JP7036670B2 - 血液中の稀少細胞検査、該検査ための血液処理方法及び採血管 - Google Patents

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Description

本開示は、血液中の稀少細胞検査、並びに、該検査ための血液処理方法及び採血管に関する。
全血は、医療における診断分析のために最も頻繁に収集される試料の１つである。
採血して未処理の全血は、時間が経過すると、赤血球、白血球、血小板及び血漿成分の凝固、代謝、分解などが起こる。よって、全血を使用する検査や分析は採取後速やかに行うことが望ましいが、現実的には困難な場合が多く、輸送や保存が必要となる。そのため、採取した血液に抗凝固剤などを加えることによって血液を安定に保存する手段がとられている。抗凝固剤には様々なタイプのものがある。検査に影響を与えないように、採血した血液の処理方法及び採血に使用する採血管の種類は、検査目的に応じて分類されている。
例えば、採血管には、大きく分けて抗凝固剤が入っていないタイプ（プレーンタイプ）と、凝固剤入りのタイプに分類される。プレーンタイプの採血管は、生化学・内分泌・感染症・自己抗体・腫瘍マーカー検査などに使用される。一方、抗凝固剤入りの採血管の抗凝固剤は、複数種類あり、検査目的に適した抗凝固剤が入った採血管が使用される。
ＥＤＴＡ入り採血管は、血球計数や血液塗抹標本等の血液学的検査に使用される。
クエン酸ナトリウム又はＣＴＡＤ入り採血管は、凝固系検査に使用される。ＣＴＡＤとは、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモールの組み合わせの薬剤をいう。
フッ化ナトリウム（ＮａＦ）入り採血管は、血糖検査に使用される。
ヘパリン入り採血管は、電解質、血液ｐＨ、染色体分析、リンパ球培養等の検査に使用される。
そして、血液中の稀少細胞の検査のための採血管としては、ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ－２Ｋ又はＥＤＴＡ－３Ｋ）入りの採血管が市販されている。
血液の固形成分は、主に赤血球、白血球、血小板であるが、血液中には稀少細胞とよばれる細胞が存在することがある。ヒトの末梢血液中の固形成分のうち、赤血球はミトコンドリア、リボゾーム、ゴルジ体、小胞体のない無核の細胞で存在している。また全血を希釈して塩化アンモニウム添加すると赤血球は溶血させることができる。白血球は核をもち、様々なケモカインやインターフェロンなどのタンパク質に応答する。血小板は無核の細胞であり、巨核球の細胞質断片されたものである。血小板はＡＤＰによって活性化される。このように全血中の成分は骨格や中身や構造が大きく異なり、各成分において異なる特徴的な反応が生じ、複雑な挙動を示す。稀少細胞としては、血中循環腫瘍細胞／Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ（ＣＴＣ）や免疫細胞などが挙げられる。稀少細胞は、医学的に重要な細胞であるとされている。ＣＴＣは、原発腫瘍組織又は転移腫瘍組織から遊離して血流に沿って循環するがん細胞（腫瘍細胞）である。ＣＴＣが、この血流に沿って循環することによりその他の臓器等に運ばれることによって転移を起こすといわれている。このため、血液中のＣＴＣは、転移性のがんの治療効果の判定や予後予測の因子としての有用であると認められていることから、ＣＴＣの解析が積極的に行われている。
特許文献１は、全血にがん細胞を混合して常温で４８時間保存したのちにがん細胞を検出するという実験系において、検出の効率を向上するために、凝固剤としてＥＤＴＡ又はクエン酸塩を使用することを開示する。同文献は、また、クエン酸塩を含む血液の安定化剤としてＣＰＤＡ（クエン酸塩、リン酸塩、グルコース、アデニン）が使用できることを開示する。さらに、同文献は、ＥＤＴＡ、クエン酸塩又はＣＰＤＡに加え、Ｓｉｖｅｌｅｓｔａｔ（好中球エラスターゼ阻害剤）、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商標）ＳＣ（セリンプロテアーゼ阻害剤）、並びに、グルタチオン、ＳｋＱ１、ＭｉｔｏＱなどの抗酸化剤も検出の効率を向上することを開示する。
特許文献２及び３は、ＣＴＣ検査に用いる血液を長期保存する場合にはホルムアルデヒド固定をすることを提案する。
特表２０１７－５０７３２８号公報 ＷＯ２０１３／１６８６７ 特開２００５－５０１２３６号公報
１０ｍｌの全血には、赤血球なら数百億個、白血球なら数千万個、血小板なら数十億個含まれる。一方、ＣＴＣは、１０ｍｌの全血に対して数個～数千個程度である。全血を保存したのちに稀少細胞を検出する場合、希少細胞のみならず、赤血球、白血球、血小板の状態も検査結果に影響を与えうる。例えば、１０ｍｌの血液のうち０．１体積％（容積で１０μＬ）で凝集が発生しただけで、たとえば血漿、約３～６千万個の赤血球、約３～１０万個の白血球、約百～３千万個の血小板及び血漿成分が凝集に関与する。全血を使用した稀少細胞の検査においてこれらの凝集物は処理性能を低下させうる。
とりわけ、ＣＴＣ検査の場合、たとえば、1～２日保存したＥＤＴＡ２Ｋの抗凝固剤が入った全血を使用すると、ＣＴＣの検出結果や回収率に影響がある。
例えば、抗原を利用した分離方法や密度勾配法を利用した分離では、赤血球や白血球が、保存時に経時的に変化して密度が変化することがある。また、一部の免疫細胞が保存時に経時的に死細胞となり内容物の漏出や核酸の凝集などが問題になる。サイズや粘弾性を利用した分離においては、血液が保存時に経時的に変化した結果、例えば新鮮血に比べ、同流量での処理において分離部の差圧が上昇して、変形能の高いがん細胞や小型のがん細胞など一部のＣＴＣのフィルターの通り抜け易さ（狭い流路の通過し易さ）などが変化する。
また血液だけでなく、ＣＴＣそれ自体も保存時に経時的に状態が変化し、細胞死やＤＮＡやＲＮＡの分解によって、新鮮血でできていた検査が保存によって検査できない場合がある。ＣＴＣをホルムアルデヒドで固定化する方法もあるが分離に影響が出たり、検査用途が限定されたりする。
一方で、採血した病院等以外の施設（例えば、検査センター）での検査をする場合には採血した血液の保存が必要となる。
そこで、本開示は、一態様において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法を提供する。
本開示は、一態様において、採血した血液が、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤と混合されることを含む、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法に関する。
本開示は、その他の態様において、血液中の稀少細胞検査する方法であって、検査対象血液試料として本開示に係る処理方法で処理した血液を使用することを含む、稀少細胞検査方法に関する。
本開示は、その他の態様において、血液中の希少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を含む採血管に関する。
本開示は、その他の態様において、採血した血液がｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤と混合されること、あるいは、採血した血液がｃＡＭＰ及びその類似化合物と混合されることを含む、採血血液の処理方法に関する。
本開示は、その他の態様において、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤を含む、あるいは、ｃＡＭＰ又はその類似化合物を含む、採血管に関する。
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、採血後に保存した血液を使用する稀少細胞検査をより効果的にすることができる。
また本開示によれば、一又は複数の実施形態において、細胞の固定化をしても固定化しなくても採血後に保存した血液を使用する稀少細胞検査をより効果的にすることができる。
図１は、採血した血液と実施例９－１８又は比較例８の添加剤とを混合して４℃７２時間保存して調製した試料のＣＴＣ検査の結果（捕捉率）の一例を示すグラフである。 図２は、本開示に係る採血処理方法で調製された試料から回収されたＣＴＣのＤＮＡ－ＦＩＳＨ（左図）及びＲＮＡ－ＦＩＳＨ（右図）の結果の一例である。
本開示は、稀少細胞検査用途の血液を保存する際、該血液にｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を混合させると、検査が効果的になるという知見に基づく。
［稀少細胞］
本開示において、血液中又は血液検体中に含まれうる「稀少細胞」とは、ヒト又はヒト以外の動物の血液中に含まれ得る細胞成分（赤血球、白血球、及び血小板）以外の細胞をいい、腫瘍細胞及び／又はがん細胞を含む。一般に血液中に循環する腫瘍細胞やがん細胞をＣＴＣという。血液中の稀少細胞数としては、検体にもよるが血液１０ｍｌ中に数個から数十個、多くて数百～千個含まれている場合がある。「稀少細胞」は、一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、幹細胞及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である。
［稀少細胞検査］
本開示において稀少細胞検査とは、稀少細胞の検出、稀少細胞の分離、稀少細胞の濃縮、稀少細胞の測定、稀少細胞の観察、稀少細胞の回収、稀少細胞の培養、又は稀少細胞中のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の検査を含みうる。
稀少細胞検査の方法は特に限定されず、フィルター分離などサイズや粘弾性を用いる方法、流路や流体力学的な分離などのサイズ差や粘弾性を用いる方法、遠心分離方法、抗体などの免疫学的手法を用いる方法、染色を用いる方法、顕微鏡を用いる方法、又はこれらの組み合わせを含みうる。
稀少細胞検査の効率化は、検査精度の向上、検出感度の向上、分離精度の向上、濃縮度の向上、測定精度の向上、観察しやすさの向上、回収率の向上、又は、稀少細胞の生存率の向上等が挙げられる。
本開示において、稀少細胞検査は、細胞をホルマリン等で固定化する方法であってもよく、細胞を固定化しない方法であってもよい。稀少細胞を生きたまま観察、測定、培養する観点からは、細胞を固定化しない方法であることが好ましい。
［血液］
本開示において、血液は、ヒトの血液でもよく、あるいは、ヒト以外の動物の血液であってもよい。本開示に係る処理方法の対象が白血球成分を含有する血液の場合、白血球及び／又は他の有核細胞を安定化による効果が顕著に現れうる。
［ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤］
本開示において、ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸、サイクリックＡＭＰ）又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤としては、ｃＡＭＰ及びその類似化合物、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するもの、並びに、細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものが挙げられる。
［ｃＡＭＰ及びその類似化合物］
ｃＡＭＰは、環状ヌクレオチドの１つであり、細胞内情報伝達物質（セカンドメッセンジャー）として知られている。例えばｃＡＭＰ依存性タンパクキナーゼ（ＰＫＡ）を活性化し、有核細胞の特異的遺伝子発現などの様々な細胞応答を調節していることが知られている。ｃＡＭＰは、細胞によって様々な効果や機能を示す。
本開示においてｃＡＭＰの類似化合物には、ｃＡＭＰアナログ、ｃＧＭＰ（環状グアノシン一リン酸、サイクリックＧＭＰ）、及びｃＧＭＰアナログが含まれる。
本開示において、ｃＡＭＰアナログとは、ｃＡＭＰと類似する構造を持ち、細胞内で分解されてそれぞれｃＡＭＰを供給するもの、又は、そのままでｃＡＭＰと同様な機能を有するものをいう。
ｃＧＭＰは、ｃＡＭＰと同様に、環状ヌクレオチドの１つであり、セカンドメッセンジャーとして知られている。
本開示において、ｃＧＭＰアナログとは、ｃＧＭＰと類似する構造を持ち、細胞内で分解されてそれぞれｃＧＭＰを供給するもの、又は、そのままでｃＧＭＰと同様な機能を有するものをいう。
ｃＡＭＰアナログ及びｃＧＭＰアナログとしては、細胞内に導入可能な物質や細胞内に取り込まれ易い物質、又は細胞膜を透過しやすいものがより好ましい。
ｃＡＭＰアナログとしては、８－ブロモ－ｃＡＭＰナトリウム塩（８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号７６９３９－４６－３）、６－モノブチリルｃＡＭＰ（６ＭＢ－ｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号７０２５３－６７－７）、ジブチリルｃＡＭＰナトリウム（ＤＢｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号１６９８０－８９－５）、８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰナトリウム（８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号９３８８２－１２－３）、８－（４－クロロフェニルチオ）－２′－Ｏ－メチルｃＡＭＰナトリウム塩（８－ＣＰＴ－２’－Ｏ－Ｍｅ－ｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号５１０７７４－５０－２）、２－クロロ－８メチルアミノｃＡＭＰ（２－Ｃｌ－８－ＭＡ－ｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号９６９９０－１６－８）、Ｎ－［６－（Ｎ－メチルアントラニロイルアミノ）ヘキシル］－ｃＡＭＰ （６－ＭＡＨ－ｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号７２３３１３－２７－７）、８－（６－アミノヘキシル）アミノ-ｃＡＭＰ：８－ＡＨＡ－ｃＡＭＰ（ＣＡＳ番号３９８２４－３０－１）が挙げられる。
ｃＧＭＰアナログとしては、８－ブロモ－ｃＧＭＰ（８－Ｂｒ－ＧＭＰ、ＣＡＳ番号５１１１６－０１－９）、ジブチリル－ｃＧＭＰ（ＢＤｃＡＭＰ、ＣＡＳ番号５１１１６－００－８）、８－（４－クロロフェニルチオ）グアノシン３′，５′－（環状）一リン酸ナトリウム（８－ｐＣＰＴ－ｃＧＭＰ、ＣＡＳ番号５１２３９－２６－０）などが挙げられる。
ｃＡＭＰ及びその類似化合物の中でも、細胞膜の透過性の高さ及び稀少細胞検査の効率化の点から、ｃＡＭＰアナログ及びｃＧＭＰアナログが好ましく、ｃＡＭＰアナログがより好ましい。
ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤としてｃＡＭＰ及びその類似化合物を使用する場合、とりわけ、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを使用する場合は、必要に応じてｃＡＭＰ及びその類似化合物細胞内へ導入のするための試薬を併用してもよい。例えば、リポソーム等の脂質に包んだり、界面活性剤によって細胞膜に孔を開けたり、溶剤を使ったり、エンドサイトーシスを促す試薬を利用したり等の方法により、細胞膜を通過しやすくすることができる。これらの試薬は、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤に含めてもよく、あるいは、前記剤とは別に血液と混合してもよい。
ｃＡＭＰ又はその類似化合物を血液との混合に用いる場合、その最終濃度は、例えば、１ｐＭ～１Ｍであって、１ｎＭ～１００ｍＭが好ましい。
［細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するもの］
ｃＡＭＰは、細胞内において、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）という酵素により分解される。ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）を使用することによって、ｃＡＭＰが分解されず細胞内に蓄積され、細胞内のｃＡＭＰを上昇しやすくできる。したがって、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものとしては、一又は複数の実施形態において、ホスホジエステラーゼ阻害剤が挙げられる。
ホスホジエステラーゼ阻害剤としては、キサンチン類（キサンチン誘導体類）、又は血液成分の血小板のＰＤＥ３、ＰＤＥ５に対する阻害剤、免疫細胞のＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８に対する阻害剤が挙げられる。
ホスホジエステラーゼ阻害剤としては、稀少細胞検査の効率化の点から、血小板及び／又は免疫細胞のホスホジエステラーゼを阻害できるものが好ましい。例えば、血小板のＰＤＥ３、ＰＤＥ５に対する阻害剤や、免疫細胞のＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８に対する阻害剤が挙げられる。ホスホジエステラーゼを阻害するものを添加する場合、添加剤として好ましくは、免疫細胞のホスホジエステラーゼを阻害するものを少なくとも含む。より好ましくは、免疫細胞のホスホジエステラーゼを特異的に阻害するものを少なくとも含む。より好ましくは、血小板のホスホジエステラーゼを阻害するものと免疫細胞のホスホジエステラーゼを特異的に阻害するものを含むものが望ましい。
キサンチン類のホスホジエステラーゼ阻害剤としては、アミノフィリン（ＣＡＳ番号３１７－３４－０）、カフェイン（ＣＡＳ番号５８－０８－２）、キサンチン（ＣＡＳ番号６９－８９－６）、テオフィリン（ＣＡＳ番号５８－５５－９）、コリンテオフィリン（ＣＡＳ番号４４９９－４０－５）テオフィリン－７－酢酸（ＣＡＳ番号６５２－３７－９）、８－ブロモテオフィリン（ＣＡＳ番号１０３８１－７５－６）、テオブロミン（ＣＡＳ番号８３－６７－０）、ジプロフィリン（ＣＡＳ４７９－１８－５）、エトフィリン（ＣＡＳ番号５１９－３７－９）など特異性が低いＰＤＥ阻害剤が挙げられる。
ＰＤＥ３に特異的な阻害剤としては、シロスタゾール（ＣＡＳ番号７３９６３－７２－１）、ミルリノン（ＣＡＳ番号７８４１５－７２－２）、アムリノン（ＣＡＳ番号６０７１９－８４－８）、ピモベンダン（ＣＡＳ番号７４１５０－２７－９）、アナグレリド塩酸塩水和物（ＣＡＳ番号８２３１７８－４３－４）、Ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ（ＣＡＳ番号６８５５０－７５－４）、Ｅｎｏｘｉｍｏｎｅ（ＣＡＳ番号７７６７１－３１－９）、Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ番号７８４１６－８１－６）が挙げられる。
ＰＤＥ５に特異的な阻害剤としては、ザプリナスト（ＣＡＳ番号３７７６２－０６－４）、シルデナフィル（ＣＡＳ番号１７１５９９－８３－０）、バルデナフィル塩酸塩（ＣＡＳ番号２２４７８９－１５－５）、タダラフィル（ＣＡＳ番号１７１５９６－２９－５）、ＭＹ－５４４５（ＣＡＳ番号７８３５１－７５－４）、アバナフィル（ＣＡＳ番号３３０７８４－４７－９）ウデナフィル（ＣＡＳ番号２６８２０３－９３－６）、ギザデナフィル（ＣＡＳ番号３３４８２７－９８－４）、ＳＩ－４６１（ＣＡＳ番号２２７６１９－９６－７）、ジピリダモール（ＣＡＳ番号５８－３２－２）、ＰＤＥ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ４２（ＣＡＳ番号９３６４４９－２８－４）が挙げられる。
ＰＤＥ４に特異的な阻害剤としては、ロリプラム（ＣＡＳ番号６１４１３－５４－５）、ロフルミラスト（ＣＡＳ番号１６２４０１－３２－３）、シロミラスト（ＣＡＳ番号１５３２５９－６５－５）、Ｒｏ－２０－１７２４（ＣＡＳ番号２９９２５－１７－５）、ＯＰＣ６５３５（ＣＡＳ番号１４５７３９－５６－６）、Ｅｔａｚｏｌａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ番号３５８３８－５８－５）、Ｄｅｎｂｕｆｙｌｌｉｎｅ（ＣＡＳ番号５７０７６－７１－８）ドキソフィリン（ＣＡＳ番号６９９７５－８６－６）、アロフィリン（ＣＡＳ番号１３６１４５－０７－８）、アプレミラスト（ＣＡＳ番号６０８１４１－４１－９）、ＢＡＹ １９－８００４（ＣＡＳ番号３２９３０６－２７－６）、Ｌ ４５４５６０（ＣＡＳ番号３４６６２９－３０－９）が挙げられる。
ＰＤＥ７又は８に特異的な阻害剤としては、イミダゾピリジン誘導体、ジヒドロプリン誘導体（特許文献２）、ピロール誘導体、ベンゾチオピラノイミダゾロン誘導体、複素環化合物、キナゾリンおよびピリドピリミジン誘導体、スピロ三環系誘導体、チアゾールおよびオキサヂアゾール誘導体、スルホンアミド誘導体、ヘテロビアリルスルホンアミド誘導体、ジヒドロイソキノリン誘導体、グアニン誘導体、ベンゾチアジアジン、ベンゾチエノチアジアジン誘導体があげられる。具体的には、ＢＲＬ ５０４８１（ＣＡＳ４３３６９５－３６－４）、ＡＳＢ－１６１６５ （ＣＡＳ番号８７３５４１－４５－８）、ジピリダモール（ＣＡＳ番号５８－３２－２）が挙げられる。ジピリダモールはＰＤＥ５も阻害するため、血小板の凝集の抑制にも効果を発揮する。
上記ホスホジエステラーゼ阻害剤のうち、ジピリダモール及びテオフィリンを含む組成物としては、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモールの組み合わせ（ＣＴＡＤ）が挙げられる。なお、ＣＴＡＤ入りの採血管は市販されているが、その用途は凝固系検査であって、稀少細胞検査用ではない。
細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものを血液との混合に用いる場合、その最終濃度は、例えば、ジピリダモールの場合、例えば１ｐＭ～１００ｍＭであって、１ｎＭ～１ｍＭが好ましい。テオフィリンの場合、例えば１ｐＭ～１Ｍであって、１μＭ～１００ｍＭが好ましい。
［細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するもの］
ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰは、細胞内において、アデニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼを介してＡＴＰ及びＧＴＰから合成される。したがって、細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものとしては、ＡＴＰからｃＡＭＰを増加させるために必要な受容体（例えばアデノシン受容体やプロスタサイクリン受容体）を介して、又はＡＤＰ受容体を阻害して、アデニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼを活性化、維持し、細胞内でｃＡＭＰの合成を促進させるものを用いてもよい。このような形態の細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものとしては、血小板や免疫細胞でｃＡＭＰを増加させる活性化剤が望ましく、例えば、アデノシン（ＣＡＳ番号５８－６１－７）、２－クロロアデノシン（ＣＡＳ番号１４６－７７－０）、ベラプロストナトリウム（ＣＡＳ番号８８４７５－６９－８）、プロスタサイクリン（ＣＡＳ番号３５１２１－７８－９）、チクロピジン（ＣＡＳ番号５５１４２－８５－３）、クロピドグレル（ＣＡＳ番号１１３６６５－８４－２）、フォルスコリン（ＣＡＳ番号６６５７５－２９－９）、ＮＫＨ ４４７（ＣＡＳ番号１３８６０５－００－２）などが挙げられる。
なお、ＣＴＡＤは、アデノシンに加えてテオフィリン、ジピリダモール（ホスホジエステラーゼ阻害剤）を含むから、細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するもの及び細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するもの、すなわちｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤の組み合わせとして使用できる。
細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものを血液との混合に用いる場合、その最終濃度は、例えば、アデノシンの場合、例えば、１ｐＭ～１Ｍであって、１ｎＭ～１００ｍＭが好ましい。
ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤は、１種類でもよく、複数種類の組み合わせであってもよい。例えば、ｃＡＭＰ又はその類似化合物と細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものとの組み合わせであってもよく、ｃＡＭＰ又はその類似化合物と細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものの組み合わせであってもよく、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものと細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものの組み合わせであってもよい。さらにｃＡＭＰ又はその類似化合物と、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものと、細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものとの組み合わせであってもよい。
具体的には、ｃＡＭＰ又はその類似化合物とＣＴＡＤとの組み合わせなどが挙げられる。
［採血血液の処理方法］
本開示に係る処理方法は、一態様において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤とを混合することを含む方法である。
「ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤」は、本開示において上記で説明するものを説明したように使用できる。
採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤との混合は、一又は複数の実施形態において、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を含む採血管で採血することにより行うことができる。また、その他の一又は複数の実施形態において、採血後にｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を添加してもよい。ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤と混合する血液には、抗血液凝固剤などの後述する他の成分がすでに混合されていてもよい。
本開示に係る処理方法を施した血液は、血小板及び白血球、希少細胞を安定化し、稀少細胞検査に対する保存安定性が向上し、稀少細胞検査を効率化しうる。この効果は、細胞を固定化しなくても発揮されうる。
本開示に係る処理方法を施した血液の稀少細胞検査までの保存期間は、一又は複数の実施形態において、４時間以上、６時間以上、１２時間以上、１～７日間、１～５日間、又は１～３日間である。
本開示に係る処理方法を施した血液の稀少細胞検査までの保存は、一又は複数の実施形態において、常温又は低温があげられる。また低温で保存した場合は、希少細胞検査前に室温に戻してもよく、また２９℃～４０℃に温めてもよい。
本開示において、常温としては、例えば、１５～２８℃が挙げられる。本開示において、低温としては、例えば、１０℃以下、１～１０℃、２～８℃、２～５℃、又は４℃が挙げられる。稀少細胞検査を効率化の観点から、保存は低温が好ましい。
保存は、一又は複数の実施形態において、撹拌、転倒混和、静置にて行われることが挙げられる。保存は、一又は複数の実施形態において、輸送を含みうる。
［抗血液凝固剤］
本開示に係る処理方法においては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞検査の効率化の観点から、抗血液凝固剤又はそれを含む組成物が血液と混合されることが好ましい。
抗血液凝固剤が混合されることで、血漿成分や血小板や細胞が安定性し、フィルターによる稀少細胞の捕捉率が向上するなど、稀少細胞検査の効率化が図られると考えられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及び抗血液凝固剤とを混合することを含む方法である。
なお、本開示に係る処理方法において、採血した血液と複数の剤とが混合される場合、複数の剤は同時に混合されてもよく、順番に混合されてもよい。例えば、抗血液凝固剤を添加した後にｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を添加してもよく、又はｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を添加した後に抗血液凝固剤を添加しても良い。
本開示に係る処理方法において使用される抗血液凝固剤としては、ヘパリン、ワーファリン、キレート剤が挙げられ、キレート剤としては、例えば、クエン酸、ＥＤＴＡ、等が挙げられる。抗血液凝固剤を添加する場合は好ましくはクエン酸が望ましい。
本開示において、「クエン酸」は、クエン酸塩を含む。また、本開示においてＥＤＴＡは、ＥＤＴＡ－２Ｋ及びＥＤＴＡ－３Ｋを含みうる。
なお、ＣＴＡＤは、クエン酸及びテオフィリン、アデノシン、ジピリダモールを含むから、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及び抗血液凝固剤として使用できる。
抗血液凝固剤を血液と混合する場合、その最終濃度は、例えば、クエン酸の場合、例えば、１ｎＭ～１Ｍであって、1ｍＭ～１００ｍＭが好ましい。
［シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤］
本開示に係る処理方法においては、一又は複数の実施形態において、処理後の血液を低温保存した場合における稀少細胞検査の効率化の観点から、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤又はそれを含む組成物が血液と混合されることが好ましい。
ＣＯＸ阻害剤が混合されることで、そのメカニズムの詳細は不明であるが、血液を低温保存したときの凝集や、血液中の炎症反応が抑制され、フィルターによる稀少細胞の捕捉率が向上するなど、稀少細胞検査の効率化が図られると考えられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びＣＯＸ阻害剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及びＣＯＸ阻害剤とを混合することを含む方法である。
本開示に係る処理方法において使用されるＣＯＸ阻害剤としては、例えば非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられ、サリチル酸系、アリール酢酸誘導体、ピラノ酢酸系、プロピオン酸系、インドール酢酸系、オキシカム系、アリル酢酸系などがあげられ、具体的には、サリチル酸ナトリウム（ＣＡＳ番号５４－２１－７）、アスピリン（ＣＡＳ番号４９３－５３－８）、ジクロフェナクナトリウム（ＣＡＳ番号１５３０７－７９－６）、エトドラク（ＣＡＳ番号４１３４０－２５－４）イブプロフェン（ＣＡＳ番号１５６８７－２７－１）、ロキソプロフェンナトリウム二水和物（ＣＡＳ番号２２６７２１－９６－６）、オキサプロジン（ＣＡＳ番号２１２５６－１８－８）、ナプロキセン（ＣＡＳ番号２２２０４－５３－１）、メロキシカム（ＣＡＳ番号７１１２５－３８－７）、ピロキシカム（ＣＡＳ番号３６３２２－９０－４）、インドメタシン（ＣＡＳ番号５３－８６－１）、ＳＣ５６０（ＣＡＳ番号１８８８１７－１３－２）、Ｓｕｌｉｎｄａｃ（ＣＡＳ番号３８１９４－５０－２）、レスベラトール（ＣＡＳ番号５０１－３６－０）、ニフルミン酸（ＣＡＳ番号４３９４－００－７）、ＮＳ－３９８（ＣＡＳ番号１２３６５３－１１－２）ニメスリド（５１８０３－７８－２）、メクロフェナム酸ナトリウム塩（ＣＡＳ番号６３８５－０２－０）等が挙げられる。
ＣＯＸ阻害剤を血液と混合する場合、その最終濃度は、例えば、アスピリンの場合、例えば、１ｐＭ～１００ｍＭであって、１０ｎＭ～１０ｍＭが好ましい。
［グルコース］
本開示に係る処理方法においては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞検査の効率化の観点から、グルコース又はそれを含む組成物が血液と混合されることが好ましい。
またグルコースが混合されることで、そのメカニズムの詳細は不明であるが、細胞内でグルコースからＡＴＰが合成され、ｃＡＭＰの材料のＡＴＰの供給を増やすことで、ｃＡＭＰを増やすことができると考えられる。また赤血球の変形能や形状が安定化し、また細胞の生存性が向上し、密度勾配分離や流路分離、フィルターによる稀少細胞の回収率や捕捉率が向上するなど、稀少細胞検査の効率化が図られると考えられる。より効果を得るためにクエン酸塩、リン酸、アデニン、イノシン、マンニトールやフルクトースなどを添加してもよい。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びグルコースとを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及びグルコースとを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、及びグルコースとを混合することを含む方法である。
グルコースを含む組成物としては、クエン酸塩、リン酸塩、グルコース、アデニンの組み合わせ（ＣＰＤＡ）、マンニトール、グルコース、アデニンの組み合わせ（ＭＤＡ）、マンニトール、グルコース、アデニン、イノシンの組み合わせ（ＭＤＡＩ）が挙げられる。
なお、ＣＰＤＡは、クエン酸及びグルコースを含むから、抗血液凝固剤及びグルコースとして使用できる。
グルコースを血液と混合する場合、その最終濃度は、例えば、１nＭ～１Ｍであって、１μＭ～４００ｍＭが好ましい。
［顆粒球エラスターゼ阻害剤］
本開示に係る処理方法においては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞検査の効率化の観点から、顆粒球エラスターゼ阻害剤又はそれを含む組成物が血液と混合されることが好ましい。
顆粒球エラスターゼ阻害剤が混合されることで、そのメカニズムの詳細は不明であるが、顆粒球エラスターゼを阻害することで細胞へのダメージ、細胞の凝集が抑制され、フィルターによる稀少細胞の捕捉率が向上するなど、稀少細胞検査の効率化が図られると考えられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及び顆粒球エラスターゼ阻害剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及び顆粒球エラスターゼ阻害剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、及び顆粒球エラスターゼ阻害剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、及び顆粒球エラスターゼ阻害剤とを混合することを含む方法である。
顆粒球エラスターゼ阻害剤としては、シベレスタット使用される顆粒球エラスターゼの阻害剤としては、シベレスタット（ＣＡＳ番号１２７３７３－６６－４）、ＤＭＰ-７７７（ＣＡＳ番号１５７３４１－４１－８）、ＳＳＲ ６９０７１（ＣＡＳ番号 ３４４９３０－９５－６）、Ｅｌａｓｔａｔｉｎａｌ（ＣＡＳ番号５１７９８－４５－９）、Ｎ－(メトキシスクシニル)－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－クロロメチルケトン（ＣＡＳ番号６５１４４－３４－５）、ケラシアニンクロライド（ＣＡＳ番号１８７１９－７６－１）、トリプシンインヒビター, 大豆由来（ＣＡＳ番号９０３５－８１－８）、３,４ジクロロイソクマリン（ＣＡＳ番号５１０５０－５９－０）、ＧＷ ３１１６１６（ＣＡＳ番号１９８０６２－５４－３）、ＢＡＹ６７８（ＣＡＳ番号６７５１０３－３６－３）、１－（３－メチルベンゾイル）－１Ｈ－インダゾール－３－カルボニトリル（ＣＡＳ番号１４４８３１４－３１－５）、ＭＲ－８８９（９４１４９－４１－４）、ＣＥ－１０３７（１５０４９３－０９－７）、ＡＥ－３７６３（ＣＡＳ番号２９１７７８－７７－３）等が挙げられる。
顆粒球エラスターゼ阻害剤を血液と混合する場合、その最終濃度は、例えば、シベレスタットの場合、例えば１ｐＭ～１Ｍであって、１０ｐ～１０ｍＭが好ましい。
［抗酸化剤］
本開示に係る処理方法においては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞検査の効率化の観点から、抗酸化剤又はそれを含む組成物が血液と混合されることが好ましい。
抗酸化剤が混合されることで、そのメカニズムの詳細は不明であるが、細胞の生存性が向上し、フィルターによる稀少細胞の捕捉率が向上するなど、稀少細胞検査の効率化が図られると考えられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及び抗酸化剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及び抗酸化剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、及び抗酸化剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、及び抗酸化剤とを混合することを含む方法である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、採血した血液と、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、及び抗酸化剤とを混合することを含む方法である。
抗酸化剤としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸2-グルコシド、テトラ２-ヘキシルデカン酸アスコビル、パルミチン酸アスコルビルリン酸3Na、メラトニン、カフェイン酸が上げられる。
抗酸化剤としては、また、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤が挙げられ、具体的には、ＳｋＱ１、ＭｉｔｏＱ、ＳＳ－３１が挙げられる。
ＳｋＱ１は、１０－（６’－プラストキノニル）デシルトリフェニルホスホニウムを含む塩としても知られ、とりわけ、神経防御特性に関して知られる。ＳｋＱ１はミトコンドリアにおける活性酸素種によって引き起こされる酸化ストレスを阻害することが示されてきている。
ＭｉｔｏＱはミトキノール（還元型）およびミトキノン（酸化型）の混合物であり、これらは、（１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル）トリフェニルホスホニウム及び（１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソシクロヘキサ－１，４－ジエニル）デシル）トリフェニルホスホニウムとしても知られる。ＭｉｔｏＱは、ユビキノール部分を含み、該部分は脂肪族炭素鎖を通じて親油性トリフェニルホスホニウムカチオンに共有結合する。ＭｉｔｏＱの抗酸化反応は、主に、リン脂質二重層内で起こる。
ＳＳ－３１（ｄ－Ａｒｇ－Ｄｍｔ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－ＮＨ２；Ｄｍｔ＝２’，６’－ジメチルチロシン）は、細胞内フリーラジカルを減少させるいくつかの細胞浸透性抗酸化ペプチドのファミリーのメンバーである。ファミリー中の他のメンバー同様、ＳＳ－３１ペプチドは、ミトコンドリアを標的とし、そしてミトコンドリア浸透性遷移、膨張、およびチトクロームｃ放出に対してミトコンドリアを保護し、そしてｔ－ブチルヒドロペルオキシド誘導性アポトーシスを防止することが知られる。
抗酸化剤を血液と混合する場合、その最終濃度は、例えば、１ｐＭ～１Ｍであって、１０ｐ～１０ｍＭが好ましい。
［その他の成分］
本開示に係る処理方法においては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞検査が大きく損なわれない範囲で、上記の成分以外の成分が血液と混合されてもよい。例えば、抗体試薬、酵素試薬、界面活性剤、色素試薬、高分子試薬、化学試薬、阻害試薬、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡプローブ、緩衝液、希釈液、粒子が挙げられる。
［稀少細胞検査方法］
本開示は、その他の態様において、本開示係る処理方法を行った血液を使用して稀少細胞検査を行うことを含む、稀少細胞検査方法に関する。
稀少細胞検査の方法は特に限定されず、フィルター分離などサイズや粘弾性を用いる方法、流路や流体力学的な分離などのサイズ差や粘弾性を用いる方法、遠心分離方法、抗体などの免疫学的手法を用いる方法、染色を用いる方法、顕微鏡を用いる方法、又はこれらの組み合わせを含みうる。
本態様の稀少細胞検査方法は、本開示に係る処理方法を施した血液試料を、稀少細胞検査を行うまで保存することを含んでもよい。
本開示に係る処理方法を施した血液の稀少細胞検査までの保存期間は、一又は複数の実施形態において、４時間以上、６時間以上、１２時間以上、１～７日間、１～５日間、又は１～３日間である。
保存は、一又は複数の実施形態において、常温又は低温で行うことができるが、稀少細胞検査を効率化の観点から、保存は低温が好ましい。保存後、希少細胞検査前に血液を温めてもよく、常温に戻してから使用してもよく、２９℃～４０℃まで温めてから処理してもよい。
本開示において、常温としては、例えば、１５～２８℃が挙げられる。本開示において、低温としては、例えば、１０℃以下、１～１０℃、２～８℃、２～５℃、又は４℃が挙げられる。
保存は、一又は複数の実施形態において、静置及び／又は輸送にて行うことが挙げられる。
［採血血液の処理方法（第２態様）］
本開示に係る処理方法は、その他の態様において、稀少細胞検査以外の血液成分検査にも使用してもよい。血液成分が安定化するからである。よって、本開示は、その他の態様において、採血血液の処理方法（第２態様）であって、採血した血液が、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤と混合されることを含む方法に関する。
ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、及び、その他の血液と混合する剤（抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及びその他）については、上述した本開示に係る処理方法におけるそれらを参照できる。
本開示に係る採血血液の処理方法（第２態様）の一又は複数の実施形態としては、採血した血液が、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤と混合されることを含む方法が挙げられる。
本開示に係る採血血液の処理方法（第２態様）のその他の一又は複数の実施形態としては、採血した血液が、ｃＡＭＰ又はその類似化合物と混合されることを含む方法が挙げられる。
［血液成分検査方法］
本開示は、さらにその他の態様において、その他の態様において、本開示に係る採血血液の処理方法（第２態様）を行った血液を使用して血液成分検査を行うことを含む、血液成分検査方法に関する。
血液成分検査の方法は特に限定されず、通常行われている検査目的に応じた方法が採用されうる。
［採血管］
本開示は、その他の態様において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を含む採血管に関する。
本開示において、採血管が「剤を含む」とは、採血により採血管内に導入される血液が剤と接触可能なように採血管内に剤が存在していることを意味しうる。
本開示に係る採血管は、稀少細胞検査という用途と、採血管に含まれる剤との組み合わせに技術的特徴があり、採血管の材料、大きさなどは特に限定されない。
本開示係る採血管に含まれるｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤としては、ｃＡＭＰ又はその類似化合物、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するもの、及び、細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものが挙げられ、それぞれについては、上述のとおりである。また、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤の含有量としては、所定の採血量が導入された場合に、上記最終濃度となる量が挙げられる。
本開示係る採血管に含まれるｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤は、１種類でもよく、複数種類の組み合わせであってもよい。例えば、ｃＡＭＰ又はその類似化合物と細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものとの組み合わせであってもよく、ｃＡＭＰ又はその類似化合物と細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものの組み合わせであってもよく、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものと細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものの組み合わせであってもよく、ｃＡＭＰ又はその類似化合物と細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものとの組み合わせであってもよく、ｃＡＭＰ又はその類似化合物と細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するものと細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するものの組み合わせであってもよい。
具体的には、ｃＡＭＰ又はその類似化合物とＣＴＡＤとの組み合わせなどが挙げられる。
本開示係る採血管は、稀少細胞の捕捉率の向上の観点から、さらに、抗血液凝固剤又はそれを含む組成物を含んでいてもよい。抗血液凝固剤については、上述のとおりであり、抗血液凝固剤の含有量は、所定の採血量が導入された場合に、上記最終濃度となる量が挙げられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及び抗血液凝固剤を含む採血管である。
本開示係る採血管は、稀少細胞の捕捉率の向上の観点から、さらに、ＣＯＸ阻害剤又はそれを含む組成物を含んでいてもよい。ＣＯＸ阻害剤については、上述のとおりであり、ＣＯＸ阻害剤の含有量は、所定の採血量が導入された場合に、上記最終濃度となる量が挙げられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びＣＯＸ阻害剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及びＣＯＸ阻害剤を含む採血管である。
本開示係る採血管は、稀少細胞の捕捉率の向上の観点から、さらに、グルコース又はそれを含む組成物を含んでいてもよい。グルコース又はそれを含む組成物については、上述のとおりであり、グルコース剤の含有量は、所定の採血量が導入された場合に、上記最終濃度となる量が挙げられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びグルコースを含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及びグルコースを含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、及びグルコースを含む採血管である。
本開示係る採血管は、稀少細胞の捕捉率の向上の観点から、さらに、顆粒球エラスターゼ阻害剤又はそれを含む組成物を含んでいてもよい。顆粒球エラスターゼ阻害剤又はそれを含む組成物については、上述のとおりであり、顆粒球エラスターゼ阻害剤の含有量は、所定の採血量が導入された場合に、上記最終濃度となる量が挙げられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及び顆粒球エラスターゼ阻害剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及び顆粒球エラスターゼ阻害剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、及び顆粒球エラスターゼ阻害剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、及び顆粒球エラスターゼ阻害剤を含む採血管である。
本開示係る採血管は、稀少細胞検査の効率化の観点から、抗酸化剤又はそれを含む組成物を含んでいてもよい。抗酸化剤又はそれを含む組成物については、上述のとおりであり、抗酸化剤の含有量は、所定の採血量が導入された場合に、上記最終濃度となる量が挙げられる。
よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及び抗酸化剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、及び抗酸化剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、及び抗酸化剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、及び抗酸化剤を含む採血管である。
また、本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、及び抗酸化剤を含む採血管である。
本開示係る採血管は、一又は複数の実施形態において、稀少細胞検査が大きく損なわれない範囲で、その他の成分を含んでいてもよい。
［採血管（第２態様）］
本開示に係る採血管は、その他の態様において、稀少細胞検査以外の血液成分検査にも使用してもよい。血液成分が安定化するからである。よって、本開示は、その他の態様において、採血管（第２態様）であって、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を含む採血管に関する。本態様の採血管によれば、ｃＡＭＰ又はｃＡＭＰ類似化合物により血液が安定化しうる。
ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤、及び、その他の血液と混合する剤（抗血液凝固剤、ＣＯＸ阻害剤、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及びその他）については、上述した本開示に係る採血管におけるそれらを参照できる。
本開示に係る採血管（第２態様）の一又は複数の実施形態としては、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤を含む採血管が挙げられる。
本開示に係る採血管（第２態様）のその他の一又は複数の実施形態としては、ｃＡＭＰ又はその類似化合物を含む採血管が挙げられる。
本開示に係る採血管（第２態様）は、採血パックの形態であってもよい。
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕 血液中の稀少細胞検査に使用するための採血血液の処理方法であって、
採血した血液が、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤と混合されることを含む、方法。
〔２〕 ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤が、ｃＡＭＰ及びその類似化合物、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するもの、細胞内のｃＡＭＰの合成を促進するもの、及びこれらの組み合わせ、並びに、これらを含む組成物からなる群から選択される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 採血した血液が、抗血液凝固剤と混合されることを含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 採血した血液が、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤の細胞内への導入促進剤と混合されることを含む、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 採血した血液が、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤と混合されることを含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 採血した血液が、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及びこれらの組み合わせ、並びに、これらを含む組成物からなる群から選択されるものと混合されることを含む、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 混合後の採血血液を、１０℃以下で保存することを含む、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 混合後の採血血液を、４時間以上保存することを含む、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕 血液中の稀少細胞検査する方法であって、
検査対象血液試料として〔１〕から〔８〕のいずれかの方法で処理した血液を使用することを含む、方法。
〔１０〕 血液中の稀少細胞検査に使用するための採血管であって、
ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤を含む、採血管。
〔１１〕 前記ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤が、ｃＡＭＰ及びその類似化合物、細胞内でｃＡＭＰの分解を抑制するもの、細胞内のｃＡＭＰの合成を促進するもの、及びこれらの組み合わせ、並びに、これらを含む組成物からなる群から選択される、〔１０〕に記載の採血管。
〔１２〕 さらに、抗血液凝固剤、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及びこれらの組み合わせ、並びに、これらを含む組成物からなる群から選択されるものを含む、〔１０〕又は〔１１〕に記載の採血管。
〔１３〕 採血血液の処理方法であって、
採血した血液が、ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤と混合されることを含む、方法。
〔１４〕 採血血液の処理方法であって、
採血した血液が、ｃＡＭＰ及びその類似化合物と混合されることを含む、方法。
〔１５〕 ｃＡＭＰ又はその類似化合物の細胞内濃度を上昇させる剤及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤を含む、採血管。
〔１６〕 ｃＡＭＰ又はその類似化合物を含む、採血管。
以下に実施例及び比較例を用いて本開示をさらに説明するが、これらは例示的なものであって、本開示は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
ヒトから採血した全血とがん細胞とを用いてＣＴＣ含有血液のモデル試料を調製し、その後フィルターで前記試料中のがん細胞を捕捉し、顕微鏡でフィルター上のＣＴＣを計測して捕捉率を算出した。下記実験１－４におけるＣＴＣの分離は、下記フィルターを用いて下記フィルター条件にて、特開２０１６－１８０７５３に開示される方法に準拠して行った。ＣＴＣのモデル細胞としては、小型のがん細胞試料としてＳＷ６２０を、変形能の高いがん細胞試料としてＳＮＵ１を使用した。なお保存血においても適宜血液量をコントロールすることで、高い捕捉率がえられるようになる。孔面積あたり血液換算で適切な容量を設定すればよい。
フィルター
ＣＴＣ（がん細胞）の捕捉に用いたフィルターは下記のものを使用した。
孔の形状：スリット
短径（μｍ）ｘ長径（μｍ）＝６．５ｘ８８
孔面積（μｍ2）＝５７２
孔の中心間のピッチ（短径側ｘ長径側）（μｍ）＝１４ｘ１００
孔密度（個／ｍｍ2）＝７１４
開口率（％）＝４１
膜厚（μｍ）＝５
材質：ニッケル
ろ過面積（ｍｍ2）＝２０
総孔数＝１４０２５
フィルター条件
１．ろ過速度１００μｌ／分で血液試料をチューブポンプからフィルターに送液。
２．１回目の洗浄 ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（―）液 ２ｍｌ １００μｌ／分
３．２回目の洗浄 ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（―）液 ２ｍｌ１０００μｌ／分
４．３回目の洗浄 ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（―）液 ２ｍｌ１０００μｌ／分
５．洗浄後にフィルター面を顕微鏡で観察する。
小型のがん細胞試料の調製
［ＳＷ６２０試料］
常法に従い、シャーレに培養した接着細胞であるヒト結腸癌（細胞株名 ＳＷ６２０）培地を除去後、ＰＢＳ（－）で添加し洗浄して培地成分を除去後、トリプシン（インビトロジェン社）処理（３７℃、３分）を行った。これに血清入り培地を加えて１.５ｍｌエッペンチューブ回収した。これを小型遠心機で３００ x g、常温（２４℃）、３分間遠心し、上清を除去した。これを再度血清入り培地に懸濁して回収した。調製したがん細胞懸濁液を培養液から回収した後、小型遠心機で３００ｘｇ、常温（２４℃）、３分間遠心した。上清を除去し、ＰＢＳ（－）を添加して細胞を懸濁する。このＰＢＳ（－）に懸濁した細胞を、染色試薬ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（インビトロジェン）を用いて蛍光染色した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒは、１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた後、反応時の濃度が最終濃度０．５～０．２５μＭになるように細胞懸濁液に添加した。そして３７℃、３０分反応後、細胞懸濁液を遠心して上清の除去し、再度ＰＢＳに懸濁した。この操作を繰り返して、未反応液の除去と細胞を洗浄した。その後細胞の懸濁液の濃度を任意の濃度（１０3個／ｍＬ～５ｘ１０4個／ｍＬ程度）になるように培地またはＰＢＳ（－）を用いて懸濁した。
変形能の高いがん細胞試料の調製
［ＳＮＵ１試料］
浮遊系であるヒト胃癌細胞株（細胞株名 ＳＮＵ１）は、トリプシン処理を行うことなく、１．５ｍｌのエッペンチューブに回収した。回収したがん細胞懸濁液を用いた以外は、ＳＷ６２０試料の調製と同様に、蛍光染色を行って調製した。なお、ＳＮＵ１の細胞径は１６．８μｍであるが、ＳＷ６２０に比べ、直径６．５μｍの孔に対して容易に抜けやすかった。
採血管
採血管として、下記の市販採血管を使用した。
ＣＴＡＤ採血管：クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、及びジピリダモールが封入された採血管（日本ベクトン・デッキンソン社製）
クエン酸塩採血管：終濃度０．３２％となるクエン酸ナトリウムが封入された採血管（テルモ社製）
ＥＤＴＡ２Ｋ採血管：（テルモ社製）
ヘパリンＮａ採血管：（テルモ社製）
ＡＣＤ採血管：（日本ベクトン・デッキンソン社製）
採血管に添加する試薬
ＤＢｃＡＭＰ：（ジブチルｃＡＭＰ、東京化成社製、１００ｍＭ）（ｃＡＭＰアナログ）
８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ：（８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰ、和光純薬社製、５０ｍＭ）（ｃＡＭＰアナログ）
ＣＦＣ：（溶媒は、エタノール：水＝２：１）
カフェイン（和光純薬社製、１０１ｍＭ）（キサンチン類のＰＥＤ阻害剤）
フォルスコリン（東京化成社製、２４．８ｍＭ）（ｃＡＭＰ合成の促進）
シロスタゾール（和光純薬社製、１３．２ｍＭ）（ＰＤＥ３特異的阻害剤）
Ｒ：（ロリプラム、東京化成社製、２０ｍＭ in ＥｔＯＨ）（ＰＤＥ４特異的阻害剤）
Ｄ：（ジピリダモール、和光純薬、１９．８ｍＭ、in ＥｔＯＨ）（ＰＤＥ５．７，８特異的阻害剤）
ＡＳＰ(1)：（アスピリン、和光純薬社製、１.１ Ｍ in ＥｔＯＨ）（ＣＯＸ阻害剤）
ＡＳＰ(2)：（アスピリン、和光純薬社製、１１１ｍＭ in ＥｔＯＨ）（ＣＯＸ阻害剤）
ＣＰＤＡ：
クエン酸ナトリウム水和物（ナカライテスク社製、１０９ｍＭ）
クエン酸一水和物（ナカライテスク社製、２０ｍＭ）
リン酸二水素ナトリウム（ナカライテスク社製、２ｍＭ）
Ｄ－（＋）－グルコース（ナカライテスク社製、１８８ｍＭ）
アデニン（ナカライテスク社製、２ｍＭ）
ＭＡＤＩ：
Ｄ－マンニトール（ナカライテスク社製、１９７ｍＭ）
アデニン（和光純薬社製、２．９５ｍＭ）
Ｄ－（＋）－グルコース（ナカライテスク社製、１００ｍＭ）
イノシン－５－１リン酸二ナトリウム塩（和光純薬社製、４０ｍＭ）
Ｓｉｌｖｅｓｔａｔ：（シグマアルドリッチ社製、約２３ｍＭ）（顆粒球エラスターゼ阻害剤）
ＳＳ－３１：（製品名ＨＹ－Ｐ１２５、Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社製、１０ｍＭ in ＤＭＳＯ）（抗酸化剤）
ＮａＣｌ(1)：（１．８％ in Water）
ＮａＣｌ(2)：（０．９％ in Water）
［実験１］
がん細胞の経時劣化を考慮せずにすむよう、常温で２４又は４８時間保存した全血に対し、フィルターに送液して分離する当日に調製したがん細胞試料を加えてモデル試料を調製した。これにより新鮮血を常温で２４又は４８時間保存することによる血液の変化の影響を評価した。
採血管（市販採血管）にヒトから採血をし、全血９～１０ｍｌを１５ｍｌ遠沈管に分注し、モデル試料の調製に利用した。分注した血液に下記表１に示す試薬を添加したものを用いて、常温で２４又は４８時間保存し、その後、血液を処理する前に調製したがん細胞（ＳＮＵ１及びＳＷ６２０）を３００個程度添加してモデル試料を調製した（実施例１～３、比較例１～５）。
調製したモデル試料のうち８ｍｌ相当（モデル試料の調製における試薬添加は合計約１０ｍｌとなるように血液と試薬を添加し、濾過時に濾過量を調整した。例えば、採血管から遠沈管に分注した９ｍｌの全血に合計１ｍｌの試薬の添加剤を入れたモデル試料の場合、８．９ｍｌを使用する。又は血液１０ｍｌに合計２００μＬの試薬の添加剤を入れたモデル試料の場合、８．２ｍｌを使用する。）を用いて上記条件でがん細胞をフィルター捕捉して捕捉率を算出した。その結果を下記表１に示す。
Figure 0007036670000001
採血した血液を常温で長時間保存すると、例えば、赤血球の変形能の低下、白血球の死細胞化による凝集物の発生、及び、血小板等の凝集の発生などにより、血液が、フィルターに詰まりやすい状態になる。新鮮血ではＳＮＵ－１やＳＷ６２０を添加した血液試料をフィルターに通液させた後、フィルター上には９０%以上のＳＮＵ－１やＳＷ６２０が残るが、このような保存後の血液試料では、フィルター上下の差圧が高まりやすい状態となり、その結果、がん細胞が抜け易くなり、直前に調製したがん細胞であっても捕捉率が下がる。この現象は、従来の抗血液凝固剤を使用した比較例１～５の結果からも認められる。
これに対し、ＤＢｃＡＭＰを添加した実施例１、及び、ＣＴＡＤ採血管を用いた実施例２，３では、比較例１～５と比べて捕捉率が向上した。ＤＢｃＡＭＰは、細胞内で分解されてｃＡＭＰを供給し、またＤＢｃＡＭＰ自体もホスホジエステラーゼも阻害するとの報告もある。すなわち、血球の細胞内ｃＡＭＰが上昇する環境になると、新鮮血の常温保存による血液成分の変化、例えば血球の変化に起因する（すなわち、分離対象のＣＴＣの変化に起因しない）捕捉率の低下を抑制できることが確認された。同様に、ＣＴＡＤの添加でも血小板だけでなく、白血球等の細胞内のｃＡＭＰ上昇が作用していると考えられる。ＣＴＡＤ採血管が稀少細胞検査に好適に用いられることが見出された。特に、血液を長時間（例えば、４時間以上又は２４時間以上）保存した後に稀少細胞検査を実施した場合に、ＣＴＡＤ採血管を使用した効果が顕著に認められる。血液成分の変化の抑制は、特に白血球を測定する場合コールター式血球計数機、例えばＳＢ１４４０による測定による、白血球の裸核化されたヒストグラムが安定していることを確認することができる。
ＡＴＰを供給するＭＡＤＩを添加した実施例３は、添加していない実施例２に比べ、４８時間保存後の捕捉率が向上した。
なお、ＳＮＵ１及びＳＷ６２０はフィルターでの捕捉が難しいがん細胞であるから、これらのがん細胞が捕捉できれば、さまざまながん細胞が捕捉できると期待できる。
［実験２］
全血にがん細胞を加えた後に常温で２４又は４８時間保存してモデル試料を調製し、フィルターを用いて分離し、捕捉率を評価した。
実験２では、上記実験１とは異なり、常温２４又は４８時間保存による血液成分の変化に加え、常温２４又は４８時間保存によるがん細胞の変化が与える捕捉率への影響を評価した。
採血管（クエン酸塩採血管又はＣＴＡＤ採血管）にヒトから採血（計１０ｍｌ）をして1５ｍｌ遠沈管に分注した。分注した血液に下記表２に示す試薬を添加したものを用いて、調製したがん細胞（ＳＮＵ１及びＳＷ６２０）を３００個程度添加した後、常温で２４又は４８時間保存しモデル試料を調製した（実施例４～６、比較例６～７）。これによりがん細胞を含む新鮮血を保存することによる影響を評価した。
調製したモデル試料のうち８ｍｌ相当を用いて上記条件でがん細胞をフィルター捕捉して捕捉率を算出した。その結果を下記表２に示す。
Figure 0007036670000002
薬剤を添加しない比較例６に比べ、ＤＢｃＡＭＰを添加した実施例４及び５、並びに、ＣＴＡＤ採血管を用いた実施例６では捕捉率が向上した。すなわち、細胞内でｃＡＭＰが増加する条件下での捕捉率の向上が認められた。２４ｈ後においては、比較例７と実施例４と実施例５との比較において、ＢＤｃＡＭＰの添加でＳＮＵ－１の捕捉率が向上し、さらにＢＤｃＡＭＰとＣＰＤＡとを両方添加することでＳＮＵ－１の捕捉率が約２倍の向上が得られた。４８ｈ後においては、フィルター濾過直前に調製した劣化の少ないがん細胞を添加する保存血液試料（表１ 実施例２）に比べて、血液にがん細胞を添加して保存後の保存血液試料（表２ 実施例６）にがん細胞の捕捉率の捕捉低下が観察された。捕捉率低下の詳しいメカニズムは分からないが、血液にがん細胞を含有した状態で保存した場合、がん細胞が経時変化して捕捉率が下がったと考えられる。実施例５において、細胞内のｃＡＭＰ及びｃＡＭＰアナログが増加する条件下でＣＰＤＡを添加したものは、４８ｈ時間後のがん細胞の捕捉率が比較例７と比較して向上した。
また、ＣＰＤＡのみを添加した比較例７は、比較例６と同様の捕捉率であった。
［実験３］
がん細胞の経時劣化を考慮せずにすむよう、４℃で７２時間保存した全血に対し、フィルター分離する当日に調製したがん細胞試料を加えてモデル試料を調製した。これにより新鮮血を４℃で７２時間保存することによる影響を評価した。
ＣＴＡＤ採血管にヒトから採血（計１０ｍｌ）をし、1５ｍｌ遠沈管に分注した。分注した血液に、下記表３に示す試薬を添加したものを用いて４℃で７２時間保存し、その後、血液を処理する前に常温に戻し、調製したがん細胞（ＳＮＵ１及びＳＷ６２０）を３００個程度添加してモデル試料を調製した（実施例７～８）。
調製したモデル試料のうち８ｍｌを用いて上記条件でがん細胞をフィルター捕捉して捕捉率を算出した。その結果を下記表３に示す。
Figure 0007036670000003
表３のとおり、アスピリン（ＡＳＰ）を使用した実施例８では、ＡＳＰを添加しない実施例７に比べＳＮＵ１及びＳＷ６２０の捕捉率はともに向上した。また、目視観察において、実施例７ではフィルター上に大きな凝集物の発生が観察されたが、実施例８では大きな凝集物の抑制が観察された。
なお、ＣＴＡＤ採血管（表１実施例２）の室温２４時間保存に比べて、冷蔵で２４時間保存した後室温に戻してがん細胞をフィルター捕捉すると、ＳＮＵ－１の捕捉率は７２％から３２％、ＳＷ６２０の捕捉率は９２％から５４％に低下した。
詳しいメカニズムは不明だが、低温保存によって血液に対して影響を与えるが、ＣＴＡＤにさらにＡＳＰを添加することにより、低温保存時の血液の変化の影響が抑制され、室温に戻して処理した後も高い捕捉率が得られたと考えられる。
［実験４］
実験４では、上記実験３とは異なり、４℃で７２時間保存による血液成分の変化に加え、４℃で７２時間保存によるがん細胞の変化が与える捕捉率への影響を評価した。
採血管（クエン酸塩採血管又はＣＴＡＤ採血管）にヒトから採血（計１０ｍｌ）をし、1５ｍｌ遠沈管に分注した。分注した血液９ｍｌに下記表４に示す試薬を添加したものを用いて、調製したがん細胞（ＳＮＵ１及びＳＷ６２０）を３００個程度添加した後、４℃で７２時間保存しモデル試料を調製した（実施例９～１８、比較例８）。
常温に戻した後、調製したモデル試料のうち９ｍｌを用いて上記条件でがん細胞をフィルター捕捉して捕捉率を算出した。その結果を下記表４及び図１に示す。
Figure 0007036670000004
表４及び図１のとおり、血液の安定化剤、ＡＴＰ供給剤/栄養化剤として使用されるＣＰＤＡを添加することにより、捕捉率の向上がみとめられた（実施例９ｖｓ１０）。また、好中球エラスターゼ阻害剤シルベレスタットを添加することにより捕捉率の向上がみとめられた（実施例１０ｖｓ１１）。さらに、抗酸化剤ＳＳ３１を添加することにより、接着して増殖するＳＷ６２０の捕捉率の向上が観察された（実施例１１ｖｓ１２）。なお、実施例１２と１３とを比較すると、捕捉率が向上するとともに、ＤＢｃＡＭＰを添加した実施例１３ではフィルター後のフィルター表面に凝集物が少なく、きれいな状態であり解析が容易であった。
比較例８と実施例１４－１８とを比較すると、血中の稀少細胞検査において、細胞内ｃＡＭＰが上昇する剤の添加が重要であることが確認できる。またフィルターからの回収したサンプルについては、比較例８の組成では血液細胞の小さな凝集が多く観察されたが、実施例１４の組成で小さな凝集が抑制されていた。またホスホジエステラーゼの阻害剤の添加では、血小板のホスホジエステラーゼの特異的阻害剤に、さらに免疫細胞に特異的なホスホジエステラーゼを阻害するものを添加することでさらに捕捉率の顕著に向上したことが確認できる（実施例１６、実施例１７、実施例１８）。
［実験５］
［稀少細胞中のＲＮＡ解析］
採血管（ＣＴＡＤ採血管）にヒトから採血をし、全血９ｍｌを１５ｍｌ遠沈管に分注し、モデル試料の調製に利用した。分注した血液９ｍｌに前記実施例１１及び１２と同様の添加試薬を混合し、前述のＳＮＵ－１やＳＷ６２０と同様に事前に染色して調製したがん細胞（ＳＫＢＲ３）を血液に添加した後、４℃で７２時間保存しモデル試料を調製した。モデル試料９ｍｌをろ過面積（フィルター面積）２０ｍｍ2から２８ｍｍ2のフィルターに変えて濾過し洗浄した。濾過及び洗浄ともに１０００μＬ／ｍｉｎで行った。濾過、洗浄後に市販の溶血剤を送液した。１０ｍｉｎ反応させフィルター上に残った赤血球を溶血後、再度ＰＢＳ（―）液を送液し洗浄した。ＳＫＢＲ３を逆流によってフィルター上から回収し、回収したサンプルの一部を用いて、顕微鏡で計数して回収された細胞数を推定した。ＳＫＢＲ３のフィルターからの逆流による回収率はどちらも７１％であった。残りの回収したサンプルをＲＮＡ精製キットのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ Ｎｏ．／ＩＤ： ７４１０４／キアゲン）で精製後、ＡＢＩ７５００を用い、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ ｗ／ＲＯＸ（製品番号：１１７４５１００／サーモフィッシャー）とＥＲＢＢ２の市販のプローブ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ０１００１５８０＿ｍ１／サーモフィッシャー）を用いて、ＳＫＢＲ３のＥＲＢＢ２のｍＲＮＡについてＲＴ―ＰＣＲ解析を行った。
解析では２種類の参照を準備した。培養後のシャーレから常法に従いＳＫＢＲ３をはがし、1時間以内に任意の数になるよう調整処理したもの（参照Ａ）と、ＲＰＭＩ培地単独（参照Ｂ）。これらの参照を用いて上述と同様にＲＮＡを抽出し、ＳＫＢＲ３のＥＲＢＢ２のｍＲＮＡについてＲＴ＿ＰＣＲ解析を行った。
ＲＴ―ＰＣＲは、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成後、ＰＣＲで１サイクルごとにＤＮＡ が２倍、２倍と指数関数的に増幅される。ＣT値とはＰＣＲ 増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数のことを示す。早いサイクル、つまりＣT値が小さいものほど、ＲＴ－ＰＣＲ開始時にサンプル中のｍＲＮＡが多く存在すること意味する。また同細胞数において、培養直後の参照ＡのＣT値に近いほど、回収サンプル中のＳＫＢＲ３内にはｍＲＮＡが多く残っていることを示す。
ＲＴ＿ＰＣＲの解析の結果、参照Ｂ（ＲＰＭＩ培地のみ）ではＣT値は得られず、ＥＲＢＢ２のｍＲＮＡは検出されなかった。参照ＡではＳＫＢＲ３が４６０個程度でＣT値＝２５．２２であった。
実施例１１及び１２と同様に調製された血液から回収されたＳＫＢＲ３のうち、４６０個程度のＳＫＢＲ３で、実施例１１がＣT値＝２５．９８、実施例１２がＣT値＝２６．５６であった。また血液のみをろ過して回収したサンプル（ＳＫＢＲ３無添加）については、ＣT値＝３５．７７で、ＥＲＢＢ２のｍＲＮＡが血液にも少量ながら存在することが分かった。
ＳＫＢＲ３を血液に添加した回収サンプルは、ＳＫＢＲ３無添加の血液の回収サンプルに比べ、明らかにＣT値が小さく、ＳＫＢＲ３のＥＲＢＢ２のｍＲＮＡを検出できた。４℃で７２ｈ保存後であっても、ＳＫＢＲ３内のＥＲＢＢ２のｍＲＮＡが残存しており検出可能であることが示された。
［稀少細胞中のＦＩＳＨ解析］
採血管（クエン酸塩採血管）にヒトから採血をし、全血９ｍｌを１５ｍｌ遠沈管に分注し、モデル試料の調製に利用した。分注した血液９ｍｌに前記実施例１４と同様の添加試薬を混合し、事前に染色しなかったこと以外は前述のＳＮＵ－１やＳＷ６２０と同様に調製したがん細胞（ＳＫＢＲ３）を血液に数千個程度添加した後、４℃で７２時間保存しモデル試料を調製した。モデル試料９mlを、前記フィルター条件と同様にして濾過し洗浄した。濾過及び洗浄ともに１０００μＬ/ｍｉｎで行った。濾過、洗浄後に市販の溶血剤を送液した。１０min反応させ溶血後、再度ＰＢＳ（―）液を送液し洗浄した。フィルター上のＳＫＢＲ３（乳がん細胞）を逆流によって回収し、スライドに塗布した。ＤＮＡ-ＦＩＳＨの場合はカルノア液でスライドに固定した。ＲＮＡ－ＦＩＳＨの場合はスライドに付着させた後、細胞を４％ホルムアルデヒド が入ったＰＢＳ（―）で固定した。
ＤＮＡ－ＦＩＳＨは、前記同様にモデル試料を処理後、回収したサンプルについて、その後ＤＮＡ－ＦＩＳＨの常法に従い、ｚｙｔｏｌｉｇｈｔｓｐｅｃｅｒｂｂ２/ｃｅｎ１７ｐｌｏｂｅ （ＺＹＶ社）を用いて染色し、蛍光顕微鏡によってＥＲＢＢ２の遺伝子の増幅を観察できた（図２左）。ＲＮＡ－ＦＩＳＨは、ＶｉｅｗＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴＦＡ－ＱＶＣ０００１/ベリタス）を用い、そのプロトコルと試薬組成に従い、ＰＡＮ－ＫＲＴ（ＶＡ１－１９１４７/ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてサイトケラチンのｍＲＮＡの染色を確認できた（図２右）。本処方によって、７２ｈ４℃保存後のサンプルにおいて遺伝子の解析ができる。

Claims (15)

  1. 血液中の腫瘍細胞及び/又はがん細胞の検査に使用するための採血血液の処理方法であって、
    採血した血液が、ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、６－モノブチリルｃＡＭＰ、８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ）、ｃＧＭＰ、ジブチリル－ｃＧＭＰ及び８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＧＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＧＭＰ）からなる群から選択される少なくとも一つと混合されることを含む、方法。
  2. 採血した血液が、抗血液凝固剤と混合されることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗血液凝固剤は、クエン酸、及びＥＤＴＡからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 採血した血液が、リポソーム、界面活性剤、溶剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つと混合されることを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 採血した血液が、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤と混合されることを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 採血した血液が、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及びこれらの組み合わせ、並びに、これらを含む組成物からなる群から選択されるものと混合されることを含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 混合後の採血血液を、１０℃以下で保存することを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 混合後の採血血液を、４時間以上保存することを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 血液中の腫瘍細胞及び/又はがん細胞の検査する方法であって、
    検査対象血液試料として請求項１から８のいずれかの方法で処理した血液を使用することを含む、方法。
  10. 血液中の腫瘍細胞及び/又はがん細胞の検査に使用するための採血管であって、
    ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、６－モノブチリルｃＡＭＰ、８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ）、ｃＧＭＰ、ジブチリル－ｃＧＭＰ及び８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＧＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＧＭＰ）からなる群から選択される少なくとも一つを含む、採血管。
  11. さらに、抗血液凝固剤、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤、グルコース、顆粒球エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及びこれらの組み合わせ、並びに、これらを含む組成物からなる群から選択されるものを含む、請求項１０に記載の採血管。
  12. 血液中の腫瘍細胞及び/又はがん細胞の検出又は回収のための採血血液の処理方法であって、
    採血した血液が、ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、６－モノブチリルｃＡＭＰ、８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ）、ｃＧＭＰ、ジブチリル－ｃＧＭＰ及び８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＧＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＧＭＰ）からなる群から選択される少なくとも一つ、及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤と混合されることを含む、方法。
  13. 血液中の腫瘍細胞及び/又はがん細胞の検出又は回収のための採血血液の処理方法であって、
    採血した血液が、ｃＡＭＰ並びに、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、６－モノブチリルｃＡＭＰ、８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ）、ｃＧＭＰ、ジブチリル－ｃＧＭＰ及び８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＧＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＧＭＰ）からなる群から選択される少なくとも一つと混合されることを含む、方法。
  14. 血液中の腫瘍細胞及び/又はがん細胞の検出又は回収のための採血管であって、
    ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、６－モノブチリルｃＡＭＰ、８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ）、ｃＧＭＰ、ジブチリル－ｃＧＭＰ及び８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＧＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＧＭＰ）からなる群から選択される少なくとも一つ及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤を含む、採血管。
  15. 血液中の腫瘍細胞及び/又はがん細胞の検出又は回収のための採血管であって、
    ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、６－モノブチリルｃＡＭＰ、８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＡＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＡＭＰ）、ｃＧＭＰ、ジブチリル－ｃＧＭＰ及び８－（４－クロロフェニルチオ）－ｃＧＭＰ（８－ｐＣＰＴ－ｃＧＭＰ）からなる群から選択される少なくとも一つを含む、採血管。
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