範圍。

用於稀釋的溶液較佳為水系，亦可加入磷酸等緩衝液。或者，亦可加入如EDTA或肝素般的血液的抗凝劑。

處理時間（浸漬時間）較佳為1分鐘以上、60分鐘以下，更佳為1分鐘以上、10分鐘以下。藉由進行1分鐘以上的處理，可促進生物適合高分子與過濾器105的鍍金層的表面的配位鍵結。另外，藉由將處理時間設為60分鐘以下，可防止作業時間的長期化。

藉由使用經過所述後處理步驟的過濾器105，可防止稀少細胞及其他細胞附著於過濾器105表面上，並可提高稀少細胞的捕捉效率。

如上所述，本實施形態的細胞捕捉用的過濾器105及利用該過濾器105的細胞捕捉裝置100的特徵在於：將鎳或銅作為主成分的過濾器105的本體部分（卑金屬鍍敷層5）的表面由鍍鈀層7及鍍金層8覆蓋。藉此，可抑制本體部分的金屬朝試樣液中等流出。

自先前以來，一直研究使用金屬過濾器作為細胞捕捉用的過濾器105。另外，作為過濾器105的材料，常將金屬中的廉價的卑金屬用作主成分。但是，當使用卑金屬的過濾器時，構成過濾器的金屬成分有可能溶出至試樣液中，尤其於對試樣液等添加鏈化劑的情況下變得顯著。例如，當血液中的稀少細胞為捕捉對象時，為了防止血液的凝固，有時使用將EDTA與血液混合而成的試樣液。於此情況下，EDTA作為鏈化劑發揮作用，因此離子化傾向低的卑金屬有可能作為金屬離子而溶出。

作為金屬過濾器的主成分，就成本及加工性的觀點而言，常選擇卑金屬中的鎳或銅。但是，鎳及銅的金屬離子的細胞毒性強。因此，可認為自過濾器中溶出的金屬離子會對由過濾器捕捉後的稀少細胞造成損害。

為了防止卑金屬的金屬離子溶出至試樣液中，例如考慮使用貴金屬來製造過濾器。但是，僅利用貴金屬製造過濾器於成本方面並不現實。因此，先前對自卑金屬所製造的過濾器實施鍍金。

然而，確認即便於對自卑金屬所製造的過濾器的本體部分的表面實施鍍金的情況下，亦存在卑金屬的金屬離子大量地流出（溶出）至試樣液中的情況。具體而言，可知當於過濾器的本體部分的鍍金中形成有針孔時，若存在一部分試樣液與卑金屬接觸的部位，則內部的過濾器的本體部分的金屬離子大量地溶出。可知即便於鍍金中僅設置有極小的針孔，本體部分的金屬離子亦流出（溶出）至外部。另外，確認即便於使過濾器的本體部分的表面變得均勻的情況下，亦會產生針孔。因此，可知於對過濾器的本體部分實施鍍金的步驟中，防止針孔的產生非常困難。作為防止鍍金中的針孔的形成的其他方法，亦考慮使鍍金的膜厚變大等對策，但鍍金層的形成的成本會上昇。

因此，於本實施形態的細胞捕捉用的過濾器105中，針對將鎳或銅作為主成分的過濾器105的本體部分（卑金屬鍍敷層5）的表面，首先形成鍍鈀層7，並於鍍鈀層7的外側形成有鍍金層8。如此將兩層的貴金屬層積層於本體部分的表面上，可防止本體部分露出至外部。即便於最外面的鍍金層8的形成時針孔殘留，藉由將鍍鈀層7設置於鍍金層8的內側，可防止鍍鈀層7的內側的本體部分露出至外部並與試樣液等接觸。因此，於本實施形態的細胞捕捉用的過濾器105及利用該過濾器105的細胞捕捉裝置100中，可適宜地進行稀少細胞的捕捉，並且可防止過濾器105上捕捉到的細胞因本體部分的金屬離子的流出而產生損傷。

另外，於本實施形態的細胞捕捉用的過濾器105中，藉由將鍍鈀層7的厚度設為0.1 μm～1 μm，可防止過濾器105的本體部分的金屬離子流出（溶出）至外部。

另外，當於過濾器105的鍍金層8的表面上具有藉由在主要的骨架中含有磷脂質的表面處理劑所形成的疏水化層時，可防止稀少細胞及其他細胞附著於過濾器105表面上，並可提高稀少細胞的捕捉效率。

進而，於使用本實施形態的細胞捕捉用的過濾器105的細胞捕捉方法中，藉由利用過濾器105進行過濾，而選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞。藉由利用所述實施形態中所說明的過濾器105進行過濾，可一面防止由過濾器105的本體部分的金屬離子的流出所引起的細胞的損傷等，一面選擇性地捕捉特定的細胞。

作為使用本實施形態的細胞捕捉用的過濾器105的細胞觀察方法，可列舉如下的方法：利用過濾器105進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞後，使用固定液固定捕捉到的細胞，並利用電子顯微鏡進行觀察。作為使用固定液的細胞的固定方法，可利用公知的方法。於利用所述實施形態中所說明的過濾器105進行過濾後，使用固定液來固定，並進行觀察，藉此可一面防止由過濾器105的本體部分的金屬離子的流出所引起的細胞的損傷等，一面適宜地進行特定的細胞的觀察。作為所述固定液，並無特別限制，可使用戊二醛或甲醛等醛、四氧化鋨等。

作為使用本實施形態的細胞捕捉用的過濾器105的細胞培養方法，可列舉如下的方法：利用過濾器105進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞後，利用培養液對過濾器105上捕捉到的細胞進行培養。具體而言，可使捕捉到細胞的狀態的過濾器105浸漬於培養液中，藉此進行培養。於利用所述實施形態中所說明的過濾器105進行過濾後，在過濾器105上利用培養液進行細胞的培養的情況下，可一面防止由過濾器105的本體部分的金屬離子的流出所引起的細胞的損傷等，一面適宜地進行特定的細胞的培養。

以上，根據所述實施形態來詳細地說明了本發明。但是，本發明並不限定於所述實施形態。本發明可於不脫離其主旨的範圍內進行如下的各種變形。

例如，於所述實施形態中，對形成於過濾器105的本體部分（卑金屬鍍敷層5）的外側表面上的鍍鈀層7及鍍金層8分別藉由鍍敷來形成的例子進行了說明。但是，於本發明的一形態的過濾器105中，將鎳或銅作為主成分的本體部分的外側表面只要由鈀層及金層覆蓋即可，鈀層及金層的形成方法並無特別限定。因此，亦可使用與鍍敷法不同的方法（例如濺鍍、蒸鍍、化學氣相成長法（化學氣相沈積（Chemical Vapor Deposition，CVD））等），於過濾器105的本體部分的外側積層鈀層及金層，藉此製造過濾器105。 實施例

＜過濾器的製作＞ （實施例1） 將感光性樹脂組成物（PHOTEC（註冊商標）RD-1225：厚度為25 μm，日立化成股份有限公司製造）層壓於250 mm見方的基板（MCL（註冊商標）-E679F：於載體層上具有銅箔層的可剝離銅箔，日立化成股份有限公司製造）的銅箔層上。層壓是於輥溫度為90℃、壓力為0.3 MPa、輸送機速度為2.0 m/min的條件下進行。

繼而，將玻璃遮罩靜置於所述基板的感光性樹脂組成物層上。所述玻璃遮罩具有面向同一個方向的長方形於長軸方向及短軸方向上以固定的間距排列的透光部，所述長方形的尺寸為8×30 μm，間距於長軸方向及短軸方向的任一方向上均為60 μm。繼而，於600 mmHg以下的真空下，利用照射平行光的紫外線照射裝置，自載置有所述玻璃遮罩的基板的上部照射曝光量為40 mJ/cm² 的紫外線。

繼而，使用1.0%碳酸鈉水溶液，以溫度30℃、噴壓0.1 MPa、顯影時間約30秒進行顯影，將曝光部以外的感光性樹脂組成物層去除，而於基板上形成長方形的感光性樹脂組成物的硬化物垂直地豎立的抗蝕劑圖案。

繼而，於以pH變成4.5的方式製備的鍍鎳液中，在溫度55℃下進行約20分鐘鍍敷，而形成鍍鎳層。將鍍鎳液的組成示於表1中。建浴（initial make-up of electrolytic bath）後，添加電解鍍鎳用添加劑A（製品名：NSF-H2，日本化學產業股份有限公司製造）。

[表1]

將所獲得的鍍鎳層與基板的可剝離銅箔一同剝離。繼而，藉由在溫度40℃下，於化學溶解劑（美格布萊特（MECBRITE）SF-5420B，美格（MEC）股份有限公司製造）中進行約120分鐘攪拌處理來去除銅基板（可剝離銅箔）與銅。藉此，回收包含卑金屬鍍敷層及感光性樹脂組成物的硬化物的結構物。

繼而，於溫度55℃下，在抗蝕劑剝離液（P3珀樂夫（Poleve），漢高（Henkel）公司製造）中進行約60分鐘超音波處理，藉此去除所述結構物中的感光性樹脂組成物的硬化物（抗蝕劑圖案），藉此製作相當於過濾器的本體部分的卑金屬過濾器。

其後，對卑金屬過濾器的表面進行貴金屬鍍敷處理，而形成鍍鈀層及鍍金層。貴金屬鍍敷處理的各種條件如下所述。 ・脫脂・・・・Z-200（世界金屬（World Metal）股份有限公司公司製造，商品名）60℃、1分鐘 ・水洗・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・室溫、2分鐘 ・無電解鍍鈀：鍍鈀膜厚度0.5 μm  HPS-3000（日立化成股份有限公司製造，商品名）・・・・・・・・70℃、5分鐘 ・水洗・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・室溫、2分鐘 ・置換鍍金：鍍金膜厚；0.02 μm  HGS-100（日立化成股份有限公司製造，商品名）・・・・・85℃、10分鐘 ・水洗・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・室溫、2分鐘 ・乾燥・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・85℃、30分鐘

其後，對過濾器的表面進行疏水化處理，而於表面上形成疏水化層。具體而言，作為表面處理劑，使用藉由98 wt%乙醇來將生物適合性聚合物（萊皮哲（Lipidure）（註冊商標）-CM5206，日油股份有限公司製造）稀釋至0.5 wt%而成的溶液，並使貴金屬鍍敷後的過濾器浸漬於表面處理劑內，藉此進行表面的疏水化處理。藉由以上方式，可獲得實施例1的過濾器。

（實施例2） 與所述實施例1相比，不進行貴金屬鍍敷處理中的表面的疏水化處理，除此以外，使用與實施例1相同的方法來製作實施例2的過濾器。

（實施例3） 與所述實施例1相比，將電解鍍鎳用的添加劑自添加劑A變更成添加劑B（製品名：NSF-H2，日本化學產業股份有限公司製造），且不進行表面的疏水化處理，除此以外，使用與實施例1相同的方法來製作實施例3的過濾器。

（比較例1） 與所述實施例1相比，不進行貴金屬鍍敷處理中的無電解鍍鈀步驟及表面的疏水化處理，除此以外，使用與實施例1相同的方法來製作比較例1的過濾器。

（比較例2） 與所述實施例1相比，將電解鍍鎳用的添加劑自添加劑A變更成添加劑B（製品名：NSF-H2，日本化學產業股份有限公司製造），且不進行貴金屬鍍敷處理中的無電解鍍鈀步驟及表面的疏水化處理，除此以外，使用與實施例1相同的方法來製作比較例2的過濾器。

（比較例3） 與所述實施例1相比，將電解鍍鎳用的添加劑自添加劑A變更成添加劑B（製品名：NSF-H2，日本化學產業股份有限公司製造），且不進行貴金屬鍍敷處理中的無電解鍍鈀步驟，除此以外，使用與實施例1相同的方法來製作比較例3的過濾器。

＜評價1：溶出狀況的評價＞ 藉由原子吸光測定方法來測定卑金屬朝過濾器周邊的溶出狀況。具體而言，將所述實施例1～實施例4及比較例1～比較例3的過濾器放入至六孔板中，分別各添加1 mL的漂洗緩衝液（含有0.37 g/L的EDTA的磷酸緩衝液，p7.4），並浸漬3小時。其後，利用純水將漂洗緩衝液稀釋至10 mL。其後，使用偏光塞曼式原子吸光分光光度計（型號：Z-5310，日立先端科技（Hitachi High-Technologies）股份有限公司製造）測定稀釋液中的鎳濃度。將測定結果示於表2中。

[表2]

將添加劑的種類自添加劑A變成添加劑B，藉此確認成為過濾器的本體部分的鍍鎳層的表面狀態變化。於添加劑A的情況下，形成表面平坦的鍍敷層，於添加劑B的情況下，成為具有半光澤的鍍敷表面。但是，根據所述表2的結果，可確認即便表面狀態不同，亦可獲得同等的結果。

另外，根據表2的結果，確認當於金層的表面上形成有含有生物適合性聚合物的疏水化層時，亦防止稀釋液中的鎳濃度的上昇。因此，確認當於金層的外側重複設置以提昇功能為目標的層時，亦可防止過濾器的本體部分的金屬離子流出（溶出）。

再者，將過濾器材質的主成分變更成銅（Cu），以與所述實施例1～實施例3及比較例1～比較例3相同的條件進行評價的結果，確認藉由設置鈀層，Cu的溶出得到抑制。

將原子吸光光度計測定結果記載於表3中。如表3所示，確認若存在鈀層，則鎳的溶出量少。再者，於表3中，作為參考，亦一併記載僅漂洗緩衝液（參考1）的原子吸光光度計測定結果。參考1是不使用過濾器的條件。

[表3]

＜評價2：細胞屬性＞ 使以與實施例1～實施例3及比較例1～比較例3相同的步驟製作的過濾器分別浸漬於漂洗緩衝液中來使金屬溶出，並調查其溶出液的細胞毒性。作為參照，準備不使過濾器浸漬的漂洗緩衝液（參考1）作為陰性對照組，並準備添加有Ni（1 ppm）的漂洗緩衝液（參考2）作為陽性對照組。

（試驗方法） 1. 首先，將過濾器與漂洗緩衝液各1 mL分別放入至六孔盤中，浸漬3小時後，僅取出過濾器。再者，關於參考1及參考2，不放入過濾器而進行相同的操作。 2. 於每一孔中添加大概10萬個左右的經培養的人細支氣管肺泡上皮癌細胞（human bronchiolo-alveolar carcinoma-cell）（NCI-H358）。 3. 利用5%CO2培養器（37℃）培養30分鐘。 4. 添加100 μL的0.25%胰蛋白酶EDTA（和光純藥公司製造）並剝離附著於孔底面上的細胞。 5. 3分鐘後，各添加100 μL的細胞培養液（RPMI-1640，和光純藥公司製造），並停止胰蛋白酶的反應。 6. 利用所述台盼藍進行染色後，使用細胞計算盤計算活細胞與死細胞。

（結果） 將生存率示於表3中。將生存率為50%以上的情況設為「○」，將生存率未滿50%的情況設為「×」。如表3所示，確認Ni的溶出量與細胞的生存率有關，可知Ni的溶出量越多，生存率越低。另一方面，確認當使用含有鈀層的過濾器時，細胞的生存率高。

＜評價3：培養可能性＞ 若可於過濾器上對經濃縮的細胞進行培養，則可期待將來朝各個方面拓展，因此調查培養的可能性。

一面使以與實施例1～實施例3及比較例1～比較例3相同的步驟製作的過濾器分別浸漬於培養液中，一面對細胞進行培養。

（試驗方法） 1.利用細胞追蹤綠（Cell Tracker Green）對經培養的人肺胞基底上皮腺癌細胞A549進行染色，並以細胞數變成5×10⁴ 個/mL的方式使用細胞培養液（RPMI-1640，和光純藥公司製造）進行稀釋調節。 2.將以與所述實施例1～實施例3及比較例1～比較例3相同的步驟製作的過濾器與所述細胞溶液各2 mL分別放入至六孔盤中，並利用5%CO2培養器於37℃下培養2日。 3.使用倒立顯微鏡及螢光顯微鏡（Axio Imager 2，蔡司（Zeiss）公司製造）觀察盤中所殘存的細胞。取得觀察視野的圖像，並測定過濾器上捕捉到的癌細胞的數量。

（結果） 將能否培養示於表3中。如表3所示，確認於具有鈀層的過濾器上，可進行細胞的培養。

1‧‧‧MCL
2‧‧‧銅箔層
2'‧‧‧銅基板
3‧‧‧感光性樹脂組成物層
3a‧‧‧感光性樹脂組成物的硬化物
3b‧‧‧感光性樹脂組成物的硬化物3a以外的部分
4‧‧‧光罩
5‧‧‧卑金屬鍍敷層（本體部分）
6‧‧‧貫穿孔
7‧‧‧鍍鈀層
8‧‧‧鍍金層
100‧‧‧細胞捕捉裝置
105‧‧‧過濾器
106‧‧‧貫穿孔
110‧‧‧上部構件
115‧‧‧下部構件
120‧‧‧框體
125‧‧‧流入管
130‧‧‧流入口
135‧‧‧流出管
140‧‧‧流出口
P‧‧‧泵
L1、L2‧‧‧邊
A1‧‧‧面積

圖1是表示實施形態的細胞捕捉裝置的概略構成的圖。 圖2是示意性地表示實施形態的過濾器的圖。 圖3是說明實施形態的過濾器的製造方法的例子的步驟圖。 圖4是說明實施形態的過濾器的製造方法的其他例的步驟圖。

1‧‧‧MCL

2‧‧‧銅箔層

3‧‧‧感光性樹脂組成物層

3a‧‧‧感光性樹脂組成物的硬化物

3b‧‧‧感光性樹脂組成物的硬化物3a以外的部分

4‧‧‧光罩

5‧‧‧卑金屬鍍敷層(本體部分)

6‧‧‧貫穿孔

7‧‧‧鍍鈀層

8‧‧‧鍍金層

105‧‧‧過濾器

Claims (7)

1. 一種細胞捕捉過濾器，其包括： 片狀的本體部分，鎳或銅為主成分、且於厚度方向上形成有多個貫穿孔； 鈀層，鈀為主成分、且覆蓋所述本體部分的表面；以及 金層，金為主成分、且覆蓋所述鈀層的表面。
2. 如申請專利範圍第1項所述的細胞捕捉過濾器，其中所述鈀層的膜厚為0.1 μm～1 μm。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的細胞捕捉過濾器，其更包括藉由在骨架的一部分中具有磷脂質的表面處理劑而形成於所述金層的表面上的疏水化層。
4. 一種細胞捕捉裝置，其包括： 框體，具有用於朝內部導入試樣液的導入流路、及用於朝外部排出所述試樣液的排出流路；以及 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的細胞捕捉過濾器，以所述試樣通過所述貫穿孔的方式設置於所述導入流路與所述排出流路之間的所述框體的內部的流路上。
5. 一種細胞捕捉方法，其利用如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的細胞捕捉過濾器進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞。
6. 一種細胞觀察方法，其利用如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的細胞捕捉過濾器進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞，使用固定液固定所述細胞捕捉過濾器上捕捉到的所述特定的細胞後，利用電子顯微鏡進行觀察。
7. 一種細胞培養方法，其利用如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的細胞捕捉過濾器進行過濾，藉此選擇性地捕捉試樣液中所含有的特定的細胞，並利用培養液對所述細胞捕捉過濾器上捕捉到的所述特定的細胞進行培養。