CN113710794A - 细胞外囊泡的保存稳定化剂及保存稳定化方法 - Google Patents

细胞外囊泡的保存稳定化剂及保存稳定化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113710794A
CN113710794A CN202080029711.5A CN202080029711A CN113710794A CN 113710794 A CN113710794 A CN 113710794A CN 202080029711 A CN202080029711 A CN 202080029711A CN 113710794 A CN113710794 A CN 113710794A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extracellular vesicles
storage
kollidon
extracellular
monomer unit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080029711.5A
Other languages
English (en)
Inventor
山根昌之
今若直子
中川祐二
笹本宏大
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Wako Pure Chemical Corp filed Critical Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Publication of CN113710794A publication Critical patent/CN113710794A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F126/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C08F126/06—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C08F126/10—N-Vinyl-pyrrolidone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L39/00—Compositions of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L39/04—Homopolymers or copolymers of monomers containing heterocyclic rings having nitrogen as ring member
    • C08L39/06—Homopolymers or copolymers of N-vinyl-pyrrolidones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明的课题在于提供可将细胞外囊泡稳定地保存的手段。本发明涉及包含含有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物或聚乙烯吡咯烷酮等、具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物而成的细胞外囊泡的保存稳定化剂，以及包含在该聚合物的存在下冷冻保存细胞外囊泡的步骤而成的细胞外囊泡的保存稳定化方法。

Description

细胞外囊泡的保存稳定化剂及保存稳定化方法
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡的保存稳定化剂、保存稳定化方法。
背景技术
己知细胞外囊泡的粒子内部存在有蛋白质或microRNA等核酸，担任细胞间的物质传递。细胞外囊泡也被分泌至血液等体液中，细胞外囊泡中的蛋白质或microRNA等作为疾病的诊断标记物受到关注。进而，由于一部分源自干细胞的胞外体(exosome)显示具有组织修复能力或作为核酸药物递送工具的利用性，因此也期待作为医药品进行应用。
如此，在利用细胞外囊泡作为诊断标记物或医药品时，或在进行细胞外囊泡的功能解析等基础研究等时，在不降低细胞外囊泡的品质的情况下进行保存是必要的。因此，作为细胞外囊泡的保存，通常为冷冻保存。
另外，己知将海藻糖用于细胞外囊泡的冷冻保存(非专利文献1)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Steffi Bosch,Laurence de Beaurepaire,Marie Allard,Mathilde Mosser,Claire Heichette,Denis Chretien,Dominique Jegou&Jean-MarieBach.Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage,ScientificReports volume 6,Article number:36162(2016)
发明内容
发明要解决的课题
细胞外囊泡容易受到冷冻的影响，重复进行冷冻融解操作有细胞外囊泡的粒子数减少的情况。
本发明的课题在于提供可将细胞外囊泡稳定地保存的手段。
用于解决课题的手段
本发明人等为了解決上述课题，使用各种化合物对是否可将细胞外囊泡稳定地保存进行了深入研究，结果发现，通过在具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物的存在下保存细胞外囊泡，可以稳定地保存细胞外囊泡。
本发明涉及细胞外囊泡的保存稳定化剂、保存稳定化方法。
[1]一种细胞外囊泡的保存稳定化剂，其包含具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物而成。
[2]根据[1]所述的保存稳定化剂，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物、或聚乙烯吡咯烷酮。
[3]根据[1]所述的保存稳定化剂，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物。
[4]根据[2]或[3]所述的保存稳定化剂，其中，所述共聚物的所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.1～1：3。
[5]根据[2]～[4]中任一项所述的保存稳定化剂，其中，所述共聚物的费肯歇尔(Fikentscher)K值为5～50。
[6]根据[2]至[5]中任一项所述的保存稳定化剂，其中，所述共聚物的重均分子量为3,000～250,000。
[7]根据[1]所述的保存稳定化剂，其中，所述聚合物为聚乙烯吡咯烷酮。
[8]根据[2]或[7]所述的保存稳定化剂，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的费肯歇尔K值为5～140。
[9]根据[2]、[7]及[8]中任一项所述的保存稳定化剂，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为1,000～3,000,000。
[10]一种细胞外囊泡的保存稳定化方法，其包含在具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物的存在下对细胞外囊泡进行冷冻保存的步骤而成。
[11]根据[10]所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物或聚乙烯吡咯烷酮。
[12]根据[10]所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物。
[13]根据[11]或[12]所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述共聚物的所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.1～1：3。
[14]根据[11]至[13]中任一项所述的保存稳定化方法，其中，所述共聚物的费肯歇尔K值为5～50。
[15]根据[11]至[14]中任一项所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述共聚物的重均分子量为3,000～250,000。
[16]根据[10]所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚合物为聚乙烯吡咯烷酮。
[17]根据[11]或[16]所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的费肯歇尔K值为5～140。
[18]根据[11]、[16]及[17]中任一项所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为1,000～3,000,000。
发明效果
根据本发明的细胞外囊泡的保存稳定化剂及本发明的细胞外囊泡的保存稳定化方法，可将细胞外囊泡稳定地保存。
附图说明
图1A为表示实施例1及比较例1中进行的使用Kollidon(注册商标)VA64的胞外体保存稳定化试验的结果的图。
图1B为表示验证实验例1及实验例2中进行的胞外体保存稳定化试验前后的蛋白质浓度变化的结果的图。
图1C为表示验证实验例3及实验例4中进行的胞外体保存稳定化试验前后的粒子数变化的结果的图。
图1D为表示验证实施例2及比较例2中进行的胞外体保存稳定化试验前后的粒子数变化的电子显微镜的观察图像。
图2为表示实施例3及比较例3中进行的使用源自COLO201细胞培养上清液的胞外体的保存稳定化试验的结果的图。
图3为表示实施例3及比较例3中进行的使用源自间充质干细胞(MSC)培养上清液的胞外体的保存稳定化试验的结果的图。
图4为表示实施例3及比较例3中进行的使用源自血清的胞外体的保存稳定化试验的结果的图。
图5为表示实施例3及比较例3中进行的使用源自血浆的胞外体的保存稳定化试验的结果的图。
图6为表示通过稳定化试验验证实施例4中进行的冷冻温度(-80℃)对胞外体的保存稳定化的影响的结果的图。
图7为表示通过稳定化试验验证实施例4中进行的冷冻温度(-20℃)对胞外体的保存稳定化的影响的结果的图。
图8为表示通过稳定化试验验证实施例5中进行的冷冻融解操作次数对胞外体的保存稳定化的影响的结果的图。
图9为表示通过电子显微镜观察验证实施例6中进行的冷冻融解操作次数对胞外体的保存稳定化的影响的结果的图。
图10为表示比较例4及比较例5中进行的使用海藻糖的胞外体保存稳定化试验的结果的图。
图11为表示实施例7-8及比较例6中进行的使用Kollidon(注册商标)12PF或17PF的保存稳定化试验的结果的图。
具体实施方式
本发明的保存稳定化是指能够在维持细胞外囊泡的生理活性的状态下进行保存。具体地说，可列举例如降低由于冷冻保存细胞外囊泡引起的对细胞外囊泡生理活性的不良影响。该不良影响可列举例如细胞囊泡的粒子数减少、构成细胞外囊泡的脂质或存在于膜表面的蛋白质、内包于细胞外囊泡的蛋白质或肽、核酸等因保存时的温度等外在因素而发生变性或经时变化所引起的活性丧失等。
细胞外囊泡的生理活性例如可通过以下方法等进行确认：测定CD9、CD63、CD81等存在于细胞外囊泡的膜表面的标记蛋白质的活性；通过NTA(Nano Tracking Analysis，纳米追踪分析)法测定细胞外囊泡的粒子数；通过电子显微镜观察细胞外囊泡的粒子数或形状等状态；通过蛋白质组学分析测定蛋白质或肽的数量。
<本发明的细胞外囊泡的保存稳定化剂>
本发明的细胞外囊泡的保存稳定化剂(以下有时也简称为本发明的保存稳定化剂)为由包含具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物而成的细胞外囊泡的保存稳定化剂。根据本发明的保存稳定化剂，可将细胞外囊泡稳定地冷冻保存。
作为本发明的保存稳定化剂中使用的聚合物(以下有时也简称为本发明的聚合物)，只要是具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元者即可，可为均聚合物(聚乙烯吡咯烷酮)，也可为共聚物。作为所述共聚物，可列举例如包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物，更优选仅由源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元构成的共聚物。
作为本发明的聚合物，出于稳定细胞外囊泡的效果高的理由，优选包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物，更优选仅由源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元构成的共聚物。另外，作为本发明的聚合物，出于可作为生物相容性材料使用的理由，聚乙烯吡咯烷酮是有用的。
这些本发明的聚合物可单独使用1种，也可混合使用2种以上，优选单独使用1种。此外，包含源自聚合引发剂的结构等伴随聚合反应所附加的结构单元的聚合物也包含在本发明的聚合物中。即，对于均聚合物(聚乙烯吡咯烷酮)或仅由源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元构成的共聚物，作为单体单元，仅由所述2个单体单元构成，但也可包含源自聚合引发剂的结构等伴随聚合反应所附加的单体单元以外的结构单元。
本发明的聚合物的费肯歇尔K值并无特别限制，例如为5～140，优选为6～100，更优选为7～40。费肯歇尔K值为与分子量相关的粘性特性值，是将利用毛细管粘度计测定的相对粘度值(25℃)应用于下述费肯歇尔式(1)所计算的数值。
[数学式1]
Figure BDA0003309598090000061
式(1)中，ηrel为聚合物水溶液相对于水的相对粘度，c为聚合物水溶液中的聚合物浓度(％[w/v])。
本发明的聚合物的重均分子量并无特别限制，例如为1,000～3,000,000，优选为1,000～2,000,000，更优选为1,000～150,000。
所述共聚物中的所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比并无特别限制，例如为1：0.1～1：3，优选为1：0.2～1：2，更优选为1：0.3～1：1，进一步优选为1：0.4～1：1。
所述共聚物的费肯歇尔K值并无特别限制，例如为5～50，优选为10～45，更优选为15～40，进一步优选为20～40。
所述共聚物的重均分子量并无特别限制，例如为3,000～250,000，优选为5,000～200,000，更优选为10,000～150,000，进一步优选为20,000～100,000，特别优选为30,000～80,000。
作为所述共聚物，可列举例如所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.1～1：3且所述共聚物的费肯歇尔K值为5～50或/及重均分子量为3,000～250,000的共聚物，优选所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.2～1：2且所述共聚物的费肯歇尔K值为10～45或/及重均分子量为5,000～200,000的共聚物，更优选所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.3～1：1且所述共聚物的费肯歇尔K值为15～40或/及重均分子量为10,000～150,000的共聚物，进一步优选所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.4～1：1且所述共聚物的费肯歇尔K值为20～40或/及重均分子量为20,000～100,000的共聚物，特别优选所述共聚物中所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.4～1：1且所述共聚物的费肯歇尔K值为20～40或/及重均分子量为30,000～80,000的共聚物。
作为所述共聚物，可列举例如所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为6：4的Kollidon(注册商标)VA64(BASF公司制)。Kollidon(注册商标)VA64的费肯歇尔K值为25.2～30.8，重均分子量为45,000～70,000。
所述聚乙烯吡咯烷酮的费肯歇尔K值并无特别限制，例如为5～140，优选为6～100，更优选为7～40，进一步优选为8～30，特别优选为9～20。
所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量并无特别限制，例如为1,000～3,000,000，优选为1,000～2,000,000，更优选为1,000～100,000，进一步优选为1,000～40,000，特别优选为1,500～15,000。
作为所述聚乙烯吡咯烷酮，可列举例如费肯歇尔K值为5～140且重均分子量为1,000～3,000,000的聚乙烯吡咯烷酮，优选费肯歇尔K值为6～100且重均分子量为1,000～2,000,000的聚乙烯吡咯烷酮，更优选费肯歇尔K值为7～40且重均分子量为1,000～100,000的聚乙烯吡咯烷酮，进一步优选费肯歇尔K值为8～30且重均分子量为1,000～40,000的聚乙烯吡咯烷酮，特别优选费肯歇尔K值为9～20且重均分子量为1,500～15,000的聚乙烯吡咯烷酮。
作为所述聚乙烯吡咯烷酮，可列举例如Kollidon(注册商标)12PF(分子量为2,000～3,000、K值为10.2～13.8)、Kollidon(注册商标)17PF(分子量为7,000～11,000、K值为15.3～18.0)、Kollidon(注册商标)25(分子量为28,000～34,000、K值为22.5～27.0)、Kollidon(注册商标)30(分子量为44,000～54,000、K值为27.0～32.4)、Kollidon(注册商标)90F(分子量为1,000,000～1,500,000、K值为81.0～96.3)、PVP K-120(分子量为2,100,000～3,000,000、K值为110～130)等，优选Kollidon(注册商标)12PF、Kollidon(注册商标)17PF、Kollidon(注册商标)25、Kollidon(注册商标)30、Kollidon(注册商标)90F，更优选Kollidon(注册商标)12PF、Kollidon(注册商标)17PF、Kollidon(注册商标)25、Kollidon(注册商标)30，进一步优选Kollidon(注册商标)12PF、Kollidon(注册商标)17PF、Kollidon(注册商标)25，特别优选Kollidon(注册商标)12PF、Kollidon(注册商标)17PF。
所述本发明的保存稳定化剂除了本发明的聚合物之外，也可含有水系溶剂。作为所述水系溶剂，可列举水；磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、古德缓冲液(Good's buffers)(例如HEPES缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液)等缓冲液；生理盐水。另外，所述水系溶剂还可进一步包含增敏剂、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠、水杨酸、苯甲酸等)、稳定化剂(例如白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、赋活剂等其它在该领域中使用的、不阻碍本发明的聚合物或本发明的细胞外囊泡的稳定性、或者不阻碍本发明的聚合物对细胞外囊泡的保存稳定化效果的物质，适当选择通常在该领域中使用的浓度范围等进行使用即可。
所述本发明的保存稳定化剂中的本发明的聚合物的浓度通常为0.005～20％(w/v)，优选为0.01～15％(w/v)，更优选为0.05～10％(w/v)。
所述本发明的保存稳定化剂中，pH值通常为5～10，优选为5.5～9.5，更优选为5～9。
<本发明的细胞外囊泡>
本发明的细胞外囊泡为源自细胞、由脂质双层膜构成的小型膜囊泡。该细胞外囊泡通常可列举具有20nm～1000nm直径者，优选为50nm～800nm者，更优选为50nm～500nm者，特别优选为50nm～200nm者。作为本发明的细胞外囊泡，可列举例如Nature ReviewsImmunology 9,581-593(August 2009)、《肥胖研究》Vol.13No.2 2007主题青木直人等所记载的那样，根据其发生起源或小型膜囊泡的大小等分类为各式各样者。具体地说，可列举胞外体、微囊泡、核外颗粒体、膜粒子、类胞外体囊泡、凋亡小体、脂肪体(adiposome)等。
本发明的保存稳定化剂对这些中的胞外体、微囊泡是更有用的，对胞外体是特别有用的。
所述胞外体为源自细胞、由脂质双层膜构成的小型膜囊泡，可列举例如具有50nm～200nm直径者，优选为50nm～150nm者，更优选为50nm～100nm者。此外，胞外体被认为是源自晚期胞内体。
所述微囊泡为源自细胞、由脂质双层膜构成的小型膜囊泡，可列举例如具有100nm～1000nm直径者，优选为100nm～800nm者，更优选为具有100nm～500nm直径者。此外，微囊泡被认为是源自细胞膜。
本发明的细胞外囊泡可含有在生物体试样中，也可以是从生物体试样中分离者，优选是从生物体试样中分离者。
生物体试样只要可含有本发明的细胞外囊泡者即可，并无特别限制。作为生物体试样，可列举例如体液试样、细胞的培养上清液、细胞萃取液，优选为体液试样及细胞的培养上清液。作为体液试样，可列举例如血液、血清、血浆等血液来源试样，尿、血沉棕黄层、唾液、精液、胸部滲出液、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴液、腹水、胸水、羊水、膀胱冲洗液、支气管肺泡冲洗液等在临床检查领域中使用的体液试样，优选为血液来源试样。作为细胞的培养上清液，可列举例如将COLO201细胞或MM1细胞、BLCL21细胞、U87 MG细胞、SK-N-SH细胞、HCT116细胞、PC3细胞、BPH-1细胞、DAUDI细胞、A549细胞、K562细胞、iPS细胞、间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞、脐静脉内皮细胞、T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞依照常规方法进行培养而得到的培养上清液。作为细胞萃取液，可列举例如将COLO201细胞或MM1细胞、BLCL21细胞、U87 MG细胞、SK-N-SH细胞、HCT116细胞、PC3细胞、BPH-1细胞、DAUDI细胞、A549细胞、K562细胞、iPS细胞、间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞、脐静脉内皮细胞、T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞依照常规方法进行粉碎、萃取而得到的萃取液。
生物体试样例如可为从动物直接采集者，也可为进行了回收、浓缩、纯化、分离、利用缓冲液等的稀释、过滤灭菌等前处理者。这些前处理只要依照在该领域中使用的常规方法适当进行即可。动物只要是可含有细胞外囊泡的动物即可，并无特别限制，可列举例如人、大鼠、小鼠、兔子、牛、山羊、马、猪、狗、猫、仓鼠、驴、豚鼠，优选为人。
作为从生物体试样分离细胞外囊泡的方法，只要依照常规方法进行即可，并无特别限制。作为从生物体试样分离细胞外囊泡的方法，可列举例如亲和法(例如PS亲和法)、分级离心分离法(例如离子沉降法、蔗糖垫层法、密度梯度离心法等超离心法)、免疫沉降法、色谱法(例如离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法)、密度梯度法(例如蔗糖密度梯度法)、电泳法(例如细胞器电泳法)、磁分离法(例如磁性活化细胞分选(MACS)法)、超滤浓缩法(例如纳米膜超滤浓缩法)、Percoll梯度分离法、利用了微流体设备的方法、PEG沉淀法等，优选可获得高纯化度的细胞外囊泡的亲和法、可不偏离理论地进行回收的分级离心分离法，更优选为亲和法、超离心法，特别优选为亲和法。亲和法中优选为PS亲和法。亲和法及分级离心分离法只要以例如日本特开2016-088689中记载的方法为基准进行即可。
这些分离方法可只使用1种、也可组合2种以上。另外，还可将利用1种分离方法的分离重复操作2次以上。
本发明的保存稳定化剂用于在本发明的保存稳定化剂的存在下保存本发明的细胞外囊泡的方法。本发明的细胞外囊泡的保存只要依照细胞外囊泡保存的常规方法进行即可。根据本发明的保存稳定化剂，可稳定地保存本发明的细胞外囊泡。
<本发明的细胞外囊泡的保存稳定化方法>
本发明的细胞外囊泡的保存稳定化方法(以下有时简称为“本发明的保存稳定化方法”)是包含在具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物(本发明的聚合物)的存在下、冷冻保存细胞外囊泡的步骤而成的细胞外囊泡的保存稳定化方法。
即，本发明的保存稳定化方法是使本发明的聚合物与细胞外囊泡接触、在本发明的聚合物的存在下冷冻保存细胞外囊泡的方法。
具体地说是通过使本发明的聚合物与细胞外囊泡接触而制备含有本发明的聚合物及细胞外囊泡的保存溶液(以下有时简称为本发明的保存溶液)、冷冻保存该保存溶液的方法。
本发明的保存稳定化方法中，具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物与前述的<本发明的细胞外囊泡的保存稳定化剂>一项中描述的相同，具体例及优选例也相同。
另外，本发明的保存稳定化方法中使用的细胞外囊泡与前述的<本发明的细胞外囊泡>一项中描述的相同，具体例及优选例也相同。
作为本发明的保存溶液的制备方法，只要是最终可获得含有本发明的聚合物及细胞外囊泡的溶液的方法即可，并无特别限制。本发明的保存溶液的制备方法具体地可列举将包含水系溶剂的本发明的保存稳定化剂与含有生物体试样或细胞外囊泡的溶液进行混合的方法、将包含水系溶剂的本发明的保存稳定化剂与细胞外囊泡进行混合的方法、或将本发明的聚合物与含有生物体试样或细胞外囊泡的溶液进行混合的方法，优选为将包含水系溶剂的本发明的保存稳定化剂与含有生物体试样或细胞外囊泡的溶液进行混合的方法。
作为所述包含水系溶剂的本发明的保存稳定化剂，与前述的<本发明的细胞外囊泡的保存稳定化剂>一项中描述的相同，优选例也相同。
作为所述含有细胞外囊泡的溶液中的溶剂，优选为水系溶剂。作为所述水系溶剂，可列举例如水；磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、古德缓冲液(例如HEPES缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液)等缓冲液；生理盐水。另外，所述水系溶剂还可进一步包含增敏剂、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠、水杨酸、苯甲酸等)、稳定化剂(例如白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、赋活剂等其他在该领域中使用的、不阻碍本发明的聚合物或本发明的细胞外囊泡的稳定性、或者不阻碍本发明的聚合物对细胞外囊泡的保存稳定化效果的物质，适当选择通常在该领域中使用的浓度范围等进行使用即可。
含有所述细胞外囊泡的溶液的pH通常为5～10，优选为5.5～9.5，更优选为5～9。
本发明的保存溶液中的本发明聚合物的浓度并无特别限制，例如为0.0001～10％(w/v)，优选为0.00025～5％(w/v)，更优选为0.0005～2.5％(w/v)，进一步优选为0.001～1％(w/v)，特别优选为0.0025～0.5％(w/v)。
本发明的保存溶液的每单位体积的细胞外囊泡的粒子数并无特别限制，例如为2×105～2×1016(粒子/mL)，优选为2×105～2×1015(粒子/mL)，更优选为2×106～2×1014(粒子/mL)。
本发明的保存溶液的制备时的温度、换而言之为使本发明的聚合物与细胞外囊泡接触时的温度通常为2℃～42℃，优选为2℃～40℃，更优选为2℃～37℃。
使本发明的聚合物与细胞外囊泡接触的时间通常为1秒钟～30分钟，优选为1秒钟～20分钟，更优选为1秒钟～10分钟。
本发明的保存溶液的pH通常为5～10，优选为5.5～9.5，更优选为5～9。
本发明的保存稳定化方法中，冷冻保存本发明的保存溶液时的温度并无特别限制，例如为-2℃～-150℃，优选为-5℃～-150℃，更优选为-10℃～-150℃。
本发明的保存稳定化方法中，本发明的保存溶液的保存期间(在冷冻保存所述本发明的保存溶液时的温度下、保存本发明的保存溶液的期间)并无特别限制，例如为1秒钟～5年，优选为5分钟～2年。
本发明的保存稳定化方法例如如下进行即可。
首先，依照常规方法从生物体试样分离细胞外囊泡，获得含有细胞外囊泡的水或缓冲液等溶液(pH例如为5～10，优选为5.5～9.5，更优选为5～9)。接着，将另外制备的含有本发明聚合物的水或缓冲液等溶液(pH例如为5～10，优选为5.5～9.5，更优选为5～9)添加于含有生物体试样或所述细胞外囊泡的溶液，在例如2℃～42℃，优选为2℃～40℃，更优选为2℃～37℃下接触(混合)例如1秒钟～30分钟，优选为1秒钟～20分钟，更优选为1秒钟～10分钟。由此获得含有例如0.0001～10％(w/v)，优选为0.00025～5％(w/v)，更优选为0.0005～2.5％(w/v)，进一步优选为0.001～1％(w/v)，特别优选为0.0025～0.5％(w/v)浓度的本发明的聚合物及例如2×105～2×1016(粒子/mL)、优选为2×105～2×1015(粒子/mL)、更优选为2×106～2×1014浓度(本发明保存溶液的每单位体积的细胞外囊泡的粒子数)的细胞外囊泡的保存溶液(pH例如为5～10，优选为5.5～9.5，更优选为5～9)。
接着，将获得的保存溶液(即本发明聚合物的共存下的细胞外囊泡)在例如-2℃～-150℃，优选为-5℃～-150℃，更优选为-10℃～-150℃下冷冻保存例如1秒钟～5年、优选为5分钟～2年。
根据本发明的保存稳定化剂及保存稳定化方法，可稳定地冷冻保存本发明的细胞外囊泡。更具体地说，根据本发明的保存稳定化剂及保存稳定化方法，即使在冷冻保存本发明的细胞外囊泡时，与未使用本发明的稳定化剂的情况相比，可以显著地降低经冷冻保存的本发明的细胞外囊泡的粒子数减少。另外，根据本发明的保存稳定化剂及保存稳定化方法，与未使用本发明的稳定化剂的情况相比，可在保持存在于本发明细胞外囊泡的膜表面的标记蛋白质活性的情况下进行冷冻保存。
本发明中，将经冷冻保存的本发明的保存溶液融解时的融解温度及融解时间只要是可将细胞外囊泡融解的温度及时间即可，并无特别限制，融解温度例如为2℃～42℃，优选为2℃～40℃，更优选为2℃～37℃，融解时间例如为1秒钟～180分钟，优选为30秒钟～120分钟，更优选为1分钟～60分钟。
另外，本发明的保存溶液的冷冻融解次数(具体地说是进行冷冻融解的次数)并无特别限制，例如为1次～50次，优选为1次～20次。
本发明的保存溶液的融解方法具体地说可通过将如上所述进行了冷冻保存的本发明的保存溶液在例如2℃～42℃、优选为2℃～40℃、更优选为2℃～37℃下融解例如1秒钟～180分钟、优选为30秒钟～120分钟、更优选为1分钟～60分钟来进行。
根据本发明的保存稳定化方法，所述的冷冻及融解可反复进行例如1次～50次，优选反复进行1次～20次。
即，本发明的保存稳定化方法也可以说是本发明的细胞外囊泡的冷冻及融解中的细胞外囊泡的保存稳定化方法。同样，本发明的保存稳定化剂也可以说是本发明的细胞外囊泡针对冷冻及融解的保存稳定化剂。
产业上的可利用性
本发明的保存稳定化剂及保存稳定化方法由于能够稳定地保存细胞外囊泡，因此在使用了细胞外囊泡的诊断或医药品领域中是有用的。
实施例
以下，以实施例及比较例为基础对本发明具体地进行说明，但本发明不受这些例子的任何限定。
<实施例1.使用了Kollidon(注册商标)VA64的胞外体的保存稳定化试验>
使用源自COLO201细胞的胞外体验证Kollidon(注册商标)VA64的冷冻保存胞外体时的保存稳定化效果。测定条件的详细情况示于表1。
(1)胞外体的获取
使用Expi293(注册商标)表达培养基(Expression Medium)(ThermoFisherSCIENTIFIC公司制)培养COLO201细胞(由JCRB细胞库分售)96小时，获得培养上清液。从所得的COLO201细胞培养上清液10mL中，使用MagCapture(注册商标)胞外体分离试剂盒PS(Exosome Isolation Kit PS)(富士胶片和光纯药株式会社制)，依照该试剂盒附带的说明书记载的顺序纯化胞外体，在含有1mM EDTA的1×Tris缓冲液(pH7.4)中获得胞外体。有时将所获得的溶液简称为“胞外体纯化溶液”。
(2)胞外体的冷冻保存
将所获得的胞外体纯化溶液在4℃下孵育16小时。接着，制备5％(w/v)Kollidon水溶液(Kollidon(注册商标)VA64(BASF公司制)、大塚蒸馏水(大塚制药株式会社制))。在孵育后的胞外体纯化溶液中，以成为终浓度0.05％(w/v)的方式添加5％(w/v)Kollidon水溶液。有时将所得溶液简称为“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”。
接着，使用所得的含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液，在“-80℃下冷冻5分钟后在室温下融解5分钟”的条件下，反复进行冷冻融解操作20次。有时将所得的冷冻融解后的溶液简称为“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”。
(3)保存稳定化效果的验证
使用PS Capture(注册商标)胞外体ELISA试剂盒(链霉亲和素(Streptavidin)HRP)(富士胶片和光纯药株式会社制，含有抗CD63抗体)，依照该试剂盒附带的说明书所记载的顺序，对“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”中含有的作为胞外体标记的CD63进行测定，求出吸光度。
另外，通过生物素标记用试剂盒-SH(LK10，同仁化学研究所株式会社制)对抗CD9单克隆抗体(30B)(富士胶片和光纯药株式会社制)或抗CD81单克隆抗体(17B1)(011-27773，富士胶片和光纯药株式会社制)进行生物素标记。使用所得的标记抗体替代抗CD63抗体，通过相同的方法测定作为胞外体标记的CD9及CD81，分别求出吸光度。
进而，作为对照，使用“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”替代“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”，通过相同的方法测定CD63、CD9及CD81，分别求出吸光度。
由吸光度，算出每个胞外体标记的以“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”的吸光度为100[％]时的各个溶液的吸光度的相对值[％]。有时将所算出的值简称为“信号值”。
(4)结果
将信号值的结果示于图1A的图表中。图1A中，横轴表示Kollidon(注册商标)VA64的有无及所测定的胞外体标记的种类，Kollidon+表示实施例1的结果，Kollidon-表示后述比较例1的结果。纵轴表示信号值。
<比较例1.胞外体的保存稳定化试验>
依照表1所记载的条件，除了不在孵育后的胞外体纯化溶液中添加5％(w/v)Kollidon水溶液以外，通过与实施例1相同的方法进行测定，算出冷冻保存后的胞外体溶液的信号值[％]。
将信号值的结果示于图1A中。图中，Kollidon-表示比较例1的结果。
由图1A的图表，将未添加Kollidon(注册商标)VA64的仅胞外体溶液冷冻保存时(比较例1)，冷冻保存后的信号值与冷冻保存前的信号值相比，在任一种胞外体标记中均显著降低。另一方面，含有Kollidon(注册商标)VA64进行冷冻保存时(实施例1)，在任一种胞外体标记中，冷冻保存前后的信号值均几乎没有变化，即便是冷冻保存后，也都保持了胞外体标记的活性。即显示了，作为胞外体标记的CD63、CD9、CD81(四跨膜蛋白(Tetraspanin))均保持着能够与针对它们的各抗体结合的状态。
由这些结果判定，具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物在冷冻保存细胞外囊泡时，具有使细胞外囊泡保存稳定化的效果。
<实验例1.胞外体的保存稳定化试验前后的蛋白质浓度的变化>
为了确认细胞外囊泡的冷冻保存前后的相对信号值的变动不是因细胞外囊泡吸附于试样管所引起的，使用蛋白质检测BCA试剂盒(富士胶片和光纯药公司制)，分别利用BCA蛋白质检测测定实施例1中的“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”及“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”的蛋白质浓度。具体地说，在该试剂盒附带的蛋白质检测BCA试剂A中添加1/50量[v/v]该试剂盒附带的蛋白质检测BCA试剂B，制备混合液。将该混合液200μL及“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”或“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”25μL在NUNC 96孔板平面板(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司制)中分别混合，在60℃条件下孵育30分钟。之后，使用读板机分别测定孵育后的溶液的562nm吸光度，从吸光度分别算出“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”及“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”的蛋白质浓度。
将结果示于图1B中。图1B中，横轴表示Kollidon(注册商标)VA64的有无，Kollidon+表示实验例1的结果，Kollidon-表示后述实验例2的结果。纵轴表示测得的溶液中的蛋白质浓度[ng/μL]。
<实验例2.胞外体保存稳定化试验前后的蛋白质浓度的变化>
通过与实验例1相同的方法，测定比较例1中冷冻保存前的胞外体溶液及冷冻保存后的胞外体溶液的蛋白质浓度。测定条件的详细情况示于表1。将结果示于图1B。Kollidon-表示实验例2的结果。
由图1B判定，不论是否使用Kollidon(注册商标)VA64，冷冻保存前后的胞外体溶液中的蛋白质浓度均无变化。由图1A及图1B的结果确认了，细胞外囊泡的冷冻保存前后的信号值变动不是因细胞外囊泡吸附于试样管所引起的。
<实验例3.胞外体保存稳定化试验前后的粒子数的变化>
使用NanoSight(Malvern Panalytical公司制)，通过纳米粒子追踪分析法(NanoTracking Analysis法)，依照NanoSight说明书中记载的顺序分别测定3次实施例1的“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”及“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”的每单位体积的粒子数，算出每单位体积的平均粒子数[粒子/mL]。
将结果示于图1C。图1C中，横轴表示Kollidon(注册商标)VA64的有无，Kollidon+表示实验例3的结果，Kollidon-表示后述实验例4的结果。纵轴表示所测得的溶液中的粒子数[×1011粒子/mL]。
<实验例4.胞外体保存稳定化试验前后的粒子数的变化>
通过与实验例3相同的方法，测定比较例1中冷冻保存前的胞外体溶液及冷冻保存后的胞外体溶液的每单位体积的粒子数，算出每单位体积的平均粒子数[粒子/mL]。
将结果示于图1C。Kollidon-表示实验例4的结果。
由图1C，在未添加Kollidon(注册商标)VA64而仅冷冻保存了胞外体溶液时(实验例4)，在冷冻保存后粒子数显著减少。另一方面，含有Kollidon(注册商标)VA64进行冷冻保存时(实验例3)，在冷冻保存前后，粒子数几乎没有变化。
<实施例2.胞外体保存稳定化试验前后的粒子数的变化>
为了验证是因细胞外囊泡的冷冻保存而使粒子数有所减少，使用透射型电子显微镜(TEM)对实施例1中的“含有稳定化剂-冷冻保存前的胞外体溶液”及“含有稳定化剂-冷冻保存后的胞外体溶液”进行分析。图1D表示通过透射型电子显微镜观察到的图像。图1D中，Kollidon+表示实施例2的结果，Kollidon-表示后述比较例2的结果。
<比较例2.胞外体保存稳定化试验前后的粒子数的变化>
通过与实施例2相同的方法，使用透射型电子显微镜(TEM)对比较例1中冷冻保存前的胞外体溶液及冷冻保存后的胞外体溶液进行分析。将由透射型电子显微镜观察到的图像示于图1D。
由图1D，未添加Kollidon(注册商标)VA64而仅冷冻保存了胞外体溶液时(比较例2)，在冷冻保存后观察到粒子减少的样子。另一方面，含有Kollidon(注册商标)VA64进行冷冻保存时(实施例2)，冷冻保存前后未观察到有大的变化。
由图1C及图1D判定，具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物在对细胞外囊泡进行冷冻保存时、具有在基本保持粒子数的状态下使细胞外囊泡保存稳定化的效果。
另外，由图1B～图1D判定，细胞外囊泡冷冻保存前后的信号值变动的原因并非是由于细胞外囊泡吸附于样品管，而是由于细胞外囊泡的粒子数的减少。
<实施例3.使用源自各种试样的胞外体的保存稳定化试验>
研究利用Kollidon(注册商标)VA64所获得的使胞外体冷冻保存时的保存稳定化效果对源自各种试样的胞外体是否都有效。即，分别使用通过与实施例1相同的方法获得的COLO201细胞培养上清液1mL、通过与实施例1相同的方法培养间充质干细胞(MSC)(龙沙(Lonza)公司制)获得的间充质干细胞培养上清液1mL、血清(Bizcom Japan公司制)1mL及血浆(Bizcom Japan公司制)1mL作为试样，进行探讨。
具体地说，依照表1记载的条件，根据实施例1记载的方法测定吸光度，算出信号值。此外，通过与实验例3相同的方法测定所用试样的每单位体积的粒子数，结果为，COLO201细胞培养上清液的每单位体积的粒子数为2×1010粒子/mL，间充质干细胞培养上清液的每单位体积粒子数为2×109粒子/mL，血清的每单位体积的粒子数为2×1010粒子/mL，血浆的每单位体积的粒子数为6×1010粒子/mL。
将信号值的结果分别示于图2～图5中。图2为使用源自COLO201细胞的胞外体时的结果，图3为使用源自间充质干细胞(MSC)的胞外体时的结果，图4为使用源自血清的胞外体时的结果，图5为使用源自血浆的胞外体时的结果。图中，横轴表示Kollidon(注册商标)VA64的有无及冷冻融解操作的次数，Kollidon+表示实施例3的结果，Kollidon-表示后述比较例3的结果。
纵轴表示信号值[％]。
<比较例3.使用源自不同试样的胞外体的保存稳定化试验>
根据表1记载的条件，除了不进行将5％(w/v)Kollidon水溶液添加至孵育后的胞外体纯化溶液的操作以外，通过与实施例3相同的方法，算出冷冻保存后的胞外体溶液的信号值[％]。
将信号值的结果分别示于图2～图5。图中，Kollidon-表示比较例3的结果。
由图2至图5的图表可知，与使用源自COLO201细胞的胞外体的情况(图2)相同，使用源自间充质干细胞(MSC)的胞外体时(图3)、使用源自血清的胞外体时(图4)、使用源自血浆的胞外体时(图5)的任一情况中，当使用Kollidon(注册商标)VA64时，则冷冻保存前后的信号值均几乎没有变化。
由这些结果判定，具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物不论细胞外囊泡的来源是什么，在对细胞外囊泡进行冷冻保存时，均具有使细胞外囊泡稳定化的效果。
<实施例4.冷冻温度对胞外体保存稳定化的影响>
验证胞外体的冷冻温度对Kollidon(注册商标)VA64所带来的冷冻保存胞外体时的保存稳定化效果所产生的影响。即，使冷冻温度为-80℃或-20℃来进行探讨。
具体地说，根据表1记载的条件，根据实施例1记载的方法测定吸光度，算出信号值。将信号值的结果分别示于图6及图7的图表中。图6为在-80℃下冷冻保存时的结果，图7为在-20℃下冷冻保存时的结果。图中，Kollidon+表示实施例4的结果，Kollidon-表示后述比较例4的结果。横轴表示冷冻融解操作的次数及所检测的胞外体标记的种类。纵轴表示信号值[％]。
由图6及图7的图表，在-20℃及-80℃的任一个冷冻温度下，对于作为胞外体标记的CD9及CD63的任一种而言，在冷冻保存前后、信号值均几乎没有变化。
由这些结果判定，具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物不论细胞外囊泡的冷冻温度是多少，在将细胞外囊泡冷冻保存时，均具有使细胞外囊泡稳定化的效果。
<实施例5.冷冻融解操作的次数对胞外体保存稳定化造成的影响>
对于Kollidon(注册商标)VA64所带来的的冷冻保存胞外体时的保存稳定化效果，验证冷冻温度为-20℃时、冷冻融解操作的次数所造成的影响。即，使冷冻温度为-20℃、使冷冻融解操作次数为15次来进行探讨。具体地说，依照表1记载的条件，根据实施例1记载的方法测定吸光度，算出信号值。
将信号值的结果分别示于图8。图中，横轴表示冷冻融解操作的次数及所检测的胞外体标记的种类。纵轴表示信号值[％]。
<实施例6.冷冻融解操作次数对胞外体保存稳定化造成的影响>
对于Kollidon(注册商标)VA64所带来的的冷冻保存胞外体时的保存稳定化效果，验证冷冻融解操作的次数所造成的影响。即，使用透射型电子显微镜(TEM)分析实施例5中使冷冻融解操作次数进行15次后的胞外体。另外，作为对照，对于进行冷冻融解操作前的胞外体也通过相同的方法进行观察。图9表示利用透射型电子显微镜观察到的图像。图中，上图为进行冷冻融解操作前(0次)的观察图像，下图为进行冷冻融解操作15次后的观察图像。
由图8的图表，即使使冷冻温度为-20℃、进行冷冻融解操作15次时，在任一种的胞外体标记中，冷冻保存前后的信号值均几乎没有变化。
另外，由利用图9的电子显微镜观察到的图像，使用Kollidon(注册商标)VA64、在-20℃下进行细胞外囊泡的冷冻融解操作15次时，在冷冻保存前后未观察到形状的变化、粒子数也基本得以保持。
由以上的结果判定，具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物不论细胞外囊泡的冷冻操作次数为多少，在冷冻保存细胞外囊泡时，均具有使细胞外囊泡稳定化的效果。
<比较例4.使用了海藻糖的胞外体的保存稳定化试验>
海藻糖在胞外体的冷冻保存中通过抑制胞外体的凝集而保持粒子数，由此教示了可保护胞外体免受因冷冻保存造成的伤害而使其稳定化(非专利文献1)。于是，验证了是否与本发明的稳定化剂相同、海藻糖不仅可抑制冷冻保存时的粒子数减少、还可保持胞外体标记(胞外体的表面抗原)的活性。
(1)胞外体的获取
通过与实施例1相同的方法，从COLO201细胞的培养上清液纯化胞外体，获取胞外体纯化溶液。
(2)胞外体的冷冻保存
将所得的胞外体纯化溶液在4℃下孵育16小时。接着，将海藻糖(富士胶片和光纯药株式会社制)溶解于大塚蒸馏水(大塚制药株式会社制)，制备500mM海藻糖水溶液。在孵育后的胞外体纯化溶液中，以终浓度成为25mM的方式添加500mM海藻糖水溶液。有时将所得的溶液简称为“含有海藻糖-冷冻保存前的胞外体溶液”。接着，使用添加有海藻糖的胞外体溶液，在-80℃下冷冻5分钟后在室温下融解5分钟的条件下，反复进行3次冷冻融解操作。有时将所得溶液简称为“含有海藻糖-冷冻保存后的胞外体溶液”。
(3)胞外体标记的吸光度测定
使用PS Capture(注册商标)胞外体ELISA试剂盒(链霉亲和素HRP)(富士胶片和光纯药株式会社制)，依照该试剂盒附带的说明书记载的顺序，由“含有海藻糖-冷冻保存前的胞外体溶液”测定作为胞外体标记的CD9，算出吸光度。但是，为了检测CD9，将抗CD9单克隆抗体(30B)(富士胶片和光纯药株式会社制)通过生物素标记用试剂盒-SH(LK10，同仁化学研究所株式会社制)进行了生物素标记者替代试剂盒中的抗CD63抗体来进行使用。
进而，作为对照，使用“含有海藻糖-冷冻保存后的胞外体溶液”替代“含有海藻糖-冷冻保存前的胞外体溶液”，通过相同的方法测定CD9，求得吸光度。
由吸光度算出每个胞外体标记的以“含有海藻糖-冷冻保存前的胞外体溶液”的吸光度为100[％]时的各个溶液的吸光度的相对值[％]。有时将算出的值简称为“信号值”。
(4)结果
将信号值的结果示于图10的图表中。图中，海藻糖+表示比较例4的结果，海藻糖-表示后述比较例5的结果。图10中，横轴表示海藻糖的有无。另外，纵轴表示信号值。
<比较例5.胞外体的保存稳定化试验>
依照表1记载的条件，除了不在孵育后的胞外体纯化溶液中添加500mM海藻糖水溶液以外，通过与比较例4相同的方法进行测定，算出信号值[％]。
将信号值的结果示于图10。图中，海藻糖-表示比较例5的结果。
由图10的图表，未添加海藻糖而仅将胞外体溶液冷冻保存时(比较例5)，冷冻保存后的信号值与冷冻保存前的信号值相比，在任一种胞外体标记中均显著降低。另一方面，即便是含有海藻糖进行冷冻保存时(比较例4)时，胞外体标记的信号值也显著降低。
由比较例4及比较例5的结果，虽然教示了海藻糖在胞外体的冷冻保存时会抑制粒子数减少，但判定，即使使用海藻糖，也不能保持胞外体标记(胞外体的表面抗原)的活性。
<实施例6.使用了Kollidon(注册商标)17PF的胞外体的保存稳定化试验>
使用Kollidon(注册商标)17PF及源自COLO201细胞的培养上清液的胞外体，验证聚乙烯吡咯烷酮的冷冻保存胞外体时的保存稳定化效果。
(1)胞外体的获取
通过与实施例1相同的方法，从COLO201细胞的培养上清液纯化胞外体，获取胞外体纯化溶液。
(2)胞外体的冷冻保存融解
将获得的胞外体纯化溶液于4℃下孵育16小时。接着，将巿售的作为聚乙烯吡咯烷酮的Kollidon(注册商标)17PF(BASF公司制)溶解于大塚蒸馏水中，制备10％(w/v)Kollidon 17PF水溶液。在孵育后的胞外体纯化溶液中，以终浓度成为0.1％的方式添加10％Kollidon(注册商标)17PF水溶液。有时将所得的溶液简称为“含有Kollidon(注册商标)17PF-冷冻融解冷冻保存前的胞外体溶液”。接着，对于使用添加有Kollidon(注册商标)17PF的胞外体溶液，在-80℃下冷冻5分钟、室温下融解5分钟、-80℃下冷冻5分钟后、室温下融解5分钟的条件下，冷冻融解3次。有时将所得溶液简称为“含有Kollidon(注册商标)17PF-冷冻融解冷冻保存后的胞外体溶液”。
(3)保存稳定化效果的验证
将“含有Kollidon(注册商标)17PF-冷冻融解冷冻保存后的胞外体溶液”作为测定试样，使用抗CD9抗体替代PS Capture(注册商标)胞外体ELISA试剂盒(链霉亲和素HRP)(富士胶片和光纯药株式会社制，含有抗CD63抗体)中的抗CD63抗体，除此以外，依照该试剂盒附带的说明书记载的顺序测定作为胞外体标记的CD9，获得吸光度。抗CD9抗体使用将抗CD9单克隆抗体(30B)(富士胶片和光纯药株式会社制)通过生物素标记用试剂盒-SH(LK10，同仁化学研究所株式会社制)进行了生物素标记者。另外，作为对照，使用“含有Kollidon(注册商标)17PF-冷冻融解冷冻保存前的胞外体溶液”，通过相同的方法分别测定CD9，获得吸光度。
由所得的吸光度算出将“含有Kollidon(注册商标)17PF-冷冻融解冷冻保存前的胞外体溶液”的吸光度作为100[％]时的各个溶液“含有Kollidon(注册商标)17PF-冷冻融解冷冻保存后的胞外体溶液”的吸光度的相对值[％](信号值)。
(4)结果
将信号值的结果示于图11的图表中。图11中，横轴表示Kollidon(注册商标)的种类及有无，纵轴分别表示信号值。图中，17PF+表示实施例6的结果。
<实施例7.使用Kollidon(注册商标)12PF的胞外体的保存稳定化试验>
除了使用“Kollidon(注册商标)12PF”替代“Kollidon(注册商标)17PF”以外，通过与实施例6相同的方法测定CD9，算出相对的信号值。相对的信号值的结果示于图11的图表中。图中，12PF+表示实施例7的结果。
<比较例6.冷冻融解对胞外体的稳定化造成的影响>
依照表1记载的条件，除了不在孵育后的胞外体纯化溶液中添加10％(w/v)Kollidon 12PF水溶液以外，通过与实施例6相同的方法进行测定，算出信号值[％]。将信号值的结果示于图11的图表中。图中，对照表示比较例6的结果。
由图11的图表，在未使用Kollidon(注册商标)17PF或Kollidon(注册商标)12PF而仅将胞外体溶液冷冻保存时(比较例6)，冷冻保存后的信号值与冷冻保存前的信号值相比，显著降低。
另一方面，与使用Kollidon(注册商标)VA64进行冷冻保存时相同，使用Kollidon(注册商标)17PF或Kollidon(注册商标)12PF进行冷冻保存时(实施例6、实施例7)，不论冷冻保存的次数为多少，在冷冻保存的前后，信号值均几乎没有变化。
由这些结果判定，聚乙烯吡咯烷酮在对细胞外囊泡冷冻保存时也具有使细胞外囊泡保存稳定化的效果。
将实施例1-8、比较例1-6及实验例1-4的实验条件及表示结果的图的编号一并示于下述表1中。
[表1]
Figure BDA0003309598090000241
<实施例8.胞外体的保存稳定化试验>
通过蛋白质组学分析验证Kollidon(注册商标)VA64在冷冻保存胞外体时的保存稳定化效果。
(1)胞外体的获取
通过与实施例1相同的方法，从COLO201细胞的培养上清液纯化胞外体，获取胞外体纯化溶液。
(2)胞外体的冷冻保存
将所得的胞外体纯化溶液于4℃下孵育16小时。接着，制备5％(w/v)Kollidon水溶液(Kollidon(注册商标)VA64(BASF公司制)、大塚蒸馏水(大塚制药株式会社制))。在孵育后的胞外体纯化溶液中，以终浓度成为0.05％(w/v)的方式添加5％(w/v)Kollidon水溶液。将所得的溶液于-80℃下冷冻8天后，在室温下融解10分钟。
(3)保存稳定化效果的验证
使用冷冻融解后的溶液，利用丙酮进行蛋白质沉淀处理，再通过丙酮进行洗涤。之后，利用胰蛋白酶进行水解处理，供至LC-MS/MS。以从MS/MS抽提的数值为基础、通过序列数据库检索来鉴定肽及蛋白质。
(4)结果
下述表2表示经鉴定的肽数及蛋白质数。表中，VA64表示Kollidon(注册商标)VA64。VA64添加表示实施例8的结果。
[表1]
试样名 肽鉴定数 蛋白质鉴定数
VA64添加 11166 1522
VA64未添加 7142 1194
<比较例7.冷冻融解对胞外体的保存稳定化造成的影响>
除了不在孵育后的胞外体纯化溶液中添加5％(w/v)Kollidon水溶液以外，通过与实施例8相同的方法进行蛋白质组学分析，鉴定冷冻融解后的溶液中含有的肽及蛋白质。
表2表示经鉴定的肽数及蛋白质数。VA64未添加表示比较例7的结果。
由表2，在使用Kollidon(注册商标)VA64进行胞外体的冷冻融解时(实施例8)，与仅将胞外体溶液冷冻融解时(比较例7)相比，肽数及蛋白质数更多。
由这些结果判定，具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物在将细胞外囊泡冷冻保存时，可以将细胞外囊泡所含有的蛋白质及肽稳定地保存。

Claims (18)

1.一种细胞外囊泡的保存稳定化剂，其包含具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物而成。
2.根据权利要求1所述的保存稳定化剂，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物、或聚乙烯吡咯烷酮。
3.根据权利要求1所述的保存稳定化剂，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物。
4.根据权利要求3所述的保存稳定化剂，其中，所述共聚物的所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.1～1：3。
5.根据权利要求3所述的保存稳定化剂，其中，所述共聚物的费肯歇尔K值为5～50。
6.根据权利要求3所述的保存稳定化剂，其中，所述共聚物的重均分子量为3,000～250,000。
7.根据权利要求1所述的保存稳定化剂，其中，所述聚合物为聚乙烯吡咯烷酮。
8.根据权利要求7所述的保存稳定化剂，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的费肯歇尔K值为5～140。
9.根据权利要求7所述的保存稳定化剂，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为1,000～3,000,000。
10.一种细胞外囊泡的保存稳定化方法，其包含在具有源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元的聚合物的存在下对细胞外囊泡进行冷冻保存的步骤而成。
11.根据权利要求10所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物或聚乙烯吡咯烷酮。
12.根据权利要求10所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚合物为包含源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元及源自乙酸乙烯酯的单体单元的共聚物。
13.根据权利要求12所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述共聚物的所述源自乙烯基吡咯烷酮的单体单元与所述源自乙酸乙烯酯的单体单元的构成比为1：0.1～1：3。
14.根据权利要求12所述的保存稳定化方法，其中，所述共聚物的费肯歇尔K值为5～50。
15.根据权利要求12所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述共聚物的均分子量为3,000～250,000。
16.根据权利要求10所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚合物为聚乙烯吡咯烷酮。
17.根据权利要求16所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的费肯歇尔K值为5～140。
18.根据权利要求16所述的细胞外囊泡的保存稳定化方法，其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为1,000～3,000,000。
CN202080029711.5A 2019-04-19 2020-04-16 细胞外囊泡的保存稳定化剂及保存稳定化方法 Pending CN113710794A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-080005 2019-04-19
JP2019080005 2019-04-19
PCT/JP2020/016738 WO2020213682A1 (ja) 2019-04-19 2020-04-16 細胞外小胞の保存安定化剤及び保存安定化方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113710794A true CN113710794A (zh) 2021-11-26

Family

ID=72837218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080029711.5A Pending CN113710794A (zh) 2019-04-19 2020-04-16 细胞外囊泡的保存稳定化剂及保存稳定化方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220033765A1 (zh)
EP (1) EP3957713A4 (zh)
JP (1) JP7394122B2 (zh)
KR (1) KR20210144848A (zh)
CN (1) CN113710794A (zh)
AU (1) AU2020259891B2 (zh)
WO (1) WO2020213682A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL431691A1 (pl) * 2019-10-31 2021-05-04 Uniwersytet Jagielloński Zastosowanie polielektrolitów jako krioprotektantów oraz sposób krioprezerwacji z ich użyciem
FR3126617A1 (fr) * 2021-09-06 2023-03-10 L'oreal compositions comprenant des vésicules extracellulaires, des biomolécules sécrétées et/ou des milieux conditionnés, et procédés pour les produire
US20230043556A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-09 L'oreal Compositions comprising extracellular vesicles, secreted biomolecules, and/or conditioned media, and methods of producing and using the same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060127375A1 (en) * 1998-05-26 2006-06-15 Lifecell Corporation Cryopreservation of human red blood cells
CN101287449A (zh) * 2002-04-11 2008-10-15 米迪缪尼疫苗股份有限公司 喷雾干燥保存生物活性材料
JP2018130085A (ja) * 2017-02-17 2018-08-23 Jsr株式会社 保存安定化剤、安定化方法、保存方法、添加剤、単離方法、及び回収効率改善剤
CN109355258A (zh) * 2018-11-02 2019-02-19 北京恩泽康泰生物科技有限公司 一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5178884A (en) * 1988-05-18 1993-01-12 Cryopharm Corporation Lyophilized and reconstituted red blood cell compositions
US5876754A (en) * 1992-01-17 1999-03-02 Alfatec-Pharma Gmbh Solid bodies containing active substances and a structure consisting of hydrophilic macromolecules, plus a method of producing such bodies
US20090155331A1 (en) * 2005-11-16 2009-06-18 Elan Pharma International Limited Injectable nanoparticulate olanzapine formulations
EP2253306A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-24 Royal College of Surgeons in Ireland Orodispersible dosage forms containing solid drug dispersions
WO2011086194A1 (en) * 2010-01-18 2011-07-21 Cephalon France Improved oral lysophilisates containing pvp/va
CN104208677B (zh) * 2013-09-30 2016-08-17 郑州后羿制药有限公司 一种抗鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合症、禽流感的混合冻干粉及其制备方法
KR20150052667A (ko) * 2013-11-06 2015-05-14 삼성전자주식회사 시료 중 소포를 안정화시키는 방법
JP2016088689A (ja) 2014-11-05 2016-05-23 セイコーエプソン株式会社 媒体保持具、媒体装填装置、記録装置
JP2019527729A (ja) * 2016-07-13 2019-10-03 リフォーム バイオロジクス、エルエルシー 治療用タンパク質製剤のための安定化賦形剤
EP3525806B1 (en) * 2016-10-12 2023-02-15 Agency For Science, Technology And Research Method for lyophilising an exosome
MA56541A (fr) * 2019-06-21 2022-04-27 Entelexo Biotherapeutics Inc Plateformes, compositions et méthodes d'administration de composés thérapeutiques

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060127375A1 (en) * 1998-05-26 2006-06-15 Lifecell Corporation Cryopreservation of human red blood cells
CN101287449A (zh) * 2002-04-11 2008-10-15 米迪缪尼疫苗股份有限公司 喷雾干燥保存生物活性材料
JP2018130085A (ja) * 2017-02-17 2018-08-23 Jsr株式会社 保存安定化剤、安定化方法、保存方法、添加剤、単離方法、及び回収効率改善剤
CN109355258A (zh) * 2018-11-02 2019-02-19 北京恩泽康泰生物科技有限公司 一种用于提取体液中胞外囊泡的提取剂及其提取方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAREK A AHMED: "Formulation and clinical investigation of optimized cinpocetine lyoplant-tabs:new strategy in development of buccal solid dosage form", 《DRUG DESIGN, DEVELOPMENT AND THERAPY》, no. 13, pages 212 *
THIRUMALA等: "Evaluation of Polyvinylpyrrolidone as a Cryoprotectant for Adipose Tissue-Derived Adult Stem Cells", TISSUE ENGINEERING, vol. 16, no. 4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3957713A4 (en) 2023-01-25
JPWO2020213682A1 (zh) 2020-10-22
KR20210144848A (ko) 2021-11-30
EP3957713A1 (en) 2022-02-23
JP7394122B2 (ja) 2023-12-07
WO2020213682A1 (ja) 2020-10-22
TW202104589A (zh) 2021-02-01
US20220033765A1 (en) 2022-02-03
AU2020259891A1 (en) 2021-11-18
AU2020259891B2 (en) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113710794A (zh) 细胞外囊泡的保存稳定化剂及保存稳定化方法
US9671321B2 (en) Methods and compositions for exosome isolation
CN106796219B (zh) 全血样品的稳定化
CN1038691C (zh) 稳定的冻干哺乳动物细胞的制备方法
WO2013168767A1 (ja) 赤血球除去方法および採血用遠沈管
JP6545198B2 (ja) 周囲温度での血液サンプル中の代謝的に活性な細胞の安定化
US20190076478A1 (en) Canine blood platelet preparations
EP2938993B1 (en) Compositions for permeabilising fixed blood cells and uses thereof
TWI846863B (zh) 細胞外囊泡的保存溶液及保存安定方法
CN115943208A (zh) 核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法
WO2019230532A1 (ja) 血液試料保存剤
CN117915772A (zh) 用于核酸和生物样品的防腐剂组合物及其使用方法
Zemlianskykh et al. Cryopreservation in presence of PEG-1500 affects erythrocyte surface characteristics
US20230157274A1 (en) Nucleic acid and cell preservative compositions and methods of use
EP0888117B1 (en) Use of arabinogalactan in a sperm wash product
CN1072717C (zh) 哺乳动物生理细胞的检验方法
CN113637639A (zh) 一种血液循环肿瘤细胞的俘获方法
Winskel-Wood Examining the non-haemostatic function of alternatively stored platelets
Zemlianskykh et al. Modification of erythrocyte membrane proteins by polyethylene glycol 1500
MOUSTAFA et al. In Vitro Assessment of Different Prepared Platelet Concentrates During 8 Days Storage
JP2024525710A (ja) 核酸および生体試料のための保存剤組成物ならびに使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20221019

Address after: Tokyo

Applicant after: FUJIFILM Corp.

Address before: Osaka, Japan

Applicant before: Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.