KR20150052667A

KR20150052667A - 시료 중 소포를 안정화시키는 방법

Info

Publication number: KR20150052667A
Application number: KR1020130134363A
Authority: KR
Inventors: 강현주; 김가희; 용예령; 박경희; 박종면
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2015-05-14
Also published as: US20150125864A1

Abstract

시료 중 소포를 안정화시키는 방법 및 이에 사용되는 조성물을 제공한다. 이에 의하면, 시료 중 소포를 안정화시켜 소포의 수득률을 증가시키고 소포의 막 또는 표면 단백질의 상태를 유지할 수 있다.

Description

시료 중 소포를 안정화시키는 방법{Method for stabilizing a vesicle in a sample}

시료 중 소포를 안정화시키는 방법 및 이에 사용되는 조성물에 관한 것이다.

생체 내 마이크로베지클은 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 (ⅰ)엑소좀: 식균 기원의 직경 30 ㎚ 내지 100 ㎚의 막성 베지클, (ⅱ)엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicle: SMV)이라고도 함): 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 ㎚ 내지 1000 ㎚의 큰 막성 베지클, (ⅲ) 세포자살성 수포(apoptotic bleb): 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 ㎚ 내지 5000 ㎚의 베지클을 포함한다.

그 중 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular body: MVB)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출된다. 엑소좀은 정상 상태 및 병적 상태, 이 두 가지 모든 상태 하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 생체 내 마이크로베지클, 예를 들어 엑소좀은 마이크로RNA(microRNA: miRNA)를 포함하며 이러한 miRNA는 암 조기 진단과 같은 분자 진단에 있어서 유용한 마커로 활용 가능하다.

시료를 준비하는 전-분석(pre-analytical) 과정에서 생기는 편향(bias)로 인하여 소포의 분석에 있어서 해석의 오류가 생길 수 있다. 예를 들면, 샘플 준비과정에서 혈액 중 활성화된 혈소판에서 분비된 다량의 소포에 의한 오염이 발생하거나, 소포의 파괴가 발생할 경우 실제 임상적 상태에서 존재하는 소포의 양과 다르게 측정될 수 있고, 특히 병적 상태의 샘플일 경우 혈소판 유래 소포에 의한 오염으로 인하여 질병 특이적 소포 분리의 어려움이 발생할 수 있게 되는 등, 결과의 편향이 발생할 수 있다.

따라서, 소포를 이용한 연구, 진단, 또는 모니터링에서, 시료 중 소포의 수득률을 증가시키고 소포의 안정성이 유지되도록 시료를 수득하는 것이 필요하다.

시료 중 소포를 안정화시키는 방법을 제공한다.

시료 중 소포를 안정화시키기 위한 조성물을 제공한다.

소포를 포함하는 시료와 킬레이트화제를 혼합하여 소포를 안정화시키는 단계를 포함하는 시료 중 소포를 안정화시키는 방법이 제공된다.

상기 방법은 소포를 포함하는 시료와 킬레이트화제를 혼합하여 소포를 안정화시키는 단계를 포함한다.

소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클(circulating microvesicle) 또는 마이크로입자(microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 ㎚ 내지 100 ㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 ㎚ 내지 1,000 ㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 ㎚ 내지 5,000 ㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.

시료는 체액일 수 있다. 상기 체액은 예를 들면, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합일 수 있다. 시료는 개체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 시료는 전처리되지 않거나 전처리된 시료일 수 있다. 전처리는 개체로부터 분리된 온전한 세포, 죽은 세포 또는 세포 잔해를 제거하는 것일 수 있다. 예를 들면, 전처리는 원심분리, 투석, 또는 이들의 조합일 수 있다.

킬레이트화제(chelating agent)는 금속 이온과 결합하여 킬레이트 화합물(chelate compound)을 만드는 물질을 말한다. 킬레이트 화합물은 하나의 분자 또는 이온에 둘 이상의 배위원자를 갖고, 그것이 금속 원자 또는 이온을 둘러 쌓듯이 배위한 고리 구조가 있는 화합물을 말한다. 킬레이트화제는 예를 들면, 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid: EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(diethylene triamine pentaacetic acid: DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(diaminocyclohexane tetraacetic acid: DCTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid: EGTA), 니트릴로트리아세트산(Nitrilotriacetic acid: NTA), 에틸렌디아민-N,N'-비스(2-히드록시페닐아세트산)(ethylenediamine-N,N'-bis(2-hydroxyphenylacetic acid): EDDHA), 시트르산(citric acid), 또는 이들의 조합일 수 있다.

킬레이트화제는 시료에 대해 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 농도는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 9.5 ㎎/㎖, 약 0.2 ㎎/㎖ 내지 약 9 ㎎/㎖, 약 0.3 ㎎/㎖ 내지 약 8.5 ㎎/㎖, 약 0.4 ㎎/㎖ 내지 약 8 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 7.5 ㎎/㎖, 약 0.6 ㎎/㎖ 내지 약 7 ㎎/㎖, 약 0.7 ㎎/㎖ 내지 약 6.5 ㎎/㎖, 약 0.8 ㎎/㎖ 내지 약 6 ㎎/㎖, 약 0.9 ㎎/㎖ 내지 약 5.5 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 5 ㎎/㎖, 약 1.1 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.2 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.3 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.4 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.5 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.6 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.7 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 4.4 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 4.3 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 4.2 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 4.1 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 4 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.9 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.8 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.7 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.6 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.5 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.4 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.3 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.2 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3.1 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 3 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 2.9 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 2.8 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 2.7 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 2.6 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 2.5 ㎎/㎖, 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 2.4 ㎎/㎖, 또는 약 1.8 ㎎/㎖ 내지 약 2.3 ㎎/㎖일 수 있다. 예를 들면, 상기 농도는 약 2.25 ㎎/㎖ 이하일 수 있다.

용어 "안정화(stabilize)"는 물건 또는 물질이 바뀌어 달라지지 않고 일정한 상태를 유지하는 것을 말한다. 시료 중 소포를 안정화시키는 것은 시료를 수득할 당시 시료 중 소포의 상태가 달라지지 않도록 유지하는 것일 수 있다. 예를 들면, 시료를 수득할 당시의 시료 중 소포의 양이 달라지지 않도록 유지하는 것일 수 있다. 예를 들면, 시료를 수득할 당시의 소포의 지질막, 단백질 또는 핵산이 분해되거나 변화하지 않도록 유지되는 것일 수 있다. 소포의 단백질은 소포의 표면 단백질일 수 있다. 소포 중 핵산은 마이크로RNA(microRNA: miRNA)일 수 있다.

상기 방법은 킬레이트화제와 혼합된 시료를 0℃ 내지 25℃에서 보관하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 시료를 0℃ 내지 30℃에서 보관하는 것일 수 있다. 예를 들면, 시료는 약 0℃ 내지 약 25℃, 약 0℃ 내지 약 20℃, 약 0℃ 내지 약 15℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 0℃ 내지 약 9℃, 약 0℃ 내지 약 8℃, 약 0℃ 내지 약 7℃, 약 0℃ 내지 약 6℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 또는 약 0℃ 내지 약 4℃에서 보관된 것일 수 있다.

상기 방법은 킬레이트화제와 혼합된 시료를 0 시간 내지 48 시간 동안 보관하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 시료를 수득한 시간으로부터 약 0 시간 내지 약 48 시간 동안 보관하는 것일 수 있다. 시료가 혈액인 경우에는 시료를 수득한 시간은 채혈시일 수 있다. 예를 들면, 시료는 시료를 수득한 시간으로부터 약 0 시간 내지 약 44 시간, 약 0 시간 내지 약 40 시간, 약 0 시간 내지 약 36 시간, 약 0 시간 내지 약 32 시간, 약 0 시간 내지 약 28 시간, 약 0 시간 내지 약 24 시간, 약 0 시간 내지 약 22 시간, 약 0 시간 내지 약 20 시간, 약 0 시간 내지 약 18 시간, 약 0 시간 내지 약 16 시간, 약 0 시간 내지 약 14 시간, 약 0 시간 내지 약 12 시간, 약 0 시간 내지 약 10 시간, 약 0 시간 내지 약 8 시간, 약 0 시간 내지 약 6 시간, 약 0 시간 내지 약 4 시간, 약 0 시간 내지 약 2 시간, 또는 약 0 시간 내지 약 1 시간 동안 보관된 것일 수 있다.

상기 방법은 킬레이트화제와 혼합된 시료를 1회 내지 12회의 냉동 또는 해동시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 냉동 또는 해동이 1회 내지 11회, 1회 내지 10회, 1회 내지 9회, 1회 내지 8회, 1회 내지 7회, 1회 내지 6회, 1회 내지 5회, 1회 내지 4회, 1회 내지 3회, 또는 2회 된 것일 수 있다.

상기 방법은 시료로부터 소포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 소포를 분리하는 단계는 당업계에 알려진 다양한 방법이 이용될 수 있다. 소포는 예를 들면 반응 혼합물의 제거, 세척 또는 이들의 조합으로 분리될 수 있다. 소포의 분리는 약 0℃ 내지 상온에서 수행될 수 있다. 상기 방법은 분리된 소포를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 검출은 당업계에 알려진 다양한 방법이 이용될 수 있다. 소포는 예를 들면, 소포를 염색하거나, 전자현미경으로 확인하거나, 항체를 사용하거나, 또는 형광 물질이 접합된 리간드를 이용하여 검출할 수 있다. 상기 방법은 분리된 소포를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분석은 당업계에 알려진 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 분석은 소포를 검출하는 방법, 및 소포의 단백질, 당단백질, 지질, 핵산 또는 이들의 조합을 분석하는 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단백질은 면역블로팅, 면역 침강, 크로마토그래피, 질량 분석기, 단백질 칩, 또는 이들의 조합으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 핵산은 마이크로RNA일 수 있다. 핵산은 예를 들면 핵산 증폭 방법, 염기 서열 결정(sequencing), 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 분석, 또는 이들의 조합으로 분석할 수 있다.

킬레이트화제를 포함하는 시료 중 소포를 안정화시키기 위한 조성물이 제공된다.

킬레이트화제, 시료, 소포, 및 안정화는 전술한 바와 같다.

일 구체예에 따른 시료 중 소포를 안정화시키는 방법 및 이에 사용되는 조성물에 의하면, 시료 중 소포를 안정화시켜 소포의 수득률을 증가시키고 소포의 막 또는 표면 단백질의 상태를 유지할 수 있다.

도 1a는 혈액에 첨가된 EDTA의 농도에 대한 마이크로베지클의 상대적 형광 강도를 나타내는 그래프이고, 도 1b는 3명의 정상인의 혈장으로부터 수득된 마이크로베지클에서 혈액에 첨가된 EDTA의 농도에 대한 마이크로베지클의 상대적 형광 강도를 나타내는 그래프이고, 도 1c는 3명의 정상인의 혈장을 마이크로베지클-특이적 마커인 항-CD9, 또는 항-CD83 항체를 이용하여 면역침강시킨 후, 수득된 마이크로베지클의 인테그린-β1의 상대적 양을 나타내는 그래프이다(□: CD9, ■: CD83).
도 2a는 혈액의 보관 온도에 따른 혈액으로부터 수득된 마이크로베지클의 인테그린-β1의 양을 나타내는 그래프이고(ANOVA p-value=0), 도 2b는 혈액의 보관 온도 및 시간에 따른 혈액으로부터 수득된 마이크로베지클의 인테그린-β1의 양을 나타내는 그래프이다(ANOVA p-value=0).
도 3a 내지 도 3f는 채혈 후 4℃에서 4 시간 이내에 혈장을 분리하여 수득된 마이크로베지클로부터 마이크로RNA를 수득하고, hsa-miR-126, hsa-miR-150, hsa-miR-16, hsa-miR-223, hsa-miR-320a, 및 hsa-miR-451을 표적으로 하는 정량적 RT-PCR의 Cp 값을 나타내는 그래프이다(●: 혈장 1, ■: 혈장 2, ◆: 혈장 3).
도 4a는 냉동 및 해동의 반복 후 여과를 통해 수득된 마이크로베지클의 양(형광 강도)을 나타내는 그래프이고, 도 4b는 냉동 및 해동의 반복 후 면역침강을 통해 수득된 마이크로베지클의 양(형광 강도)을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 채혈된 혈액에 대한 EDTA의 농도에 따른 혈액 중 마이크로베지클의 수득률 및 검출률

1-1. 혈액 및 혈장의 준비

건강한 사람의 정맥에서 혈액을 채혈하였다. 채혈된 혈액에 0 ㎎/㎖(대조군), 1.8 ㎎/㎖, 2.25 ㎎/㎖, 3.3 ㎎/㎖, 또는 4.5 ㎎/㎖의 최종 농도로 EDTA를 첨가하고, 즉시 4℃에서 1,300xg (g-force)로 10 분 동안 스윙 버켓(swing bucket)의 로터를 이용하여 원심분리하였다. 원심분리 후, 수득된 혈장을 -80℃에서 보관하였다.

1-2. EDTA 의 농도에 따른 혈액 중 마이크로베지클의 수득률

혈액 중 마이크로베지클을 확인하기 위하여, 단백질 G가 코팅된 96 웰 플레이트(Thermo scientific Inc.)에 항-CD9 항체(R&D SYSTEMS, Inc.)를 코팅한 후, 실시예 1-1에 기재된 바와 같이 수득한 혈장 20㎕를 각각의 플레이트 웰에 넣고, 1시간 동안 반응시켰다. 항-CD9 항체와 결합하지 않은 부유물을 제거하기 위해, PBS로 3회 세척한 다음, 플레이트 웰에 12.5 mM의 칼세인(calcein)-AM(Sigma)을 첨가하고, 상온에서 4 시간 30 분 동안 인큐베이션시켜 마이크로베지클을 염색하였다. 그 후, PBS 버퍼로 3회 세척하여 마이크로베지클 내 염색되지 않은 잔여 칼세인-AM을 제거하였다. 염색된 마이크로베지클의 양을 확인하기 위해 형광광도계(fluorophotometer)(Beckman, DTX800)를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. 1.8 ㎎/㎖의 EDTA를 첨가한 혈장 내 마이크로베지클의 형광 강도를 기준으로, 혈액에 첨가된 EDTA의 농도에 따른 마이크로베지클의 형광 강도를 비교하여 상대적인 마이크로베지클 수득률(%)을 산출하였다. EDTA의 농도에 대한 마이크로베지클의 상대적 형광 강도를 도 1a에 나타내고, 마이크로베지클의 수득률을 표시하였다.

도 1a에 나타난 바와 같이, 채혈된 혈액에 첨가된 EDTA의 농도가 증가함에 따라 수득된 마이크로베지클의 수득률이 감소하였다. 구체적으로, 2.25 ㎎/㎖의 EDTA가 첨가된 경우에는 마이크로베지클의 수득률이 약 94.1%이고, 3.3 ㎎/㎖의 EDTA가 첨가된 경우에는 마이크로베지클의 수득률이 약 7.0%였다. 따라서, 혈액에 첨가된 EDTA의 농도가 3.3 ㎎/㎖ 이상인 경우에는 혈액 중 마이크로베지클의 수득률이 감소하는 것을 확인하였다.

1-3. EDTA 의 농도에 따른 혈액 중 마이크로베지클의 검출률

혈액 중 마이크로베지클의 검출률을 산출하기 위해, 마이크로베지클의 마커인 CD8 및 CD9을 표적으로 하여 마이크로베지클을 면역침강시키고, 마이크로베지클의 마커인 인테그린-β1을 검출함으로써 면역침강된 마이크로베지클을 검출하였다.

3명의 정상인으로부터 혈액을 채혈하고, 실시예 1-1에 기재된 바와 같이 혈장을 수득하였다. 수득된 300 ㎕의 혈장과, 항-CD83 항체(BD Pharmingen) 또는 항-CD9 항체(R&D SYSTEMS, Inc.)를 혼합하고, 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 면역침강시켰다. 면역침강된 마이크로베지클은 EDTA의 농도에 대한 마이크로베지클의 상대적 형광 강도 및 실시예 1-2에 기재된 바와 같이 산출된 마이크로베지클의 수득률을 도 1b에 나타내었다. 동일한 시료에 대해서 항-인테그린-β1 항체(Abcam)로 면역블로팅을 수행하고, 인테그린-β1의 밴드 강도를 정량하여 도 1c에 나타내었다(□: CD9, ■: CD83).

도 1b 및 1c에 나타난 바와 같이, 채혈된 혈액에 첨가된 EDTA의 농도를 증가시킴에 따라, 마이크로베지클의 양, 및 항-CD83 항체 또는 항-CD9 항체로 면역침강시킨 마이크로베지클의 양이 감소하였다. 따라서, 혈액에 첨가된 EDTA의 농도가 증가함에 따라 혈액으로부터 수득된 마이크로베지클의 검출률이 감소함을 확인하였다.

실시예 2. 혈액을 채혈한 후 보관 온도 및 시간에 따른 혈액 중 마이크로베지클의 안정성 확인

2-1. 혈장의 준비

실시예 1-1에 기재된 바와 같이 채혈된 혈액과 최종 농도 2.25 ㎎/㎖의 EDTA을 인큐베이션시켰다. EDTA가 첨가된 혈액을 4℃ 또는 상온에서 0 시간 내지 24시간 동안 보관한 다음, 원심분리하여 혈장을 수득하였다.

2-2. 수득된 마이크로베지클의 양의 확인

실시예 2-1에 기재된 바와 같이 분리된 300 ㎕의 혈장과 항-CD9 항체(R&D SYSTEMS, Inc.)를 혼합하고, 상온에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 혈장 중 마이크로베지클을 면역침강시켰다. 면역침강된 마이크로베지클은 항-인테그린-β1 항체(Abcam)로 면역블로팅하고, 인테그린-β1의 밴드 강도를 정량하였다. 채혈 후 보관 온도에 따른 마이크로베지클의 인테그린-β1의 양을 도 2a에 나타내고, 온도 및 보관 시간에 따른 마이크로베지클의 인테그린-β1의 양을 도 2b에 나타내었다(ANOVA p-value=0). 인테그린-β1의 양은 마이크로베지클의 양을 나타낸다.

도 2a및 도 2b에 나타난 바와 같이, 4℃에서 4 시간 내지 24 시간 동안 보관된 혈액으로부터 분리된 마이크로베지클의 양은 유의한 차이가 없었다. 그러나, 상온에서 보관된 경우에는 채혈 후 1 시간 이상 보관된 경우, 마이크로베지클의 양이 유의하게 증가함을 확인하였다.

2-3. 수득된 마이크로베지클 중 마이크로 RNA 의 양의 변화 확인

마이크로RNA 추출 키트(QIAGEN)를 사용하여, 실시예 2-2에 기재된 바와 같이 3명의 정상인으로부터 채혈한 후 4℃에서 4 시간 이내에 혈장을 분리하여 수득된 마이크로베지클로부터 마이크로RNA를 분리하였다.

분리된 마이크로RNA는 miRNA 특이적인 프라이머(Exiqon, Inc)를 이용하여 정량적 RT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction: qRT-PCR)을 수행하였다. hsa-miR-126(miRBase Accession No.: MI0000471), hsa-miR-150(miRBase Accession No.: MI0000479), hsa-miR-16(miRBase Accession No.: MI0000070), hsa-miR-223(miRBase Accession No.: MI0000300), hsa-miR-320a(miRBase Accession No.: MI0000542), 및 hsa-miR-451(miRBase Accession No.: MI0001729)을 표적으로 하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다.

hsa-miR-126: 5'-CGCUGGCGACGGGACAUUAUUACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGU

ACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGUCCACGGCA-3' (서열번호 1)

hsa-miR-150: 5'-CUCCCCAUGGCCCUGUCUCCCAACCCUUGUACCAGUGCUGGGCUCAGACCCUGGU

ACAGGCCUGGGGGACAGGGACCUGGGGAC-3' (서열번호 2)

hsa-miR-16: 5'-GUCAGCAGUGCCUUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGAUUCUAAAAUUAUCUC

CAGUAUUAACUGUGCUGCUGAAGUAAGGUUGAC-3' (서열번호 3)

hsa-miR-223: 5'-CCUGGCCUCCUGCAGUGCCACGCUCCGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUGGACACUC

CAUGUGGUAGAGUGUCAGUUUGUCAAAUACCCCAAGUGCGGCACAUGCUUACCAG-3' (서열번호 4)

hsa-miR-320a: 5'-GCUUCGCUCCCCUCCGCCUUCUCUUCCCGGUUCUUCCCGGAGUCGGGAAAAGCU

GGGUUGAGAGGGCGAAAAAGGAUGAGGU-3' (서열번호 5)

hsa-miR-451: 5'-CUUGGGAAUGGCAAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAAUGGUU

CUCUUGCUAUACCCAGA-3' (서열번호 6)

정량적 RT-PCR를 수행한 후, 얻어진 Cp 값을 도 3a 내지 도 3f에 나타내었다(도 3a: hsa-miR-126(ANOVA p-value=9.75E-01), 도 3b: hsa-miR-150(ANOVA p-value=8.34E-01), 도 3c: hsa-miR-16(ANOVA p-value=9.29E-01), 도 3d: hsa-miR-223(ANOVA p-value=9.16E-01), 도 3e: hsa-miR-320a(ANOVA p-value=5.97E-01), 도 3f: hsa-miR-451(ANOVA p-value=1.78E-02)).

도 3a 내지 도 3f에 나타난 바와 같이, 4℃에서 4 시간 이내 보관된 혈액으로부터 분리된 마이크로베지클의 miRNA의 양은 유의한 차이가 없었다(●: 혈장 1, ■: 혈장 2, ◆: 혈장 3).

실시예 3. 냉동 및 해동의 반복에 따른 혈액 중 마이크로베지클의 안정성 확인

3-1. 혈장의 준비

10명의 정상인으로부터 채혈된 혈액에 최종 농도 2.25 ㎎/㎖의 EDTA를 첨가하고, EDTA가 첨가된 혈액을 4℃에서 4 시간 이내 보관하였다. 그 다음, 실시예 1-1에 기재된 바와 같은 방법으로 원심분리하여 혈장을 수득하고, 수득된 혈장을 -80℃에서 보관하였다.

3-2. 냉동 및 해동의 반복에 따른 마이크로베지클의 안정성

실시예 3-1에서 준비한 10명의 혈장을 동량으로 혼합하였다. 2 ㎖의 혈장과 12.5 mM의 칼세인-AM(Sigma)을 혼합하고, 상온에서 4 시간 30 분 동안 인큐베이션시켜 마이크로베지클을 염색하였다. 반응물을 100 KDa 필터(Sartorius biotechnology)로 여과시켜 잔여 칼세인-AM을 제거하였다. 마이크로베지클을 포함하는 반응물을 12개의 튜브에 150 ㎕씩 나누어 담은 후, 1 내지 12회의 냉동(-80℃에서 4 시간 이상 보관) 및 해동(상온에서 1 시간 이상 보관)을 반복하였다.

2 내지 12회의 냉동 및 해동을 반복한 반응물을 100 KDa 필터(Sartorius biotechnology)로 여과시켜, 여과되지 않은 온전한(intact) 마이크로베지클을 수득하였다. 수득된 마이크로베지클의 양을 형광광도계(fluorophotometer)(Beckman, DTX800)를 사용하여 형광 강도를 측정하고, 그 결과를 도 4a에 나타내었다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 냉동 및 해동을 1회 내지 10회까지 반복한 경우 마이크로베지클의 양이 유의한 차이가 없었다.

3-3. 냉동 및 해동의 반복에 따른 마이크로베지클 표면 단백질의 안정성

실시예 3-1에서 준비한 10명의 혈장을 동량으로 혼합하였다. 12개의 튜브에 150 ㎕씩 나누어 담은 다음, 1 내지 12회의 냉동(-80℃에서 4 시간 이상 보관) 및 해동(상온에서 1 시간 이상 보관)을 반복하였다.

실시예 1-2에 기재된 바와 같이 준비된 항-CD9 항체(R&D SYSTEMS, Inc.)가 코팅된 96 웰 플레이트(Thermo scientific Inc.))에 냉동 및 해동이 반복된 혈장 20 ㎕를 각각의 플레이트 웰에 넣고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-CD9 항체와 결합하지 않은 부유물을 제거하기 위해, PBS로 3회 세척하였다. 마이크로베지클을 포함하는 반응물과 12.5 mΜ의 칼세인-AM(Sigma)을 혼합하고, 상온에서 4 시간 30 분 동안 인큐베이션시켜 마이크로베지클을 염색하였다. 마이크로베지클을 염색한 후, PBS 버퍼로 3회 세척하여 마이크로베지클 내 염색되지 않은 잔여 칼세인-AM을 제거한 다음, 형광광도계(Beckman, DTX800)를 사용하여 형광 강도를 측정하고, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.

도 4b에 나타난 바와 같이, 항-CD9 항체에 의한 마이크로베지클의 캡쳐 효율은 6회 이상 냉동 및 해동 반복 시에 14.3% 내지 20.8% 감소하였다(P<0.05). 따라서, 냉동 및 해동을 6회 이상 반복한 경우에, 마이크로베지클의 막 안정성은 유의한 차이가 없으나, 마이크로베지클의 표면 단백질이 유의하게 손상되는 것을 확인하였다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Method for stabilizing a vesicle in a sample <130> PN102646 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 85 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-126 <400> 1 cgcuggcgac gggacauuau uacuuuuggu acgcgcugug acacuucaaa cucguaccgu 60 gaguaauaau gcgccgucca cggca 85 <210> 2 <211> 84 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-150 <400> 2 cuccccaugg cccugucucc caacccuugu accagugcug ggcucagacc cugguacagg 60 ccugggggac agggaccugg ggac 84 <210> 3 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-16 <400> 3 gucagcagug ccuuagcagc acguaaauau uggcguuaag auucuaaaau uaucuccagu 60 auuaacugug cugcugaagu aagguugac 89 <210> 4 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-223 <400> 4 ccuggccucc ugcagugcca cgcuccgugu auuugacaag cugaguugga cacuccaugu 60 gguagagugu caguuuguca aauaccccaa gugcggcaca ugcuuaccag 110 <210> 5 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-320a <400> 5 gcuucgcucc ccuccgccuu cucuucccgg uucuucccgg agucgggaaa agcuggguug 60 agagggcgaa aaaggaugag gu 82 <210> 6 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-451 <400> 6 cuugggaaug gcaaggaaac cguuaccauu acugaguuua guaaugguaa ugguucucuu 60 gcuauaccca ga 72

Claims

소포를 포함하는 시료와 킬레이트화제를 혼합하여 소포를 안정화시키는 단계를 포함하는 소포를 안정화시키는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 마이크로베지클은 엑소좀인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 시료는 체액인 것인 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 체액은 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 또는 그의 조합인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 킬레이트화제는 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid: EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(diethylene triamine pentaacetic acid: DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(diaminocyclohexane tetraacetic acid: DCTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid: EGTA), 니트릴로트리아세트산(Nitrilotriacetic acid: NTA), 에틸렌디아민-N,N'-비스(2-히드록시페닐아세트산)(ethylenediamine-N,N'-bis(2-hydroxyphenylacetic acid): EDDHA), 시트르산(citric acid), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 킬레이트화제는 시료에 대해 0.01 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 킬레이트화제는 시료에 대해 1.8 ㎎/㎖ 내지 3.3 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 킬레이트화제와 혼합된 시료를 0℃ 내지 30℃에서 보관하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 방법은 킬레이트화제와 혼합된 시료를 0℃ 내지 5℃에서 보관하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 킬레이트화제와 혼합된 시료를 0 시간 내지 48 시간 동안 보관하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 킬레이트화제와 혼합된 시료를 0 시간 내지 4 시간 동안 보관하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 킬레이트화제와 혼합된 시료를 1회 내지 12회의 냉동 또는 해동시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 방법은 킬레이트화제와 혼합된 시료를 1회 내지 6회의 냉동 또는 해동시키는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은 시료로부터 소포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
킬레이트화제를 포함하는 시료 중 소포를 안정화시키기 위한 조성물.
청구항 16에 있어서, 상기 킬레이트화제는 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid: EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(diethylene triamine pentaacetic acid: DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(diaminocyclohexane tetraacetic acid: DCTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid: EGTA), 니트릴로트리아세트산(Nitrilotriacetic acid: NTA), 에틸렌디아민-N,N'-비스(2-히드록시페닐아세트산)(ethylenediamine-N,N'-bis(2-hydroxyphenylacetic acid): EDDHA), 시트르산(citric acid), 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 16에 있어서, 상기 킬레이트화제는 시료에 대해 0.01 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것인 조성물.
청구항 18에 있어서, 상기 킬레이트화제는 시료에 대해 1.8 ㎎/㎖ 내지 3.3 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것인 조성물.
청구항 16에 있어서, 상기 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 조성물.