JP2016032469A - 血中希少細胞捕獲方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血中希少細胞捕獲方法は、血中希少細胞を血液中から取り出す血中希少細胞捕獲方法であって、フィルターによる血液フィルトレーションの前に哺乳動物の血清或いは血漿を含む水溶液に前記フィルターを浸漬する工程を含むことを特徴とする。
【選択図】なし
Description
また、図3(B)は銅板2’へのフォトレジスト3のラミネートする工程を示している。また、図3(C)はフォトマスク4を重ねてのフォトレジスト露光を示している。また、図3(D)は未露光部3bのフォトレジストの現像除去を示している。また、図3(E)はフォトレジストの露光部3aで覆われていない部分への電解めっきによりめっき層を形成する工程を示している。また、図3(F)は薬液による化学的溶解(ケミカルエッチング)によって銅板2’を除去し、露光部3a及びめっき層5により形成される自立膜を取り出す工程を示している。また、図3(G)は自立膜内に残ったフォトレジストによる露光部3aを除去し、めっき層5に対して貫通孔6を形成する工程を示している。また、図3(H)は無電解金めっきを行い、フィルター表面に金めっき層7を形成する工程を示している。
感光性樹脂組成物(PHOTEC RD−1225:厚さ25μm、日立化成株式会社製)を250mm角の基板(MCL−E679F:MCLの表面にピーラブル銅箔を貼り合わせた基板、日立化成株式会社製)の片面にラミネートした。ラミネート条件はロール温度90℃、圧力0.3MPa、コンベア速度2.0m/分で行った。
電気Niめっきの変わりに電気パラジウムめっきを用いた以外は実施例1と同様に表面に金めっきフィルターを作製した。電気パラジウムめっき液はパラディックスLF−5(日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社:商品名)を用いた。めっき温度は50℃、電流密度1A/dm2の条件でめっきを行い、約4.2分/μmの条件で約20μmとなるように電気めっきを行った以外はフィルター1と同様の条件でめっきを行った。
MCLのピーラブル銅箔の代わりにピーラブルニッケル箔を用いた(電気めっき後はニッケル箔を除去)。さらに電気Niめっきの変わりに電気銅めっきを用いた以外は実施例1と同様に表面に金めっきフィルターを作製した。電気銅めっき液はミクロファブCu200(日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社:商品名)を用いた。めっき温度は25℃、電流密度3A/dm2の条件でめっきを行い、約1.5分/μmの条件で約20μmとなるように電気めっきを行った以外はフィルター1と同様の条件でめっきを行った。
金めっきを行わなかったこと以外はフィルター1と同様にフィルターを作製した。
2段階の金めっきの代わりに1段階の無電解パラジウムめっきを行った以外はフィルター1と同様にフィルターを作製した。無電解パラジウムめっき液にはパラデックスストライク3(日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社製:商品名)を用いた。パラジウムの厚みは0.1μmであった。
2段階の金めっきの代わりに1段階の無電解白金めっきを行った以外はフィルター1と同様にフィルターを作製した。無電解白金めっき液にはレクトレスPt100(日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社製:商品名)を用いた。白金の厚みは0.1μmであった。
(非小細胞癌細胞株の調整)
非小細胞癌細胞株であるNCI−H358細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI−1640培地にて、37℃、5%CO2条件下にて静置培養した。トリプシン処理により培養皿から細胞を剥離させて回収し、リン酸緩衝液(Phosphate buffered saline、PBS)を用いて洗浄した後に、10μM Cell Tracker Red CMTPX(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)にて37℃、30分間静置させることで、NCI−H358細胞を染色した。その後、PBSにて洗浄し、トリプシン処理にて37℃にて3分間静置させることで、細胞塊を解離させた。その後、培地にてトリプシン処理を停止させ、PBSにて洗浄後、2mM EDTA及び0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS(以下2mM EDTA−0.5% BSA−PBSという。)中に懸濁した。なお、PBSはリン酸緩衝生理食塩水であり和光純薬工業製製品コード166−23555を用いた。BSAはSIGMA-ALDRICH社製(Product Name:Albumin from bovine serum-Lyophilized powder, Bio Reagent for cell culture)のものを用いた。また、EDTAは2Na(エチレンジアミン-N,N,N’,,N’−4酢酸二ナトリウム塩二水和物)(和光純薬工業製製品コード345−01865)を用いた。
(実施例1)
フィルター1のフィルターをカートリッジにセットしたCTC回収装置:CT6000(日立化成製商品名)を用いて実験を行った。CTC回収装置は血液サンプル又は試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。このリザーバーに、血液サンプル又は試薬を順次投入していくことで、CTCの捕捉、染色、洗浄などの操作を連続的に容易に行えるようにした。
フィルター1で作製したフィルターの代わりにフィルター2で作製したフィルターを用いた以外は実施例1と同様の条件で実験を行った。
フィルター1で作製したフィルターの代わりにフィルター3で作製したフィルターを用いた以外は実施例1と同様の条件で実験を行った。
フィルター1で作製したフィルターの代わりにフィルター4で作製したフィルターを用いた以外は実施例1と同様の条件で実験を行った。
フィルター1で作製したフィルターの代わりにフィルター5で作製したフィルターを用いた以外は実施例1と同様の条件で実験を行った。
フィルター1で作製したフィルターの代わりにフィルター6で作製したフィルターを用いた以外は実施例1と同様の条件で実験を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
まず、リザーバーに、2mM EDTA−10.0% FBS(牛胎児血清)−PBS(Gibco製PBSpH7.4) 1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに2mM EDTA−PBS(Gibco製PBSpH7.4)を導入して細胞の洗浄を行った以外は実施例1と同様の方法で実験を行った。
まず、リザーバーに、洗浄液1mL(以下洗浄液)を導入し、フィルター上を満たし、10分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速200μL/分で送液を開始した。その後、血液3mLを投入した。約5分後、リザーバーに9mLの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
各実施例の実験条件を表2に示す。また、評価結果を表3に示す。実施例1に示すように、金めっきフィルター上にFBS10%の事前処理を行った後に洗浄すると、がん細胞の回収率が高く、白血球の残りも少ない。
Claims (19)
- 血中希少細胞を血液中から取り出す血中希少細胞捕獲方法であって、フィルターによる血液フィルトレーションの前に哺乳動物の血清或いは血漿を含む水溶液に前記フィルターを浸漬する工程を含むことを特徴とする血中希少細胞捕獲方法。
- 血中希少細胞を血液中から取り出す血中希少細胞捕獲方法であって、フィルターによる血液フィルトレーションの後に哺乳動物の血清或いは血漿を含む水溶液で前記血液の血球細胞を洗浄する工程を含むことを特徴とする血中希少細胞捕獲方法。
- 哺乳動物の血清或いは血漿が、ウシ、ウマ、ヒト由来であることを特徴とする請求項1又は2に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 哺乳動物の血清がウシ胎児血清或いは血漿であることを特徴とする請求項1又は2に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターの表面が金又は白金又はパラジウム、或いはそれらの合金であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターがニッケルを主成分とし、その表面に金又は白金又はパラジウム、或いはそれらの合金がめっきされていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターが銅を主成分とし、その表面に金又は白金又はパラジウム、或いはそれらの合金がめっきされていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターがパラジウムを主成分とし、その表面に金又は白金、或いはそれらの合金がめっきされていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターの最外層が金めっきであることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターの最外層が厚さ0.05μm〜1μmの貴金属めっきであることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記血中希少細胞ががん細胞であることを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記血液フィルトレーションの前に、前記哺乳動物の血清或いは血漿を含む水溶液に前記フィルターを1分以上浸漬する工程を少なくとも含むことを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記哺乳動物の血清或いは血漿の水溶液の濃度が1%〜50%の範囲であることを特徴とする請求項1〜12のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記哺乳動物の血清或いは血漿の水溶液がリン酸緩衝液を主成分とすることを特徴とする請求項1〜13のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記哺乳動物の血清或いは血漿の水溶液が抗凝固剤を含むことを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記抗凝固剤がEDTA、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウムのいずれかであることを特徴とする請求項15に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターの貫通孔の開口形状が円、楕円、角丸長方形、長方形、正方形のいずれかである請求項1〜16のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターの貫通孔の開口形状が長方形及び角丸長方形の少なくとも一つ以上の形状を含み、その短辺の長さが5μm〜15μmであることを特徴とする請求項1〜17のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
- 前記フィルターの膜厚が3μm〜50μmであることを特徴とする請求項1〜18のいずれか一項に記載の血中希少細胞捕獲方法。
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