JP6179508B2 - 希少細胞の検出方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、本発明者らは、血液由来検体に含有される細胞に対して細胞固定処理を行った後に密度勾配遠心分離をしたところ、細胞固定された希少細胞が、赤血球以外の細胞が多く含まれる層にほぼ確実に含まれるようになり、希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
<赤血球除去方法>
本発明の赤血球除去方法は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に多量に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、下記の工程(A)および(B)を含むことを特徴とする。
密度勾配遠心工程(B):細胞が固定された血液由来検体を、密度勾配遠心法により、「赤血球が多く含まれる層」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」との少なくとも二層に分離する工程。
本発明で用いる血液由来検体に含まれている可能性のある「希少細胞」とは、体内に極微量に存在する細胞の総称であり、例えば循環腫瘍細胞(血液循環癌細胞ともいう。)〔CTC〕、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、各種幹細胞等が挙げられる。本発明の赤血球除去方法を実施した後に得られた血液由来検体から検出するための目的の細胞でもあり得る。
〔抗凝固剤〕
抗凝固剤は、採血した血液がゲル状になる「血液凝固」を防止するための薬剤である。血液由来検体の用途によって抗凝固剤が必要な場合と不要な場合とがあるが、本発明のように希少細胞を回収する場合は通常は抗凝固剤が必要となる。
〔細胞固定剤〕
工程(A)、すなわち、血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程では、細胞固定剤を使用して細胞を固定する。「固定」または「細胞固定」とは、一般的には、細胞または組織の自己分解や腐敗を遅延させるとともに、その形態および抗原性を保持する目的で行われる処理をいう。本発明では、このような処理が希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下などの効果をもたらす。
重金属元素としては、例えば、クロム〔Cr〕、マンガン〔Mn〕、亜鉛〔Zn〕などが挙げられる。
工程(A)において用いる細胞固定剤の量は、その種類に応じて適宜調整することができるが、血液由来検体に含有される血液100vol%に対して、細胞固定剤の濃度は0.01〜50.0vol%の範囲で調整される。
工程(B)で実施される「密度勾配遠心法」とは、主に分子生物学実験で用いられる手法であり、所望の「分離液」を用いることによって遠沈管内の溶液に対して通常は底部から上部に向かって密度(比重)を低下させ、その状態で試料を遠心分離すると、目的とする物質や細胞がその密度(比重)に従って一定の密度溶液の層をそれぞれ形成するが、そのような性質を利用して目的物を分取する方法である。
本発明の採血用遠沈管は、上記「細胞固定剤」、上記「抗凝固剤」および密度勾配遠心用の上記「分離液」が予め充填されていることを特徴とし、充填の態様として、分離液と細胞固定剤および抗凝固剤とが「多孔質バリア」および/または「チキソトロープゲル」によって物理的に分断されているのが好ましく、その際、細胞固定剤および抗凝固剤が固体状(例えば粉末や顆粒など)であるのが好ましく、特に細胞固定剤がホルムアルデヒド供与体であるとより好ましい。
[実施例1]ホルムアルデヒド処理血液の白血球回収率および赤血球混入比
採血管として、テルモ(株)製のベノジェクト(登録商標)II真空採血管「VP-DK053K」を用いた。この採血管には予めエチレンジアミン四酢酸二カリウム〔EDTA-2K〕の顆粒が所定量充填されており、この量は採血量に対してEDTA濃度が1.5mg/mL程度になる量と思われる。なお、この採血管の容積は5mLである。
この「20%中性緩衝ホルマリン液」は、ホルマリン原液(37%ホルムアルデヒド溶液)をリン酸緩衝生理食塩水〔PBS〕で約7.4%に調整されたものであり、血液3mLに対して、ホルムアルデヒド〔FA〕の最終濃度がそれぞれ0.01vol%、0.02vol%、0.04vol%、0.08vol%および0.1vol%になるようにして採血管に添加した。
実際にカウントしたサンプルの希釈倍率や全体のサンプル量から補正を行い、2mL血液および遠心後サンプルに存在する全白血球数を算出し、遠心分離前の白血球数に対する遠心分離後の白血球数の比を算出して、白血球回収率(%)を求めた。また、遠心後サンプルの全細胞数に対し、白血球数を除いた値を赤血球数とし、赤血球数と白血球数の比を算出し、赤血球混入比を求めた。その結果を表1に示す。
実施例1において、「20%中性緩衝ホルマリン液」の代わりにPBSを用いた以外は実施例1と同様にして白血球回収率と赤血球混入比を求めた。その結果を表1に示す。
まず、抗凝固剤と細胞固定剤とが予め充填された採血管として市販されているCyto−Chex(登録商標)BCT(Streck Innovations社製)一本当たりに、採血した血液3mLを入れた。
Cyto−Chex(登録商標)に血液3mLが入っているこのような採血管は3本用意し、10分間静置後、密度勾配遠心法を実施した群と;室温で2日間静置後に一度転倒混和(血漿成分と血球成分とが混和されるように)し、密度勾配遠心法を実施した群と;室温で3日間静置後に一度転倒混和し、密度勾配遠心法を実施した群とにそれぞれ用いた。
実施例2において、「Cyto−Chex(登録商標)BCT」の代わりに「ベノジェクト(登録商標)II真空採血管」(実施例1で用いたものと同じ、所定量のEDTA-2Kが予め充填されている採血管)を用いた以外は、実施例2と同様にして白血球回収率を求めた。この結果を表2および図2に示す。
ホルムアルデヒド〔FA〕による処理群として、実施例1において、血液3mLに対するホルムアルデヒド〔FA〕の最終濃度が0.08vol%になるよう添加した採血管と、実施例1と同様にして、血液3mLに対するホルムアルデヒド〔FA〕の最終濃度が0.16vol%になるよう添加して準備した採血管それぞれに対し、実施例1において、「室温で3日間静置した」ことに代えて、室温で1日間静置し、実施例1と同様にして白血球回収率を求めた。
また、Cyto−Chex(登録商標)BCTによる処理群(以下、「Cyto−Chex(登録商標)処理」)として、実施例2において、静置及び混和を、1日間静置後に一度転倒混和することによって行ったこと以外は実施例2と同様にして白血球回収率を求めた。
これらの結果を表3に示す。
実施例2の3日間静置において、静置時の温度を振って白血球回収率と赤血球混入比を求めた。すなわち、「Cyto−Chex(登録商標)BCT」による細胞固定化を行う際に、3日間静置を行う温度を、4℃,20℃,29℃,37℃という4段階の温度に振ったことを除いては、実施例2と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
その結果を表4に示す。
実施例4において、長時間の保管に適していると推測された4℃および20℃において、白血球回収率および赤血球混入比についての、採血日から5日間の経時変化を実施例2と同様な方法で追跡した。すなわち、「Cyto−Chex(登録商標)BCT」による細胞固定化を行う際に、静置を行う温度を4℃,20℃という2段階の温度に振るとともに、静置を行う時間についても10分間(0日),3日間(3日),5日間(5日)という3段階の時間に振ったことを除いては、実施例2と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
ここで、比較例2と同様に細胞固定化を行わなかったサンプルについての、20℃における白血球回収率および赤血球混入比の経時変化についても同様に追跡を行った。
結果を図3に示す。
2・・・細胞固定された血液由来検体
3・・・分離液
4・・・血小板が多く含まれる血漿からなる層
5・・・単核球が多く含まれる層
6・・・分離液の層
7・・・赤血球が多く含まれる層
Claims (9)
- 血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出する方法であって、
(A):血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程;および
(B):上記工程(A)で得られた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程
を含み、
上記工程(B)を実施した後、赤血球が多く含まれる層以外の層を、全部採取して展開し観察する工程を行う希少細胞の検出方法。 - 上記工程(A)において、血液由来検体に含有される血液100vol%に対して、細胞固定剤を、その濃度が0.01vol%以上50.0vol%以下となるように含ませる、請求項1に記載の検出方法。
- 上記工程(A)において、ホルムアルデヒド供与体を細胞固定剤として用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100vol%に対して、ホルムアルデヒド供与体の濃度が0.1vol%以上10.0vol%以下となるように含ませる、請求項1に記載の検出方法。
- 上記工程(A)において、ホルムアルデヒドを細胞固定剤として用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100vol%に対して、ホルムアルデヒドの濃度が0.01vol%以上1.0vol%以下となるように含ませる、請求項1に記載の検出方法。
- 上記工程(A)において、アルコール類を用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100vol%に対して、該細胞固定剤の濃度が1.0vol%以上50.0vol%以下となるように含ませる、請求項1に記載の検出方法。
- 上記工程(A)において、細胞固定する時間が10分間以上7日間以下である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の検出方法。
- 上記工程(A)において、細胞固定するとともに血液凝固を阻害する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の検出方法。
- 上記工程(B)において、密度勾配遠心法に用いる分離液の比重が、1.113以下である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の検出方法。
- 上記工程(B)において、密度勾配遠心法に用いる分離液の比重が、1.085以下である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の検出方法。
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