JP7394122B2 - 細胞外小胞の保存安定化剤及び保存安定化方法 - Google Patents
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Description
本発明の課題は、細胞外小胞を安定的に保存することが可能な手段を提供することである。
[1]ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーを含んでなる、細胞外小胞の保存安定化剤。
[2]前記ポリマーが、ビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位を含む共重合体、又はポリビニルピロリドンである、[1]に記載の保存安定化剤。
[3]前記ポリマーが、ビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位を含む共重合体である、[1]に記載の保存安定化剤。
[4]前記共重合体の前記ビニルピロリドン由来のモノマー単位と前記ビニルアセテート由来のモノマー単位の構成比が、1:0.1~1:3である、[2]又は[3]に記載の保存安定化剤。
[5]前記共重合体のフィケンチャーのK値が、5~50である、[2]~[4]から選ばれる何れか一つに記載の保存安定化剤。
[6]前記共重合体の重量平均分子量が、3,000~250,000である、[2]~[5]から選ばれる何れか一つに記載の保存安定化剤。
[7]前記ポリマーが、ポリビニルピロリドンである、[1]に記載の保存安定化剤。
[8]前記ポリビニルピロリドンのフィケンチャーのK値が、5~140である、[2]又は[7]に記載の保存安定化剤。
[9]前記ポリビニルピロリドンの重量平均分子量が、1,000~3,000,000である、[2]、[7]及び[8]から選ばれる何れか一つに記載の保存安定化剤。
[10]ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーの存在下、細胞外小胞を凍結保存することを含んでなる、細胞外小胞の保存安定化方法。
[11]前記ポリマーが、ビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位を含む共重合体、又はポリビニルピロリドンである、[10]に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
[12]前記ポリマーが、ビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位を含む共重合体である、[10]に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
[13]前記共重合体の前記ビニルピロリドン由来のモノマー単位と前記ビニルアセテート由来のモノマー単位の構成比が1:0.1~1:3である、[11]又は[12]に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
[14]前記共重合体のフィケンチャーのK値が、5~50である、[11]~[13]から選ばれる何れか一つに記載の保存安定化方法。
[15]前記共重合体の重量平均分子量が、3,000~250,000である、[11]~[14]から選ばれる何れか一つに記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
[16]前記ポリマーが、ポリビニルピロリドンである、[10]に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
[17]前記ポリビニルピロリドンのフィケンチャーのK値が、5~140である、[11]又は[16]に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
[18]前記ポリビニルピロリドンの重量平均分子量が、1,000~3,000,000である、[11]、[16]及び[17]から選ばれる何れか一つに記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
細胞外小胞の生理活性は、例えば、CD9、CD63、CD81等の細胞外小胞の膜表面に存在するマーカータンパク質の活性を測定する、細胞外小胞の粒子数をNTA(Nano Tracking Analysis)法により測定する、電気顕微鏡により細胞外小胞の粒子数や形状など状態を観察する、タンパク質やペプチドの数をプロテオーム解析により測定する等により確認することができる。
本発明の細胞外小胞の保存安定化剤(以下、本発明の保存安定化剤と略記する場合がある)は、ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーを含んでなる、細胞外小胞の保存安定化剤である。本発明の保存安定化剤によれば、細胞外小胞を安定的に凍結保存することが可能である。
本発明に係るポリマーとしては、細胞外小胞を安定化する効果が高いことからビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位を含む共重合体が好ましく、ビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位のみからなる共重合体がより好ましい。また、本発明に係るポリマーとしては、生体許容性材料として使用されることからポリビニルピロリドンが有用である。
これら本発明に係るポリマーは、1種を単独で用いても、2種以上混合して用いてもよく、1種を単独で用いるのが好ましい。なお、重合開始剤由来の構造等の重合反応に伴い付加される構成単位を含むポリマーも本発明に係るポリマーに包含される。すなわち、ホモポリマー(ポリビニルピロリドン)やビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位のみからなる共重合体は、モノマー単位としては、前記2つのモノマー単位のみからなるが、重合開始剤由来の構造等の重合反応に伴い付加されるモノマー単位以外の構成単位を含んでいてもよい。
本発明に係る細胞外小胞は、細胞に由来する、脂質二重膜で構成される小型膜小胞である。当該細胞外小胞は、通常20nm~1000nmの直径を有するものが挙げられ、50nm~800nmのものが好ましく、50nm~500nmのものがより好ましく、50nm~200nmのものが特に好ましい。本発明に係る細胞外小胞としては、例えば、Nature Reviews Immunology 9, 581-593 (August 2009)、「肥満研究」Vol.13 No.2 2007 トピックス 青木直人等に記載の通り、その発生起源や小型膜小胞の大きさ等により様々に分類されるものが挙げられる。具体的には、エクソソーム、微小胞、エクトソーム、膜粒子、エクソソーム様小胞、アポトーシス小体、アディボソーム等が挙げられる。
本発明の保存安定化剤は、これらのうち、エクソソーム、微小胞に対してより有用であり、エクソソームに対して特に有用である。
生体試料は、例えば、動物から直接採取されたものであっても、回収、濃縮、精製、単離、緩衝液等による希釈、ろ過滅菌等の前処理を行ったものであってもよい。これら前処理は、この分野で用いられる常法に従い、適宜行えばよい。動物としては、細胞外小胞を含みうる動物であれば特に限定されず、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ハムスター、ロバ、モルモットが挙げられ、ヒトが好ましい。
これらの単離方法は、1種のみを用いても、2種以上を組み合わせてもよい。また、1種の単離方法による単離を2回以上繰り返してもよい。
本発明の細胞外小胞の保存安定化方法(以下、「本発明の保存安定化方法」と略記する場合がある)は、ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマー(本発明に係るポリマー)の存在下、細胞外小胞を凍結保存することを含んでなる、細胞外小胞の保存安定化方法である。
すなわち、本発明の保存安定化方法は、本発明に係るポリマーと細胞外小胞とを接触させ、本発明に係るポリマーの存在下で細胞外小胞を凍結保存するものである。
具体的には、本発明に係るポリマーと細胞外小胞とを接触させることによって、本発明に係るポリマーと細胞外小胞とを含有する保存溶液(以下、本発明に係る保存溶液と略記する場合がある)を調製し、当該保存溶液を凍結保存するものである。
また、本発明の保存安定化方法に用いられる細胞外小胞は、前記<本発明に係る細胞外小胞>の項において述べたものと同一であり、具体例や好ましいものも同一である。
前記水系溶媒を含む本発明の保存安定化剤としては、前記<本発明の細胞外小胞の保存安定化剤>の項において述べたものと同一であり、好ましいものも同一である。
まず、生体試料から常法に従い細胞外小胞を単離し、細胞外小胞を含有する水や緩衝液等の溶液(pHが例えば、5~10であり、5.5~9.5が好ましく、5~9がより好ましい)を得る。次いで、別途調製した、本発明に係るポリマーを含有する水や緩衝液等の溶液(pHが例えば、5~10であり、5.5~9.5が好ましく、5~9がより好ましい)を、生体試料又は前記細胞外小胞を含有する溶液に添加し、例えば、2℃~42℃、好ましくは2℃~40℃、より好ましくは2℃~37℃で、例えば、1秒~30分、好ましくは1秒~20分、より好ましくは1秒~10分接触(混合)させる。これにより、例えば、0.0001~10%(w/v)、好ましくは0.00025~5%(w/v)、より好ましくは0.0005~2.5%(w/v)、更に好ましくは0.001~1%(w/v)、特に好ましくは0.0025~0.5%(w/v)の濃度の本発明に係るポリマーと、例えば、2×105~2×1016(particles/mL)、好ましくは2×105~2×1015(particles/mL)、より好ましくは2×106~2×1014の濃度(本発明に係る保存溶液の単位体積当たりの細胞外小胞の粒子数)の細胞外小胞とを含有する保存溶液(pHが例えば、5~10であり、5.5~9.5が好ましく、5~9がより好ましい)を得る。
次いで、得られた保存溶液(すなわち、本発明に係るポリマーの共存下で細胞外小胞)を、例えば、-2℃~-150℃、好ましくは-5℃~-150℃、より好ましくは-10℃~-150℃で、例えば、1秒~5年、好ましくは5分~2年、凍結保存する。
また、本発明に係る保存溶液の凍結融解回数(具体的には、凍結融解をおこなう回数)は特に限定されないが、例えば1回~50回であり、1回~20回が好ましい。
すなわち、本発明の保存安定化方法は、本発明に係る細胞外小胞の凍結及び融解における細胞外小胞の保存安定化方法ともいえる。同様に、本発明の保存安定化剤は、本発明に係る細胞外小胞の凍結及び融解に対する保存安定化剤ともいえる。
Kollidon(登録商標)VA64のエクソソームを凍結保存する際の保存安定化効果について、COLO201細胞由来エクソソームを用いて検証した。測定条件の詳細は、表1に示す。
(1)エクソソームの取得
COLO201細胞(JCRB細胞バンクより分譲)を、Expi293(登録商標) Expression Medium(ThermoFisher SCIENTIFIC社製)を用いて96時間培養し、培養上清を得た。得られたCOLO201細胞培養上清10mLから、MagCapture(登録商標) Exosome Isolation Kit PS(富士フイルム和光純薬株式会社製)を用いて、当該キットに添付の説明書に記載の手順に従ってエクソソームを精製し、1mM EDTA含有 1×Tris buffer(pH7.4)中にエクソソームを得た。得られた溶液を「エクソソーム精製溶液」と略記する場合がある。
(2)エクソソームの凍結保存
得られたエクソソーム精製溶液を、4℃で16時間インキュベートした。次いで、5%(w/v)Kollidon水溶液(Kollidon(登録商標)VA64(BASF社製)、大塚蒸留水(大塚製薬株式会社製))を調製した。インキュベート後のエクソソーム精製溶液に、5%(w/v)Kollidon水溶液を終濃度0.05%(w/v)となるように添加した。得られた溶液を「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」と略記する場合がある。
次いで、得られた安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液を用いて、「-80℃で5分間凍結した後室温で5分間融解する」条件で20回凍結融解操作を繰り返した。得られた凍結融解後の溶液を「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」と略記する場合がある。
(3)保存安定化効果の検証
「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」に含まれるエクソソームマーカーであるCD63を、PS Capture(登録商標) エクソソームELISAキット(ストレプトアビジンHRP)(富士フイルム和光純薬株式会社製、抗CD63抗体を含む)を用いて、当該キットに添付の説明書に記載の手順に従って測定し、吸光度を求めた。
また、抗CD9,モノクローナル抗体(30B)(富士フイルム和光純薬株式会社製)、又は、抗CD81,モノクローナル抗体(17B1)(011-27773,富士フイルム和光純薬株式会社製)をビオチン標識用キット-SH(LK10,株式会社同仁化学研究所製)によりビオチン標識した。得られた標識抗体を抗CD63抗体の代わりに使用して、同様の方法によりエクソソームマーカーであるCD9及びCD81を測定し、それぞれ吸光度を求めた。
更に、コントロールとして、「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」の代わりに「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」を用いて、同様の方法によりCD63、CD9及びCD81を測定し、それぞれ吸光度を求めた。
吸光度から、「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」の吸光度を100[%]とした場合の、それぞれの溶液の吸光度の相対値[%]を、エクソソームマーカー毎に算出した。算出した値を「シグナル値」と略記する場合がある。
(4)結果
シグナル値の結果を図1Aのグラフに示す。図1Aにおいて、横軸はKollidon(登録商標)VA64の有無および測定したエクソソームマーカーの種類を示し、Kollidon+が実施例1の結果、Kollidon-は後述する比較例1の結果を示す。縦軸は、シグナル値を示す。
表1に記載の条件に従い、5%(w/v)Kollidon水溶液をインキュベート後のエクソソーム精製溶液に添加しない以外は、実施例1と同様の方法により測定を行い、凍結保存後のエクソソーム溶液のシグナル値[%]を算出した。
シグナル値の結果を図1Aに示す。図中、Kollidon-が比較例1の結果を示す。
これらの結果から、ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーは、細胞外小胞を凍結保存する際に、細胞外小胞を保存安定化させる効果を有することが判った。
細胞外小胞の凍結保存前後における相対シグナル値の変動が、細胞外小胞がサンプルチューブに吸着することによるものではないことを確認する為、プロテインアッセイBCAキット(富士フイルム和光純薬製)を用いて、実施例1における「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」及び「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」のタンパク質濃度を、それぞれBCAプロテインアッセイにより測定した。具体的には、当該キットに添付のプロテインアッセイBCA試薬Aに、当該キットに添付のプロテインアッセイBCA試薬Bを1/50量[v/v]添加して混合液を調製した。当該混合液200μLと「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」又は「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」25μLを、NUNC 96well plate平面プレート(サーフィッシャーサイエンティフィック社製)中でそれぞれ混合し、60℃条件下で30分間インキュベートした。その後、プレートリーダーを用いてインキュベート後の溶液の562nmの吸光度をそれぞれ測定し、吸光度から「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」及び「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」のタンパク質濃度をそれぞれ算出した。
結果を図1Bに示す。図1Bにおいて、横軸はKollidon(登録商標)VA64の有無を示し、Kollidon+が実験例1の結果、Kollidon-は後述する実験例2の結果を示す。縦軸は、測定した溶液中のタンパク質濃度[ng/μL]を示す。
実験例1と同様の方法により、比較例1における凍結保存前のエクソソーム溶液及び凍結保存後のエクソソーム溶液のタンパク質濃度を測定した。測定条件の詳細は、表1に示す。結果を図1Bに示す。Kollidon-は実験例2の結果を示す。
実施例1における「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」及び「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」の単位体積当たりの粒子数を、NanoSight(Malvern Panalytical社製)を用いて、ナノ粒子トラッキング解析法(Nano Tracking Analysis法)により、NanoSightの説明書に記載の手順に従ってそれぞれ3回測定し、単位体積当たりの平均粒子数[Particles/mL]を算出した。
結果を図1Cに示す。図1Cにおいて、横軸はKollidon(登録商標)VA64の有無を示し、Kollidon+が実験例3の結果、Kollidon-は後述する実験例4の結果を示す。縦軸は、測定した溶液中の粒子数[×1011 particles/mL]を示す。
実験例3と同様の方法により、比較例1における凍結保存前のエクソソーム溶液及び凍結保存後のエクソソーム溶液の単位体積当たりの粒子数を測定し、単位体積当たりの平均粒子数[Particles/mL]を算出した。
結果を図1Cに示す。Kollidon-は実験例4の結果を示す。
細胞外小胞の凍結保存により粒子数が減少することを検証する為、実施例1における「安定化剤含有-凍結保存前エクソソーム溶液」及び「安定化剤含有-凍結保存後エクソソーム溶液」を、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて解析した。透過型電子顕微鏡により観察した像を図1Dに示す。図1D中、Kollidon+が実施例2の結果を示し、Kollidon-は後述する比較例2の結果を示す。
実施例2と同様の方法により、比較例1における凍結保存前のエクソソーム溶液及び凍結保存後のエクソソーム溶液を、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて解析した。透過型電子顕微鏡により観察した像を図1Dに示す。
Kollidon(登録商標)VA64によるエクソソームを凍結保存させる際の保存安定化効果が、各種試料に由来するエクソソームに対しても有効であるか検討した。すなわち、試料として、実施例1と同様の方法により得られたCOLO201細胞培養上清1mL、実施例1と同様の方法により間葉系幹細胞(MSC)(ロンザ製)を培養して得られた間葉系幹細胞培養上清1mL、血清(ビジコムジャパン製)1mL、及び血漿(ビジコムジャパン製)1mLをそれぞれ用いて検討した。
具体的には、表1に記載の条件に従い、実施例1記載の方法に準じて吸光度を測定し、シグナル値を算出した。なお、用いた試料の単位体積当たりの粒子数を実験例3と同様の方法により測定した結果、COLO201細胞培養上清の単位体積当たりの粒子数は2×1010particles/mL、間葉系幹細胞培養上清の単位体積当たりの粒子数は、2×109particles/mL、血清の単位体積当たりの粒子数は、2×1010particles/mL、血漿の単位体積当たりの粒子数は、6×1010particles/mLであった。
シグナル値の結果を図2から図5それぞれに示す。図2はCOLO201細胞由来のエクソソームを用いた場合、図3は間葉系幹細胞(MSC)由来エクソソームを用いた場合、図4は血清由来エクソソームを用いた場合、図5は血漿由来エクソソームを用いた場合の結果である。図中、横軸はKollidon(登録商標)VA64の有無および凍結融解操作の回数を示し、Kollidon+が実施例3の結果、Kollidon-は後述する比較例3の結果をそれぞれ示す。
縦軸は、シグナル値[%]を示す。
表1に記載の条件に従い、5%(w/v)Kollidon水溶液をインキュベート後のエクソソーム精製溶液に添加する操作を行わなかった以外は、実施例3と同様の方法により、凍結保存後のエクソソーム溶液のシグナル値[%]を算出した。
シグナル値の結果を図2から図5にそれぞれ示す。図中、Kollidon-が比較例3の結果を示す。
これらの結果から、ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーは、細胞外小胞の由来によらず、細胞外小胞を凍結保存する際に、細胞外小胞を安定化させる効果を有することが判った。
Kollidon(登録商標)VA64によるエクソソームを凍結保存する際の保存安定化効果に対して、エクソソームの凍結温度が与える影響について検証した。すなわち、凍結温度を-80℃又は-20℃として検討を行った。
具体的には、表1に記載の条件に従い、実施例1記載の方法に準じて吸光度を測定し、シグナル値を算出した。シグナル値の結果を図6及び図7のグラフにそれぞれ示す。図6は-80℃で凍結保存させた場合の結果、図7は-20℃で凍結保存させた場合の結果である。図中、Kollidon+が実施例4の結果、Kollidon-は後述する比較例4の結果をそれぞれ示す。横軸は凍結融解操作の回数、及び検出したエクソソームマーカーの種類を示す。縦軸は、シグナル値[%]を示す。
図6及び図7のグラフより、-20℃及び-80℃のいずれの凍結温度においても、エクソソームマーカーであるCD9及びCD63のいずれについても、凍結保存の前後でシグナル値はほぼ変化しなかった。
これらの結果から、ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーは、細胞外小胞の凍結温度によらず、細胞外小胞を凍結保存させる際に、細胞外小胞を安定化させる効果を有することが判った。
Kollidon(登録商標)VA64によるエクソソームを凍結保存させる際の保存安定化効果に対して、凍結温度が-20℃の場合に凍結融解操作の回数が与える影響について検証した。すなわち、凍結温度を-20℃、凍結融解操作の回数を15回として検討した。具体的には、表1に記載の条件に従い、実施例1記載の方法に準じて吸光度を測定し、シグナル値を算出した。
シグナル値の結果を図8にそれぞれ示す。図中、横軸は凍結融解操作の回数、及び検出したエクソソームマーカーの種類を示す。縦軸は、シグナル値[%]を示す。
Kollidon(登録商標)VA64によるエクソソームを凍結保存させる際の保存安定化効果に対して、凍結融解操作の回数が与える影響について検証した。すなわち、実施例5において凍結融解操作の回数を15回行った後のエクソソームを、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて解析した。また、コントロールとして、凍結融解操作を行う前のエクソソームについても、同様の方法により観察した。透過型電子顕微鏡により観察した像を図9に示す。図中、上段が凍結融解操作を行う前(0回)の観察像、下段が凍結融解操作を15回おこなった後の観察像である。
また、図9の電子顕微鏡により観察した像より、Kollidon(登録商標)VA64を用いて、-20℃で15回、細胞外小胞の凍結融解操作を行った場合、凍結保存前後で形状の変化は観察されず、粒子数もほぼ保たれていた。
以上の結果から、ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーは、細胞外小胞の凍結操作の回数によらず、細胞外小胞を凍結保存させる際に、細胞外小胞を安定化させる効果を有することが判った。
トレハロースは、エクソソームの凍結保存において、エクソソームの凝集を抑制し粒子数を保持することにより、エクソソームを凍結保存によるダメージから保護し安定化させることが示唆されている(非特許文献1)。そこで、本発明に係る安定化剤と同様、トレハロースが、凍結保存時に粒子数の減少を抑制するのみならず、エクソソームマーカー(エクソソームの表面抗原)の活性を保持可能であるか検証した。
(1)エクソソームの取得
実施例1と同様の方法により、COLO201細胞の培養上清からエクソソームを精製し、エクソソーム精製溶液を取得した。
(2)エクソソームの凍結保存
得られたエクソソーム精製溶液を、4℃で16時間インキュベートした。次いで、トレハロース(富士フイルム和光純薬株式会社製)を大塚蒸留水(大塚製薬株式会社製)に溶解させ、500mMトレハロース水溶液を調製した。インキュベート後のエクソソーム精製溶液に、500mMトレハロース水溶液を、終濃度25mMとなるように添加した。得られた溶液を「トレハロース含有-凍結保存前エクソソーム溶液」と略記する場合がある。次いで、トレハロースを添加したエクソソーム溶液を用いて、-80℃で5分間凍結した後室温で5分間融解する条件で3回凍結融解操作を繰り返した。得られた溶液を「トレハロース含有-凍結保存後エクソソーム溶液」と略記する場合がある。
(3)エクソソームマーカーの吸光度測定
「トレハロース含有-凍結保存前エクソソーム溶液」からエクソソームマーカーであるCD9を、PS Capture(登録商標)エクソソームELISAキット(ストレプトアビジンHRP)(富士フイルム和光純薬株式会社)を用いて、当該キットに添付の説明書に記載の手順に従って測定し、吸光度を算出した。但し、CD9を検出する為、抗CD9,モノクローナル抗体(30B)(富士フイルム和光純薬株式会社)をビオチン標識用キット-SH(LK10,株式会社同仁化学研究所)によりビオチン標識したものを、キット中の抗CD63抗体の代わりに使用した。
更に、コントロールとして、「トレハロース含有-凍結保存後エクソソーム溶液」の代わりに「トレハロース含有-凍結保存前エクソソーム溶液」を用いて、同様の方法によりCD9を測定して吸光度を求めた。
吸光度から、「トレハロース含有-凍結保存前エクソソーム溶液」の吸光度を100[%]とした場合の、それぞれの溶液の吸光度の相対値[%]を、エクソソームマーカー毎に算出した。算出した値を「シグナル値」と略記する場合がある。
(4)結果
シグナル値の結果を図10のグラフに示す。図中、トレハロース+が比較例4の結果を示し、トレハロース-は後述する比較例5の結果を示す。図10において、横軸はトレハロースの有無を示す。また、縦軸は、シグナル値を示す。
表1に記載の条件に従い、500mMトレハロース水溶液をインキュベート後のエクソソーム精製溶液に添加しなかった以外は、比較例4と同様の方法により測定を行い、シグナル値[%]を算出した。
シグナル値の結果を図10に示す。図中、トレハロース-が比較例5の結果を示す。
図10のグラフより、トレハロースを添加せずエクソソーム溶液のみを凍結保存した場合(比較例5)、凍結保存後のシグナル値は、凍結保存前のシグナル値に比べて、いずれのエクソソームマーカーにおいても著しく低下した。他方、トレハロースを含有させて凍結保存した場合(比較例4)においても、エクソソームマーカーのシグナル値は著しく低下した。
ポリビニルピロリドンのエクソソームを凍結保存させる際の保存安定化効果について、Kollidon(登録商標)17PFおよびCOLO201細胞の培養上清由来エクソソームを用いて検証した。
(1)エクソソームの取得
実施例1と同様の方法により、COLO201細胞の培養上清からエクソソームを精製し、エクソソーム精製溶液を取得した。
(2)エクソソームの凍結保存融解
得られたエクソソーム精製溶液を、4℃で16時間インキュベートした。次いで、市販のポリビニルピロリドンであるKollidon(登録商標)17PF(BASF社製)を大塚蒸留水に溶解させ、10%(w/v)Kollidon 17PF水溶液を調整した。インキュベート後のエクソソーム精製溶液に、10% Kollidon(登録商標)17PF水溶液を、終濃度0.1%となるように添加した。得られた溶液を、「Kollidon(登録商標)17PF含有-凍結融解凍結保存前エクソソーム溶液」と略記する場合がある。次いで、Kollidon(登録商標)17PFを添加したエクソソーム溶液を用いてに対し、-80℃で5分間凍結させ室温で5分間融解させる-80℃で5分間凍結した後室温で5分間融解する条件にて、3回凍結融解した。得られた溶液を、「Kollidon(登録商標)17PF含有-凍結融解凍結保存後エクソソーム溶液」と略記する場合がある。
(3)保存安定化効果の検証
「Kollidon(登録商標)17PF含有-凍結融解凍結保存後エクソソーム溶液」を測定試料として、PS Capture(登録商標)エクソソームELISAキット(ストレプトアビジンHRP)(富士フイルム和光純薬株式会社、抗CD63抗体を含む)における抗CD63抗体の代わりに抗CD9抗体を用いた以外は、当該キットに添付の説明書に記載の手順に従ってエクソソームマーカーであるCD9を測定し、吸光度を得た。抗CD9抗体は、抗CD9,モノクローナル抗体(30B)(富士フイルム和光純薬株式会社)をビオチン標識用キット-SH(LK10,株式会社同仁化学研究所)によりビオチン標識したものを用いた。更に、コントロールとして、「Kollidon(登録商標)17PF含有-凍結融解凍結保存前エクソソーム溶液」を用いて、同様の方法によりCD9をそれぞれ測定して吸光度を得た。
得られた吸光度から、「Kollidon(登録商標)17PF含有-凍結融解凍結保存前エクソソーム溶液」の吸光度を100[%]とした場合の、それぞれの溶液「Kollidon(登録商標)17PF含有-凍結融解凍結保存後エクソソーム溶液」の吸光度の相対値[%](シグナル値)を算出した。
(4)結果
シグナル値の結果を図11のグラフに示す。図11において、横軸はKollidon(登録商標)の種類および有無を示し、縦軸は、シグナル値をそれぞれ示す。図中、17PF+が実施例6の結果を示す。
「Kollidon(登録商標)17PF」の代わりに「Kollidon(登録商標)12PF」を使用した以外は、実施例6と同様の方法によりCD9を測定し、相対的シグナル値を算出した。相対的シグナル値の結果を図11のグラフに示す。図中、12PF+が実施例7の結果を示す。
表1に記載の条件に従い、10%(w/v)Kollidon 12PF水溶液をインキュベート後のエクソソーム精製溶液に添加しなかった以外は、実施例6と同様の方法により測定を行い、シグナル値[%]を算出した。シグナル値の結果を図11のグラフに示す。図中、Controlが比較例6の結果を示す。
他方、Kollidon(登録商標)VA64を用いて凍結保存した場合と同様、Kollidon(登録商標)17PF又はKollidon(登録商標)12PFを用いて凍結保存した場合(実施例6、実施例7)、いずれも凍結保存の回数に依らず、凍結保存の前後でシグナル値はほぼ変化しなかった。
これらの結果から、ポリビニルピロリドンも、細胞外小胞を凍結保存する際に、細胞外小胞を保存安定化させる効果を有することが判った。
Kollidon(登録商標)VA64のエクソソームを凍結保存する際の保存安定化効果について、プロテオーム解析により検証した。
(1)エクソソームの取得
実施例1と同様の方法により、COLO201細胞の培養上清からエクソソームを精製し、エクソソーム精製溶液を取得した。
(2)エクソソームの凍結保存
得られたエクソソーム精製溶液を、4℃で16時間インキュベートした。次いで、5%(w/v)Kollidon水溶液(Kollidon(登録商標)VA64(BASF社製)、大塚蒸留水(大塚製薬株式会社製))を調製した。インキュベート後のエクソソーム精製溶液に、5%(w/v)Kollidon水溶液を終濃度0.05%(w/v)となるように添加した。得られた溶液を-80℃で8日間凍結した後、室温で10分間融解した。
(3)保存安定化効果の検証
凍結融解後の溶液を用いて、アセトンによるタンパク質沈殿処理を行い、さらにアセトンにより洗浄した。その後、トリプシンによる加水分解処理を行い、LC-MS/MSに供した。MS/MSから抽出したデータを基に配列データベース検索により、ペプチド及びタンパク質を同定した。
(4)結果
同定されたペプチド数及びタンパク質数を下記表2に示す。表中、VA64はKollidon(登録商標)VA64を示す。VA64添加が実施例8の結果を表す。
5%(w/v)Kollidon水溶液をインキュベート後のエクソソーム精製溶液に添加しなかった以外は、実施例8と同様の方法によりプロテオーム解析を行い、凍結融解後の溶液に含まれるペプチド及びタンパク質を同定した。
同定されたペプチド数及びタンパク質数を表2に示す。VA64非添加が比較例7の結果を表す。
これらの結果から、ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーは、細胞外小胞を凍結保存する際に、細胞外小胞に含まれるタンパク質およびペプチドを安定的に保存できることが判った。
Claims (12)
- ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーを含み、
前記ポリマーがビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位を含み、重量平均分子量が、3,000~250,000である共重合体、又は重量平均分子量が1,500~15,000であるポリビニルピロリドンであり、
ポリマーと細胞外小胞と水系溶媒とを含有する保存溶液の凍結保存に用いられる
細胞外小胞の保存安定化剤。 - 前記ポリマーが、前記共重合体である、請求項1に記載の保存安定化剤。
- 前記共重合体の前記ビニルピロリドン由来のモノマー単位と前記ビニルアセテート由来のモノマー単位の構成比が、1:0.1~1:3である、請求項2に記載の保存安定化剤。
- 前記共重合体のフィケンチャーのK値が、5~50である、請求項2に記載の保存安定化剤。
- 前記ポリマーが、前記ポリビニルピロリドンである、請求項1に記載の保存安定化剤。
- 前記ポリビニルピロリドンのフィケンチャーのK値が、9~20である、請求項5に記載の保存安定化剤。
- ビニルピロリドン由来のモノマー単位を有するポリマーの存在下、細胞外小胞を凍結保存することを含んでなり、
前記ポリマーが、ビニルピロリドン由来のモノマー単位及びビニルアセテート由来のモノマー単位を含み、重量平均分子量が、3,000~250,000である共重合体、又は重量平均分子量が1,500~15,000であるポリビニルピロリドンであり、
前記細胞外小胞を凍結保存することが、ポリマーと細胞外小胞と水系溶剤を含有する保存溶液を調製し、当該保存溶液を凍結保存することである
細胞外小胞の保存安定化方法。 - 前記ポリマーが、前記共重合体である、請求項7に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
- 前記共重合体の前記ビニルピロリドン由来のモノマー単位と前記ビニルアセテート由来のモノマー単位の構成比が1:0.1~1:3である、請求項8に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
- 前記共重合体のフィケンチャーのK値が、5~50である、請求項8に記載の保存安定化方法。
- 前記ポリマーが、前記ポリビニルピロリドンである、請求項7に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
- 前記ポリビニルピロリドンのフィケンチャーのK値が、9~20である、請求項11に記載の細胞外小胞の保存安定化方法。
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