CN111073846B

CN111073846B - 一种分离组织特异来源细胞外囊泡的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN111073846B
Application number: CN201911330494.9A
Authority: CN
Inventors: 渠香云; 董肇楠; 贾云莉; 马雪情; 李若晨; 蒋晓旭; 王弢
Original assignee: Jiangsu Microdiag Biomedicine Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Microdiag Biomedicine Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111073846A

Abstract

本申请提供了一种分离组织特异来源细胞外囊泡的方法及其试剂盒。具体而言，提供了一种从生物体液中分离甲状腺转录因子1阳性的细胞外囊泡，尤其是外泌体的方法，包括任选地通过物理方法分离总细胞外囊泡，并任选地通过结合剂去除红细胞和/或白细胞源细胞外囊泡，并用结合甲状腺转录因子1的结合剂正向捕获目标细胞外囊泡或外泌体的步骤。本申请还提供了结合甲状腺转录因子1的结合剂用于制备细胞外囊泡或外泌体分离或检测试剂的用途，以及一种从生物体液中分离甲状腺转录因子阳性的细胞外囊泡或外泌体的试剂盒。

Description

一种分离组织特异来源细胞外囊泡的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本申请涉及分离组织特异来源的细胞外囊泡，例如外泌体的方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)也称胞外囊泡，包括微囊泡、外泌体(exosome)等，外泌体是细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外的，大小约30-100nm的囊泡，微囊泡是大小约100-1000nm的囊泡。细胞外囊泡具有脂质双层膜结构，广泛存在于所有体液中，包括唾液、血液、尿液和母乳等。目前研究发现外泌体中富含核酸(microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、胆固醇等，能作为信号分子传递给靶细胞，从而介导细胞间的物质传递与信息交流，调节多种生理或病理反应，包括有血管生长、肿瘤细胞侵袭与转移、免疫应答等。由于miRNA在基因表达调控上有着重要作用，外泌体中的miRNA受到最多的关注。外泌体miRNA通过循环囊泡传递信息，被认为是细胞间信号交流的第三种途径。除了miRNA外，研究表明外泌体中的circRNA、lncRNA和蛋白质也参与细胞内的信号调控。有研究表明外泌体在肿瘤微环境中含量尤其丰富，与肿瘤的发生发展、免疫逃逸、微环境建立密切相关。外泌体可保护其中的核酸类物质，防止其迅速降解；外泌体的形成与亲源细胞的状态密切相关；针对外泌体内容物的检测比传统的生物标志物更具有特异性。外泌体的这些优势，使其在肿瘤等疾病体外诊断、治疗领域被广泛研究和应用。

外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，几乎所有类型的活细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。利用体液外泌体针对不同疾病进行研究过程中存在其他细胞来源外泌体干扰问题，如在血液中进行肺癌外泌体相关研究，则会存在其他健康组织、其他器官、白细胞及红细胞来源的外泌体干扰，这些非疾病来源的外泌体极大地阻碍了其应用及研究。

用于外泌体或其他细胞外囊泡分离富集的技术应该体现出从各种样品基质中高效率分离的优点。随着科学和技术的快速发展，已经开发了许多技术用于分离富集高纯度的细胞外囊泡尤其是高纯度的外泌体。这些技术利用了外泌体的特定性质，例如外泌体的密度，形状，大小和表面蛋白进行分离富集，如超速离心法、超滤法、PEG沉淀法、凝胶排阻法等方法实现外泌体的提取分离。这些方法为外泌体带来了一系列独特的优点，但仍有较大不足，如存在纯度低、回收率低、分散性差、破坏完整性、难以广泛普及等，而最主要是不能有效富集到组织或疾病来源的外泌体。

因此，如何获得高特异性、高纯度的组织或疾病来源的细胞外囊泡，尤其是外泌体，对于促进外泌体的研究和应用至关重要。

发明内容

本发明通过如下实施方案实现了本发明的目的。

项目1.一种从生物体液中分离甲状腺转录因子1阳性的细胞外囊泡的方法，包括：

任选地步骤1)，根据细胞外囊泡的物理参数，对所述生物体液通过物理方法，例如尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、微流体分离等分离获得总细胞外囊泡；

任选地步骤2)使用红细胞和/或白细胞通用的结合剂，例如，结合选自GPA、CD45、CD16、CD19、CD3、CD50、CD69的一种或多种生物标记的一种或多种结合剂与所述总细胞外囊泡接触，除去被结合剂结合的红细胞和/或白细胞源的细胞外囊泡；

步骤3)使用结合甲状腺转录因子1的结合剂进一步正向捕获，得到结合剂-细胞外囊泡复合物；

其中所述结合剂-细胞外囊泡复合物直接用于检测或释放出细胞外囊泡，优选地，所述细胞外囊泡包括外泌体，或细胞外囊泡为外泌体；更优选地所述细胞外囊泡或外泌体是肺或甲状腺来源的。

项目2.根据项目1的方法，其中所述结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。

项目3.根据项目1-2任一项的方法，其中所述结合剂可以与固体表面或载体直接或间接相连。

项目4.根据项目3的方法，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合。

项目5.根据项目1的方法，其中所述生物体液包括：血液、血清、血浆、尿、痰、腹水、唾液、支气管肺泡灌洗液、泪液、口咽洗液、排泄物、腹水液、胸腔积液、眼泪、心包液、淋巴液、食物糜、胆汁、粪便、细胞培养上清液、乳汁或其任意组合。

项目6.根据项目1-2任一项的方法，其中所述结合剂可用磁性、荧光或放射性标记进行标记。

项目7.根据项目1-2任一项的方法，其还包括在步骤3)之后去除复合物上非特异吸附的细胞外囊泡或外泌体的步骤，例如用洗涤缓冲液洗涤以去除非特异吸附的细胞外囊泡或外泌体。

项目8.根据项目1-2任一项的方法，其中细胞外囊泡或外泌体通过用洗脱缓冲液洗脱所述结合剂-细胞外囊泡复合物释放。

项目9.项目3或4所述的方法，其中所述载体为磁珠或树脂，优选地，磁珠浓度为1*10⁷个/ml至1*10⁸个/ml，优选3*10⁷个/ml；优选地，所述树脂浓度为1*10⁶个/ml至1*10⁷个/ml，优选5*10⁶个/ml。

项目10.项目3或4所述的方法，其中所述结合甲状腺转录因子1的结合剂为抗甲状腺转录因子1的抗体，优选单克隆抗体，优选地，其浓度为1～10μg/ml，优选2μg/ml。

项目11.项目3或4所述的方法，其中经步骤1)或2)处理后的溶液与结合甲状腺转录因子1的结合剂温育0.5～12小时，优选1小时。

项目12.根据项目1-11任一项的方法分离得到的细胞外囊泡群，优选外泌体群。

项目13.项目12的细胞外囊泡群或外泌体群用于mRNA、microRNA、蛋白质等标志物检测的用途。

项目14.结合甲状腺转录因子1的结合剂用于制备细胞外囊泡，优选外泌体分离或检测试剂的用途。

项目15.项目14所述的用途，其中所述结合剂是选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体；优选地，所述外泌体是甲状腺转录因子1阳性的，或进一步优选的是肺或甲状腺来源外泌体。

项目16.一种用于从生物体液中分离肺或甲状腺来源细胞外囊泡，优选外泌体的试剂盒，其包括结合甲状腺转录因子1的结合剂，任选地还包括用于去除红细胞和/或白细胞源细胞外囊泡的结合剂。

项目17.项目16所述的试剂盒，其中所述结合剂是选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体；优选地，所述生物体液包括：血液、血清、血浆、尿、痰、腹水、唾液、支气管肺泡灌洗液、泪液、口咽洗液、排泄物、腹水液、胸腔积液、眼泪、心包液、淋巴液、食物糜、乳汁、胆汁、粪便、细胞培养上清液或其任意组合。

项目18.一种用于诊断恶性肺结节的产品，例如试剂盒，该产品包括结合甲状腺转录因子1的结合剂，任选地还包括用于去除红细胞和/或白细胞源细胞外囊泡的结合剂，以及用于测定细胞外囊泡，优选外泌体的miR-19b表达量的试剂，以及任选地说明书，其中所述结合甲状腺转录因子1的结合剂和/或用于去除红细胞和/或白细胞源细胞外囊泡的结合剂用于从肺结节样品中分离出肺来源的细胞外囊泡，优选外泌体。

项目19.项目18所述的产品，其中所述用于测定细胞外囊泡，优选外泌体的miR-19b表达量的试剂包括用于通过RT-PCR测定细胞外囊泡，优选外泌体中miR-19b的miRNA表达量的引物和探针。

项目20.项目18-19任一项所述的产品，其中所述结合剂是选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。

项目21.miR-19b作为生物标志物在制备诊断受试者恶性肺结节的试剂中的用途，其中来自所述受试者的样品中细胞外囊泡，优选外泌体的miR-19b表达量相对于健康个体对照组细胞外囊泡，优选外泌体的miR-19b表达量的增加表明所述受试者患有或有风险患有恶性肺结节。

项目22.miR-19b检测试剂在制备用于诊断受试者恶性肺结节的产品，如试剂和试剂盒中的用途。

项目23.项目22所述的用途，其中来自所述受试者的肺结节样品中细胞外囊泡，优选外泌体的miR-19b表达量相对于健康个体对照组细胞外囊泡，优选外泌体的miR-19b表达量的增加表明所述受试者患有或有风险患有恶性肺结节。

项目24.项目22-23任一项的用途，其中所述miR-19b检测试剂为用于测定miR-19b的miRNA表达量的引物和/或探针。

项目25.一种用于诊断受试者中恶性肺结节的产品，如试剂和试剂盒，其中所述产品包括miR-19b检测试剂。

项目26.项目25所述的产品，如试剂和试剂盒，其中所述miR-19b检测试剂为用于测定miR-19b的miRNA表达量的引物和/或探针。

miR-19b属于miR-17-92家族，miR-17-92家族成员在多种人类肿瘤组织中普遍高表达，并作为癌基因促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导血管生成，在肿瘤的发生发展中起重要作用。研究表明在非小细胞肺癌中，miR-19b通过靶向PP2A和BIM调节EGFR信号通路增强肿瘤细胞抗凋亡；也可通过靶向TP53促进肿瘤生长和转移。但是，miR-19b在体液外泌体中的表达情况与肺癌或早期肺癌的相关性是不明确的，没有相关报道。

本发明的实施方案具有如下特点和优点：

1)所获得的细胞外囊泡，尤其是外泌体为组织特异性来源的，特别是肺或甲状腺组织特异性来源；

2)外泌体结构完整，保持活性，均匀分散；

3)外泌体纯度高，可有效去除细胞残留蛋白(HCP)和脂质体、核酸小分子等杂质；

4)外泌体粒径分布在80-120nm左右，与文献报道吻合；

5)回收率稳定、重复性好，外泌体蛋白检测CV<10％，外泌体核酸分子检测CV<5％；

6)操作简单，可在4小时内完成外泌体的提取。

附图说明

图1是利用免疫亲和法捕获分离组织特异外泌体的示意图。

图2是用两款粒径超过1μm并且已经成熟商业化的磁珠作为捕获载体的对比验证结果。

图3是捕获载体磁珠量的优化结果图。

图4是TTF-1生物素化抗体量的优化结果图。

图5是捕获时间优化图。

图6是样品前处理优化电泳图。泳道M：分子量标记，泳道1：NTC；泳道2：血浆外泌体负向筛选后正向捕获组；泳道3：血浆总外泌体直接正向捕获组；泳道4：阳控细胞总外泌体。

图7是TTF-1蛋白的蛋白质免疫印迹检测图。

图8是捕获纯度的蛋白质免疫印迹检测图。

图9是外泌体标志物CD-81和TTF-1蛋白质免疫印迹检测图。M：蛋白质分子量标记，泳道1：肺泡灌洗液外泌体捕获组，泳道2、3：肺癌血清和血浆样品捕获组，泳道4：胸腹水样品捕获组，泳道5：尿液外泌体捕获组。

图10是甲状腺转录因子(TTF-1)捕获肺来源特异外泌体NTA验证表格。

图11是甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体流式分析图。

图12是外泌体稀释捕获效率曲线图，细胞上清外泌体梯度稀释后用于捕获检测，浓度对数值与梯度成线性关系。

图13是外泌体捕获富集外泌体电镜观察：外泌体膜结构完整，粒径范围(80-90nm)，符合经典外泌体文献报道。

图14是用甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体后，通过外泌体中核酸mRNA检测分析验证图。

图15是用甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体后，通过外泌体中核酸miRNA检测分析验证图。

图16是甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离的外泌体活性评价图。其中空白组使用完全培养基，对照组使用THP-1细胞，试验组使用THP-1细胞+TTF-1阳性外泌体。

图17是甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体临床应用评价图，其中以mir-16作为内参PCR检测血浆中外泌体miRNA表达量。

具体实施方式

在一个实施方案中，提供了一种从生物体液中分离甲状腺转录因子1阳性的细胞外囊泡，尤其是外泌体的方法，包括：

任选地步骤1)，根据细胞外囊泡或外泌体的物理参数，对所述生物体液通过物理方法，例如尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、微流体分离等分离获得总细胞外囊泡或外泌体；

任选地步骤2)使用红细胞和/或白细胞通用的结合剂，例如，结合选自GPA、CD45、CD16、CD19、CD3、CD50、CD69的一种或多种生物标记的一种或多种结合剂与所述总细胞外囊泡或外泌体接触，除去被结合剂结合的红细胞和/或白细胞源的细胞外囊泡或外泌体；

步骤3)使用结合甲状腺转录因子1的结合剂与经步骤1)或步骤2)的处理的溶液接触，以进行正向捕获形成结合剂-细胞外囊泡或外泌体的复合物；

其中所述结合剂-细胞外囊泡或外泌体的复合物释放出细胞外囊泡或外泌体后用于检测分析，或将复合物直接用于检测分析。优选地，所述细胞外囊泡为外泌体。

本文所用的术语“任选地”指可以包括某个步骤或不包括某个步骤。在不包括该步骤的情况下，直接将来自体液样品或体液获得的总细胞外囊泡，如总外泌体样品用于实施下个步骤。

本文所述的细胞外囊泡也简称胞外囊泡，包括外泌体、微囊泡、凋亡小体等所有生物体液中的细胞外囊泡。

本文方法分离的细胞外囊泡主要为外泌体，但也包括少量微囊泡等其他类型细胞外囊泡。本文中所述分离的外泌体或总外泌体，分离得到的几乎全部是外泌体，但可能也可不避免的包括极少量的微囊泡等其他大小或来源的囊泡，本文分离的外泌体纯度完全满足后续外泌体相关检测的需要。

本文所用的生物体液包括：血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿、痰、腹水、滑液、精液、乳头抽吸液、唾液、支气管肺泡灌洗液、泪液、口咽洗液、排泄物、腹水液、胸腔积液、汗液、眼泪、水样液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、胆汁、稀便、羊膜液、乳汁、胰液、耳垢、考珀液、预射精液、女性射出液、组织液、月经、黏膜分泌物、脓、皮脂、阴道分泌物或其任意组合。

本领域中已知多种生物标志物，不同的细胞以及正常细胞和患病细胞可能表达不同的生物标志物，例如，本领域已知一种或多种甲状腺癌特异性生物标志物，例如甲状腺乳头状癌特征的标志物AKAP9-BRAF，CCDC6-RET，ERC1-RETM，GOLGA5-RET，HOOK3-RET，HRH4-RET，KTN1-RET，NCOA4-RET，PCM1-RET，PRKARA1A-RET，RFG-RET，RFG9-RET，Ria-RET，TGF-NTRK1，TPM3-NTRK1，TPM3-TPR，TPR-MET，TPR-NTRK1，TRIM24-RET，TRIM27-RET或TRIM33-RET；或者滤泡性甲状腺癌特征的标志物PAX8-PPARy。

常见的外泌体生物标志物包括：CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、MFG-E8、膜联蛋白V等。

本文中的结合剂包括能与特定标志物特异性结合的结合剂。结合剂可以是DNA，RNA，单克隆抗体，多克隆抗体，Fabs，Fab′，单链抗体，合成抗体，拟肽，zDNA，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNAs)，外源凝集素，合成或天然形成的化学化合物(包括但不限于药剂、标记试剂)，枝状物(如三维金/铜纳米枝状物、聚丙烯胺-辛胺枝状物)或它们的组合。优选地，结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。例如，结合剂是结合选自GPA、CD45、CD16、CD19、CD3、CD50、CD69的一种或多种的生物标记的结合剂，例如，抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，或单链抗体，优选单克隆抗体。结合甲状腺转录因子1的结合剂是结合甲状腺转录因子1(TTF-1)的结合剂，例如，抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，或单链抗体，优选单克隆抗体。

抗体包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，双特异性抗体，合成抗体，人源化的抗体，嵌合抗体，单链抗体，Fab片段和F(ab′)2片段，Fv或Fv′部分，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗-Id)抗体或者上文所述的任一种的抗原决定部位的结合片段。

本文所述的单克隆抗TTF-1抗体可以为抗动物，特别是灵长类动物，优选哺乳动物，更优选鼠的TTF-1的单克隆抗体。所述单克隆抗TTF-1抗体可以通过本领域已知的方法制备或者可以通过商业途径得到。本文所述的单克隆抗TTF-1抗体可以例如，通过生物技术方法从动物或微生物表达。优选地，所述单克隆抗TTF-1抗体为单克隆抗人TTF-1抗体。

本文所述的物理参数可以是尺寸或密度等物理参数。本领域技术人员基于这些物理参数通过物理方法如尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、微流体分离等可以分离出总外泌体。

从结合剂-外泌体/细胞外囊泡的复合物释放出外泌体/细胞外囊泡的方法是本领域技术人员已知的并且本领域技术人员可以根据具体所用的结合甲状腺转录因子1的结合剂和所述复合物的性质释放出外泌体/细胞外囊泡。例如，通过用洗脱缓冲液洗脱从所述复合物中释放出外泌体/细胞外囊泡。

在一个实施方案中，所述结合剂与载体如磁珠或树脂或其混合物直接或间接连接。本领域技术人员可以想到，一般情况下，其他形式的载体也可以用于本发明中，只要连接所述载体的所述结合剂能够特异性结合所述生物标志物，并且可以通过常规方法从所述结合剂-外泌体的复合物释放出外泌体即可。例如，所述连接可以是通过链霉亲和素-生物素的方式或者其他方式，如亲和素-生物素等。例如，所述载体为表面修饰有链霉亲和素的载体，所述结合剂例如抗外泌体表面标记的单克隆抗体为生物素化的结合剂，如单克隆抗体。从而，通过链霉亲和素与生物素的特异性结合实现载体与单克隆抗体的特异性结合，从而方便外泌体的吸附与解吸。

结合剂还可以与固体表面或基底直接或间接相连。固体表面或基底可以为结合剂可以与其直接或间接相连的、任何可物理分离的固体，包括但不限于通过微阵列和孔，颗粒(例如珠)，柱，光纤，玻璃和经修饰或官能化的玻璃，石英，云母，重氮化的膜(纸或尼龙)，聚甲醛，纤维素，醋酸纤维素，纸，陶瓷，金属，非金属，半导体材料，量子点，涂敷的珠或粒子，其他色谱材料，磁粒子所提供的表面；塑料(包括丙烯酸酯，聚苯乙烯，苯乙烯或其他材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚亚安酯，TEFLON^TM等)，多糖，尼龙或硝化纤维，树脂，二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)，碳，金属，无机玻璃，塑料，陶瓷，导电聚合物(包括诸如聚吡咯和聚吲哚之类的聚合物)所提供的表面；微结构或纳米结构的表面，例如核酸覆瓦式阵列，纳米管，纳米线或者纳米颗粒装饰的表面；或者多孔表面或凝胶，例如甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，糖聚合物，纤维素，硅酸酯或者其他纤维状或链状聚合物。此外，如本领域已知的，可以使用具有任何数量的材料(包括聚合物，如右旋糖苷、丙烯酰胺、凝胶或琼脂糖)的、被动式或化学衍生的涂料来涂敷基底。这种涂料可以有利于具有生物学样品的阵列的使用。在一个实施方案中，所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合。

结合剂还可以与粒子结合，例如珠或微球。例如，对外泌体成分具有特异性的抗体可以与粒子结合，并且抗体结合的粒子可以用于分离生物学样品中的外泌体。在某些实施方案中，所述的微球可以为磁性的或荧光标记的。此外，用于分离外泌体的结合剂可以为固体基底本身。例如，可以使用橡胶珠，例如乙醛/硫酸盐珠(Interfacial Dynamics，Portland，OR)。在一个实施方案中，所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合。

结合剂为能够与外泌体或细胞外囊泡的成分(例如外泌体的生物标志物)相结合的试剂。所述的结合剂可以为捕获剂。捕获剂能够通过与外泌体靶物(例如外泌体上的生物标志物)结合来捕获外泌体。例如，所述的捕获剂可以为能够与外泌体/细胞外囊泡上的抗原相结合的捕获抗体。所述的捕获剂可以与基底偶联，并用于分离外泌体/细胞外囊泡。

可以在由生物学样品中浓缩或分离细胞外囊泡/外泌体之后使用结合剂。例如，可以首先分离生物学样品中的总细胞外囊泡或总外泌体，然后使用针对生物标志物的结合剂来分离具有特异的生物标志物的细胞外囊泡或外泌体。因此，具有特异的生物标志物的外泌体/细胞外囊泡由外泌体/细胞外囊泡的混杂群体中分离出来。备选地，可以未经之前的细胞外囊泡/外泌体的分离步骤或浓缩步骤的条件下在包含细胞外囊泡/外泌体的生物学样品上使用结合剂。例如，使用结合剂来分离生物学样品中具有特异的生物标志物的外泌体/细胞外囊泡。

在某些例子中，可以使用单一的结合剂来分离细胞外囊泡/外泌体。在其他例子中，可以使用不同结合剂的组合来分离细胞外囊泡/外泌体。

结合剂也可以用以下物质标记，包括但不限于磁性标记物，荧光部分，酶，化学发光探针，金属粒子，非金属胶状粒子，聚合物染料粒子，颜料分子，颜料粒子，电气化学活性物质，半导体纳米晶体或其他纳米粒子(包括量子点或金粒子)。所述的标记物可以为但不限于荧光团、量子点或放射性标记物。例如，所述的标记物可以为放射性同位素(放射性核)，例如³H，¹¹C，¹⁴C，¹⁸F，³²P，³⁵S，⁶⁴Cu，⁶⁸Ga，⁸⁶Y，⁹⁹Tc，¹¹¹In，¹²³I，¹²⁴I，¹²⁵I，¹³¹I，¹³³Xe，¹⁷⁷Lu，²¹¹At或²¹³Bi。所述的标记物可以为荧光标记物，例如稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类型，例如但不限于FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；若丹明类型，例如但不限于TAMRA；丹黄酰类；丽丝胺；花青素；藻红蛋白；Texas红；以及它们的类似物。

甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1)，简称TTF-1，或TITF1、NKX2-1等，表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。在肺肿瘤研究中发现，大多数肺的小细胞癌、原发性和转移性肺腺癌、少部分大细胞未分化肺癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示为TTF-1阳性，在甲状腺乳头状腺癌中TTF-1也呈阳性，而TTF在其它组织中无表达。

由于外泌体/细胞外囊泡的形成机制目前还不完全清晰，而且实际上细胞和外泌体的核酸及蛋白谱并不相同，因此本领域技术人员实际上难以确定细胞表达的标志物也一定在外泌体表达。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括在步骤3)之后去除复合物上非特异吸附的外泌体的步骤，例如用洗涤缓冲液洗涤以去除非特异吸附的外泌体。

在一个实施方案中，洗涤缓冲液可以为含有0.1-10％BSA的PBS，例如，含有0.1％，1％，3％，5％，或10％的PBS。本领域技术人员可以理解，洗涤缓冲液的作用是洗涤去除非特异性吸附的外泌体，例如，表面没有TTF-1的外泌体。因此，能够实现所述作用的任何洗涤缓冲液均可用于本发明的方法中。

在一个实施方案中，通过用洗脱缓冲液洗脱来从以结合剂-外泌体的复合物释放出外泌体。

在一个实施方案中，用于本发明的洗脱缓冲液可以为含50mM HAc-Na，150mMNaCl，pH 2.9的缓冲液。本领域技术人员可以理解，洗脱缓冲液的作用是从结合特异性吸附的外泌体的载体上洗脱所述特异性吸附的外泌体。因此，能够实现所述作用的任何洗脱缓冲液均可用于本发明的方法中。

在一个实施方案中，用于本发明的磁珠浓度可以为1*10⁶个/ml至1*10⁹个/ml，例如，1*10⁷个/ml至1*10⁸个/ml，优选3*10⁷个/ml。在一个实施方案中，用于本发明的树脂浓度为1*10⁵个/ml至1*10⁸个/ml，例如，1*10⁶个/ml至1*10⁷个/ml，优选5*10⁶个/ml。

在一个实施方案中，所述结合甲状腺转录因子1的结合剂为抗甲状腺转录因子1的抗体，优选单克隆抗体，优选地，其浓度为1～10μg/ml，优选2μg/ml。

在一个实施方案中，所述总外泌体/总细胞外囊泡与结合甲状腺转录因子1的结合剂温育0.5～12小时，优选1小时。

在一个实施方案中，可以通过手动颠倒混匀或在旋转仪上旋转进行洗涤。例如，采用手动颠倒混匀5次或在旋转仪上旋转混匀30秒进行洗涤。

在一个实施方案中，本发明还涉及通过所述方法分离得到的细胞外囊泡群或外泌体群。

在一个实施方案中，本发明还涉及所述细胞外囊泡群或外泌体群用于mRNA、microRNA、蛋白质等标志物检测的用途。

在一个实施方案中，本发明还涉及结合甲状腺转录因子1的结合剂用于制备细胞外囊泡或外泌体分离或检测试剂的用途。所述结合剂是选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体；优选地，所述外泌体是肺或甲状腺来源外泌体。

在一个实施方案中，本发明还涉及一种用于从生物体液中分离甲状腺转录因子1阳性的细胞外囊泡或外泌体的试剂盒，或肺或甲状腺来源细胞外囊泡或外泌体的试剂盒，其包括结合甲状腺转录因子1的结合剂，任选地还包括用于去除红细胞和/或白细胞源细胞外囊泡的结合剂。所述结合剂可以是选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体；优选地，所述外泌体是肺或甲状腺来源外泌体；优选地，所述生物体液包括：血液、血清、血浆、尿、痰、腹水、唾液、支气管肺泡灌洗液、泪液、口咽洗液、排泄物、腹水液、胸腔积液、眼泪、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、胆汁、粪便、细胞培养上清液或其任意组合。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中所用材料和试剂等，如无特殊说明，均是购买自商业化试剂。相应的试剂并非仅限制于下述的公司与型号，亦可采用其他公司的相应型号产品或自行合成。

实施例

如无特别说明，本发明实施例中所用的缓冲液为PBS缓冲液。洗涤缓冲液为PBS加入0.1％/1％/3％/5％/10％牛血清白蛋白(BSA)所配制。洗脱缓冲液为50mM HAc-Na，150mMNaCl，pH 2.9。捕获载体为9.1μm链霉亲和素磁珠(SBI)和4.5μm链霉亲和素磁珠(ThermoScientific)、SA-Resin(thermo)：Pierce Streptavidin PlusμLtraLink Resin,2mL settled resin。所用抗体为生物素化的抗-TTF-1抗体(生物素化)(novusbio)、GPA抗体(生物素化)(Thermo)、CD-45抗体(生物素化)(abcam)、CD-81抗体(LSBio)和CD-63抗体(LSBio)。

实施例1特异细胞外囊泡/外泌体捕获分离方法

1.1样品前处理并获得无背景干扰总细胞外囊泡或总外泌体

1.1.1总细胞外囊泡或总外泌体富集

利用PEG沉淀或分子色谱排阻(SEC)法从样品(血液、尿液、胸腹水、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液)中提取纯化出总细胞外囊泡或总外泌体。具体步骤如下：

1)PEG沉淀法富集总细胞外囊泡

500μL血清/血浆加入120μL PEG8000沉淀剂，250μL胸腹水加入60μL PEG8000沉淀剂；上下颠倒5次混匀后，在4-8℃静置30分钟；然后13000rpm离心2分钟，吸弃上清留沉淀，加入100μLPBS重悬混匀，即得到总细胞外囊泡。

2)分子色谱排阻(SEC)法富集总外泌体

预处理后的样本，加入到贴壁加入到平衡后的SEC柱内，待样本混合液完全进入凝胶后，向柱中加入PBS并收集流出液，然后将收集到的洗脱缓冲液加入到超滤管中，12000g离心5min(5000g,10min)，超滤浓缩即可富集到的总外泌体。

样本上样量为：血清/血浆500μL(用PBS稀释至1ml)、尿液20ml、胸腹水500μL、细胞上清液20ml、肺泡灌洗液5ml。

3)超速离心法富集总外泌体

预处理后的样本，采用超速离心法(4℃，120000g离心4h)，沉淀用100μLPBS重悬混匀，即得到总细胞总外泌体。

1.1.2负向靶标筛选去除背景细胞外囊泡/外泌体干扰

利用负筛靶标抗体与捕获载体(磁珠、树脂)为反应体系，从上述总细胞外囊泡或总外泌体中负向去除红细胞和白细胞来源的细胞外囊泡/外泌体背景干扰，其方法如下：

1)利用末端修饰有生物素的抗体(GPA和CD-45)与表面修饰有链霉亲和素的捕获磁珠为反应体系，反应体系中磁珠浓度为1×10⁷-1×10⁸个/ml，缓冲液(PBS)200μL，室温旋转(10转/min)混匀30-60min共温育。温育完成后将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉磁珠复合沉淀，吸取上清液(上清液即为去除红细胞和白细胞来源干扰的外泌体或细胞外囊泡)。

2)或采用表面修饰有链霉亲和素的捕获树脂与事先制备好的外泌体-生物素化抗体复合物(抗体GPA、CD-45与总外泌体室温旋转(10转/min)温育30min)为反应体系，体系中树脂浓度为1×10⁶-1×10⁷个/ml，缓冲液(PBS加入1％BSA)1000μL，室温旋转(10转/min)温育30min。温育结束后，3000-5000×g离心1min，进行分离，去掉树脂复合沉淀，吸取上清液(上清液即为去除红细胞和白细胞来源干扰的外泌体或细胞外囊泡)。

1.2.免疫亲和磁珠捕获分离细胞外囊泡

1.2.1制备单克隆抗TTF-1抗体修饰的用于识别、捕获特异细胞外囊泡的免疫磁珠的步骤如下：

1)利用末端修饰有生物素的单克隆抗TTF-1抗体与表面修饰有链霉亲和素的磁珠为反应体系，反应体系中磁珠浓度为1×10⁷-1×10⁸个/ml，缓冲液(PBS加入3％BSA)200μL，室温旋转(10转/分钟)混匀30-60分钟共温育。

2)温育完成后将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。

3)加入500μL的洗涤缓冲液(PBS加入3％BSA)，颠倒充分混匀，洗涤沉淀磁珠2-3次，以除去非特异性吸附的抗体，得到修饰有抗体的用于识别捕获细胞外囊泡特异标志物的免疫磁珠。

1.2.2利用修饰有单克隆抗TTF-1抗体的磁珠识别并捕获细胞外囊泡/外泌体样品

1)将上述修饰有单克隆抗TTF-1抗体的免疫磁珠与样本(样本经过负筛靶标抗体与捕获载体(磁珠、树脂)的反应体系负向去除红细胞和白细胞来源的细胞外囊泡/外泌体)细胞外囊泡/外泌体混合、混匀。

2)4℃、旋转温育1小时(10转/分钟)。

3)温育完成后将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。

4)加入500μL的洗涤缓冲液(PBS加入3％BSA)，颠倒充分混匀，洗涤沉淀磁珠2-3次，以除去非特异性吸附的外泌体，得到免疫磁珠与特异细胞外囊泡/外泌体复合物。

1.2.3特异细胞外囊泡/外泌体分离释放

1)上述磁珠与特异细胞外囊泡/外泌体复合物，加入洗脱缓冲液(50mM HAc-Na、150mM NaCl pH 2.9)200μL，震荡反应10分钟，

2)4℃、旋转温育30分钟(10转/分钟)。

3)温育完成后将样品放置在磁力架上静止3分钟沉淀，然后吸取上清液，即得完整分散的组织特异性细胞外囊泡/外泌体。

1.3免疫亲和树脂捕获分离外泌体

1.3.1制备细胞外囊泡或外泌体-特异性抗体复合物方法是：

细胞外囊泡/外泌体样品与生物素化抗体(2-4μg)室温温育1小时，形成细胞外囊泡/外泌体-生物素化抗体复合物；

1.3.2利用树脂捕获特异细胞外囊泡/外泌体

1)将处理后的表面修饰有链霉亲和素的树脂(载体介质)与细胞外囊泡/外泌体-生物素化抗体复合物混合温育，反应体系中树脂浓度为1×10⁶-1×10⁷个/ml，缓冲液(PBS加入1％BSA)1000μL，室温旋转(10转/min)温育60min。

2)温育结束后，3000-5000×g离心1min，弃上清；然后再用结合缓冲液(0.1M磷酸盐,0.15M NaCl；pH 7.2)清洗2次，3000-5000×g离心1min，弃上清；

3)洗涤：反应后的树脂-外泌体或细胞外囊泡-生物素化抗体复合物3000-5000×g离心1min，弃上清(上清可留样检测)；然后再用结合缓冲液(0.1M磷酸盐,0.15M NaCl；pH7.2)清洗3-4次，3000-5000×g离心1min，弃上清；

1.3.3特异细胞外囊泡/外泌体分离释放

1)上述树脂与特异细胞外囊泡/外泌体复合物，加入洗脱缓冲液(0.1M Gly-HCl(PH 2.8，含1％SDS))200μL。

2)4℃、旋转温育30min(20转/min)。

3)温育完成后将样品3000-5000×g离心1min，然后吸取上清液，即得完整分散的组织特异性细胞外囊泡/外泌体。

实施例2特异外泌体捕获分离方法体系优化对比

2.1捕获载体优化

2.1.1捕获载体磁珠筛选

考虑到磁珠分散性、沉降、非特异吸附性等原则，另外考虑到磁珠粒径越大(比表面积越大，相应与靶标结合的位点越多)，则捕获效率会更高。所以选择2款粒径超过1μm并且已经成熟商业化的磁珠进行对比验证。

验证方法与步骤如下：

1)两款磁珠各取10μL与30μg外泌体室温旋转(10转/min)温育15min,PBS再稀释至1mL室温旋转30min

2)终止反应：含100mM甘氨酸，2％BSA的PBS室温旋转30min

3)含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

4)封闭：10％BSA的PBS室温旋转(10转/min)30min

5)含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

6)加入TTF-1一抗在4℃温育60min(10μL抗体加入100μL含2％BSA PBS重悬的外泌体-磁珠复合物)

7)14800g离心1min弃掉上清，含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

8)避光操作：加入荧光二抗4℃温育60min(5μL抗体加入500μL含2％BSA PBS重悬的外泌体-磁珠复合物)

9)14800g离心1min弃掉上清，含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

10)加入500μL PBS混匀后，流式上机检测。

采用(SBI)9.1μm Exo-Flow磁珠和(Thermo)4.5μm磁珠分别捕获肺癌H1975细胞上清外泌体流式验证，如图2，表1所示：(SBI)9.1μm磁珠捕获效率优于(Thermo Scientific)4.5μm磁珠。

表1

2.1.2捕获载体磁珠量的优化

验证方法如下：

采用超速离心方法获得肺癌H1299细胞(中科院细胞库采购)上清总外泌体，等分为6份，加入对应量磁珠捕获验证。

1)采用不同量(1x10^7至6x10^7个/ml)(SBI)9.1μm磁珠和相同抗体量(4μg/ml)分别捕获上述对应细胞外泌体

2)采用外泌体RNA分离试剂盒(Exosomal RNA Isolation Kit)提取纯化外泌体总RNA

3)然后RT-PCR检测外泌体RNA(GAPDH)表达量，分析。

RT-PCR检测体系：

热循环程序：

表2

磁珠浓度(个/ml)	mRNA(CP值)
		1x10^7个磁珠	29.625
2x10^7个磁珠	28.425
		3x10^7个磁珠	27.185
4x10^7个磁珠	27.61
		6x10^7个磁珠	27.565

如图3，表2所示：当磁珠量达到3x10^7个磁珠/ml时既已达到了饱和状态。同理验证捕获树脂量达到5x10^6Resin/ml左右时也达到了饱和状态。

2.2捕获抗体量优化

验证方法如下：

采用超速离心方法获得肺癌H1299细胞上清外泌体，等分为6份，加入对应量抗体捕获验证。

1)30μg外泌体与10μL Beads室温旋转温育15Min,PBS再稀释至1mL室温旋转30min

2)终止反应：含100mM甘氨酸，2％BSA的PBS室温旋转30min

3)含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

4)封闭：10％BSA的PBS室温旋转30min

5)含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

6)加入TTF-1一抗在4℃温育60min(1μg-6μg不同量抗体加入100μL含2％BSA PBS重悬的外泌体-磁珠复合物)

7)14800g离心1min弃掉上清，含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

8)避光操作：加入FITC荧光二抗4℃温育60min(5μL抗体加入500μL含2％BSA PBS重悬的外泌体-磁珠复合物)

9)14800g离心1min弃掉上清，含2％BSA的PBS洗涤两次(14800g离心1min)

10)加入500μL PBS混匀，流式检测。

表3

TTF-1生物素化抗体量/ml	FITC荧光
		1μg	32392.4
2μg	43829
		3μg	34381.1
4μg	33406.9
		5μg	30755.1
6μg	32929.7

采用(SBI)9.1μmμm 3x10^7beads磁珠捕获肺癌H1299细胞上清外泌体荧光流式检测验证，如图4，表3所示：当抗体量达到2μg/ml时即已达到了最佳捕获效果。

2.3捕获时间优化

验证方法如下：

采用超速离心方法获得肺癌H1299细胞上清总外泌体，等分为6份，按照不同时间进行磁珠捕获验证。

1)采用(3x10^7个/ml)(SBI)9.1μm磁珠和相同抗体量(2μg/ml)按照下表(表4)不同捕获温育时间分别捕获上述对应细胞外泌体

3)然后RT-PCR检测外泌体RNA(GAPDH)表达量，分析(方法同本实施例2.1.2步骤3))。

表4

捕获肺癌H1299细胞上清外泌体mRNA(GAPDH)表达量RT-PCR检测验证，如图5，表4所示：当捕获温育时间在1h左右时既已达到了最佳捕获效率。

2.4洗涤方式优化

验证方法如下：

采用超速离心方法获得肺癌H1299细胞上清总外泌体，等分为2份，按照不同捕获洗涤方式进行磁珠捕获验证。

1)采用(3x10^7个/ml)(SBI)9.1μm磁珠和相同抗体量(2μg/ml)按照下表(表5)不同捕获温育时间分别捕获上述对应细胞外泌体

2)捕获温育后，加入洗涤缓冲液，分别采用手动颠倒混匀5次和在旋转仪上旋转混匀30sec进行洗涤效果比对评价

3)然后采用荧光流式检测分析(方法同本实施例2.1.1部分)。

结果：

表5

检荧光流式检测验证如表5所示：转仪旋转30sec洗涤效果最佳。

2.5捕获载体磁珠与树脂捕获效果对比

验证方法如下：

1)采用两种载体(磁珠、树脂)对比捕获不同类型(血液、尿液、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本TTF-1阳性外泌体(方法分别同实施例1的1.2、1.3部分)

3)然后RT-PCR检测外泌体RNA(GAPDH)表达量，分析。

表6

如表6所示：对于血浆、胸腹水样本树脂载体捕获效率稍好；对于尿液、细胞上清及细胞灌洗液样本磁珠法稍好，但与树脂对比没有显著性差异。

2.6样本前处理优化(负向筛选)

对于捕获特异外泌体，在正向捕获前，加入(GPA和CD-45)负向筛选去除红细胞和白细胞来源的外泌体(方法同实施例1中1.1.2)，与直接捕获总外泌体对比，采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)验证背景干扰对于捕获TTF-1阳性外泌体的影响。

表7

图6，表7所示：样本加入负向筛选预处理捕获后比未预处理直接正向捕获靶标WB更深(即捕获到的TTF-1阳性外泌体更多)并且无杂带；但外泌体mRNA表达量检测结果显示未预处理直接正向捕获mRNA表达量更高。以上结果说明未反向预处理直接正向捕获存在一定非特异性捕获，加入(GPA、CD-45)负向筛选预处理可有效去除红细胞和白细胞来源的外泌体背景干扰。

实施例3：捕获体系效果验证

3.1.甲状腺转录因子(TTF-1)捕获肺组织和甲状腺组织来源的外泌体

验证方法如下：

1)肺癌、肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、肝癌和胃癌等细胞(中科院细胞库采购)饥饿培养，超速离心富集上清总外泌体

2)采用树脂法捕获不同肿瘤细胞上清分泌的外泌体样本TTF-1阳性外泌体(方法同实施例1的1.3部分)

采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测靶标蛋白TTF-1外泌体蛋白，验证不同组织来源样本能否捕获到TTF-1阳性外泌体。

如图7所示，肿瘤细胞上清外泌体TTF-1亲和捕获后WB检测，肺癌和甲状腺癌组织中可捕获到TTF-1阳性外泌体，乳腺癌组织中可捕获到少量TTF-1阳性外泌体；而乳腺癌、肝癌和胃癌等常见肿瘤组织中未检测到TTF-1阳性外泌体。说明甲状腺转录因子(TTF-1)可捕获到肺组织和甲状腺组织来源的外泌体。

3.2.甲状腺转录因子(TTF-1)捕获特异外泌体纯度验证

验证方法如下：

1)采用树脂法捕获血液样本TTF-1阳性外泌体(方法同实施例1的1.3部分)

2)采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测背景干扰(红细胞和白细胞)来源的外泌体靶标蛋白标志物(GPA和CD-45)。

3)采用NTA测得的外泌体浓度与BSA测得的总蛋白含量的比值，分析(TTF-1)捕获外泌体的纯度。

结果

表8

如图8所示：肺癌血液外泌体TTF-1亲和捕获后WB检测，与肺癌血液总外泌体相比，样本捕获后未检测到外泌体靶标蛋白标志物(GPA和CD-45)。如表8所示：血液样本TTF-1捕获后纯度远远高于捕获前的总外泌体。说明甲状腺转录因子(TTF-1)捕获体系可有效去除(红细胞和白细胞)干扰背景来源的外泌体，以及去除杂蛋白(白蛋白)干扰，保证了外泌体纯度。

3.3.甲状腺转录因子(TTF-1)捕获特异外泌体蛋白定量检测

验证方法如下：

2)采用化学发光法检测外泌体蛋白标志物(CD-81)，验证捕获体系批内批间重复捕获后蛋白检测重复性稳定性。

化学发光法蛋白定量检测步骤

a.包板

·化学发光板100μl/孔4℃过夜包板；

·洗板机1×PBST洗板1次，拍干；

·酶标板稳定剂Ⅰ200μl/孔，37℃，2h；

·甩去酶标板稳定剂Ⅰ，拍干，37℃烘干，30min，铝箔袋封装；

b.检测

·标曲、待检样本100μl/孔，37℃，1h；

·洗板机1×PBST洗板3次，拍干；

·抗体100μl/孔，37℃，1h；

·洗板机1×PBST洗板3次，拍干；

·化学发光A、B液1：1混合，100μl/孔，Lumo上机检测

结果：

表9

如表9所示：样本TTF-1捕获阳性外泌体蛋白定量检测，批内和批间重复性和稳定性良好，变异度CV值<10％。

3.4.甲状腺转录因子(TTF-1)捕获不同样本类型肺肿瘤来源的外泌体

验证方法如下：

1)采用树脂法捕获肺癌不同类型(血液、尿液、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本TTF-1阳性外泌体。

2)采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测靶标蛋白TTF-1外泌体蛋白标志物(CD-81)，验证不同样本类型能否捕获到TTF-1阳性外泌体。

如图9所示，甲状腺转录因子(TTF-1)捕获不同类型样本(血液、胸腹水、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)中捕获肺癌肿瘤来源的外泌体。

3.3.甲状腺转录因子(TTF-1)捕获肺来源特异外泌体NTA验证

验证方法如下：

1)采用树脂法捕获不同类型(血液、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本TTF-1阳性外泌体

2)然后经洗脱缓冲液洗脱使外泌体与载体分离，获得游离外泌体(方法同上)

3)采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测(外送服务外包)，确定不同样本类型捕获到TTF-1阳性外泌体分散性、粒径大小及分布情况。

表10

如图10、表10所示：在血液(血清/血浆)中，外泌体捕获试剂盒富集外泌体粒径范围在(80-90nm)，其粒径范围比超速离心、PEG沉淀、SEC、密度梯度离心等方法获得的外泌体更符合经典外泌体大小的报道，且获得的外泌体均匀分散、无团聚现象，不需要重悬混匀。

3.4.甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体流式分析

验证方法如下：

1)采用树脂载体和TTF-1抗体，分别捕获血液及细胞培养上清外泌体

2)然后采用荧光流式检测分析检测外泌体蛋白标志物CD-63荧光(方法同上)。

表11

如图11、表11所示：TTF-1捕获血液及细胞培养上清外泌体后，经流式检测，均检测到外泌体标志物CD-63表达。

3.5.甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体灵敏度(捕获下限))

验证方法如下：

1)肺癌H1299细胞饥饿培养，超速离心法富集上清总外泌体

2)上述总外泌体浓度定量至10E+10颗粒/mL，然后10倍梯度稀释至10E+4颗粒/mL左右

3)树脂载体和TTF-1抗体，分别捕获不同浓度梯度外泌体，NTA检测捕获后外泌体量，分析。

表12

如图12、表12所示，TTF-1捕获分离外泌体体系可捕获到的外泌体下限约为5×10⁵颗粒/mL，且不同梯度外泌体捕获后仍呈良好线性关系，而外泌体10⁵个颗粒/mL浓度以下检测结果与阴性对照组无差异。

实施例4：甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体电镜特征分析

验证方法如下：

1)采用树脂载体和TTF-1抗体，捕获血液外泌体

2)然后采用外泌体电镜检测(外泌肽TEM)技术(外送服务外包)，分析外泌体的大小、形态等。

实施例5：甲状腺转录因子(TTF-1)捕获的外泌体用于后续检测

5.1捕获分离外泌体核酸mRNA检测分析验证

验证方法如下：

1)采用树脂载体和TTF-1抗体，捕获3个重复样本(500μL血浆)中的外泌体；捕获不同类型(血液、尿液、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本TTF-1阳性外泌体(方法同上)

3)然后RT-PCR检测外泌体RNA(ACTB和U6)表达量，分析。

RT-PCR检测体系：

程序：

结果：

表13

提取样本	提取RNA浓度(ng/μL)
		样本1	14.3
样本2	16.5
		样本3	13.5

用3个重复样本，各捕获分离500μL血浆中的外泌体，然后提取RNA进行荧光定量PCR检测。如图14、表13所示：在血液中，甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离的外泌体可有效提取并检测到mRNA。其他生物流体(尿液、胸腹水、细胞上清、唾液、淋巴液等)使用也可达到类似的检测效果。

5.2、捕获分离外泌体核酸miRNA检测分析验证

验证方法如下：

1)采用树脂载体和TTF-1抗体，捕获3例肺癌样本(500μL血浆)中的外泌体(其中1例样本等分2份富集2次作为重复)；捕获不同类型(血液、尿液、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本TTF-1阳性外泌体(方法同上)

2)采用miRNeasy mini试剂盒提取纯化外泌体总miRNA

3)然后RT-PCR分别检测外泌体的miR-484、miR-21和Let-7a的miRNA表达量，分析。

①反转录RT体系：

反转录程序：冰上，5min；PCR仪上：42℃，30min；85℃，5min

反转录产物cDNA稀释5倍后上机PCR验证，使用qPCR分别使用miR-484、miR-21和Let-7a各自的正向引物和反向引物以及探针进行验证。

②qPCR检测体系：

热循环程序：

结果如图15和表14所示：

表14

用3例肺癌样本，各捕获分离500μL血浆中的外泌体(其中1个样本富集2次用作重复)，然后提取miRNA进行荧光定量PCR检测。如图15、表14所示：在血液中，外泌体捕获试剂盒富集外泌体miRNA检测批内批间稳定性(CV％)较好，不同miRNA均<2％。其他生物流体(尿液、胸腹水、细胞上清、灌洗液等)使用也可达到类似的检测效果。

实施例6：甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离的外泌体活性评价

验证方法如下：

1)采用TTF-1捕获体系捕获肺癌中的TTF-1阳性外泌体；

2)采用MTT技术，将TTF-1阳性外泌体与THP-1细胞共培养，通过细胞增殖情况验证捕获到的TTF-1阳性外泌体活性。

MTT试验步骤：

①铺板：胰酶消化对数期细胞，，细胞计数调整浓度至5x10^4/ml，将混合好的细胞悬液分装到6孔板中，每孔加2ml。试验分为三组：空白组，孔中加入2ml完全培养基；对照组，孔中加入细胞悬液；试验组，孔中加入细胞悬液和外泌体，共3块6孔板。

②细胞培养：将6孔板放入co₂恒温培养箱培养。

③分别在0h，8h，16h，24h对6孔板进行处理，每孔加入200ul MTT(5mg/ml)溶液，继续培养4-6h。

④弃培养基，加入150ul DMSO，至于摇床低速震荡10min，溶解沉淀。

⑤在酶标仪检测490nm波长处各个处理组的OD值。

结果(图16)：在0h空白试验和对照组基本无差异，随着培养时间增加(8h至16h)试验组细胞开始生长变慢；至24h时试验组细胞生长显著低于对照组。说明TTF-1阳性外泌体可抑制细胞生长，进而说明所捕获到的TTF-1阳性外泌体具有活性。

实施例7：甲状腺转录因子(TTF-1)捕获分离外泌体miRNA标志物临床应用评价

验证方法如下：

1)采用树脂载体和TTF-1抗体，捕获5例肺(癌)恶性结节和5例健康样本(500μL血浆)中的外泌体；与非捕获组对比，验证外泌体捕获前后临床区分效果。

2)采用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen试剂盒采购货号：217004)提取纯化捕获前后的外泌体总miRNA

3)然后RT-PCR检测外泌体miRNA标志物miR-19b(以miR-16作为内参)表达量，分析。

①引物序列

②反转录RT体系：

反转录程序：冰上，5min；PCR仪上：42℃，30min；85℃，5min反转录产物cDNA稀释5倍后上机PCR验证

③qPCR检测体系：

热循环程序：

结果：

选了5例肺(癌)恶性结节和5例健康样本，对比外泌体捕获前后临床区分效果。肺癌相关肿瘤标志物miR-19b的PCR检测结果(图17)显示：甲状腺转录因子(TTF-1)可以捕获到肺组织来源的外泌体，捕获后健康组表达分布相对更集中，原因是捕获出了肺组织特异外泌体，并且去除了大部分白细胞和红细胞干扰，使临床效果更好。

实施例8：不同捕获方法的比较

一、实验组及对照组设置：

实验组：实施例1的方法，其中采用分子色谱排阻(SEC)法富集总外泌体，免疫亲和载体采用树脂。

对照组1：TTF-1免疫亲和载体直接捕获血浆样本中目标细胞外囊泡

1.TT1-1免疫亲和载体制备

1)将末端修饰有生物素的TTF-1抗体2μg和表面修饰有链霉亲和素的载体15μL(SA-树脂)(树脂浓度为1×10⁶-1×10⁷个/ml)加到200μL缓冲液(PBS加入1％BSA，)中，室温旋转(10转/min)混匀30-60min共温育。

2)3000-5000×g离心1min，弃上清；

3)然后再用缓冲液(PBS加入1％BSA)500μL清洗2次去除游离抗体，3000-5000×g离心1min，弃上清，得到捕获用的免疫亲和载体；

2.利用免疫亲和载体直接捕获血浆样品中的目标细胞外囊泡

1)将TTF-1免疫亲和载体与血浆样本(上海胸科医院收集)(200-500ml)直接混合、混匀(血浆预处理：样本经：4℃、3000g离心15min，除去沉淀和脂质层)。

2)4℃、旋转温育1h(10转/min)。

2)3000-5000×g离心1min，弃上清；

3)然后再用缓冲液(PBS加入1％BSA)500μL清洗3次去除未结合的细胞外囊泡：3000-5000×g离心1min，弃上清；得到载体(树脂)与目标细胞外囊泡复合物。

3.目标细胞外囊泡分离释放

1)上述载体与特异外泌体复合物，加入洗脱液(50mM HAc-Na、150mM NaCl pH2.9)200μL，震荡反应10min，

2)4℃、旋转温育30min(10转/min)。

3)3000-5000×g离心1min，然后吸取上清液，即得完整分散的组织特异性细胞外囊泡。

对照组2：血浆样本经物理法富集总外泌体后直接正向捕获目标外泌体(不经负向筛选)。

1.利用SEC法从血浆中富集总外泌体(方法同实施例1)

2.TTF-1免疫亲和载体制备(方法同对照组1)

3.用TT1-1免疫亲和载体直接捕获血浆总外泌体中的目标外泌体(方法同对照组1)

4.目标外泌体分离释放(方法同对照组1)

对照组3：血浆样品未经物理分离，直接经GPA、CD-45抗体负向去除背景细胞外囊泡后再用TTF-1抗体正向捕获目标细胞外囊泡。

1.正向和负向免疫亲和载体制备

1)分别将末端修饰有生物素的负向抗体(GPA、CD-45)和正向抗体TTF-1各2μg和表面修饰有链霉亲和素的载体15μL(SA-树脂)(树脂浓度为1×10⁶-1×10⁷个/m l)加到200μL缓冲液(PBS加入1％BSA，)中，室温旋转(10转/min)混匀30-60min共温育。

2)3000-5000×g离心1min，弃上清；

2.利用负向免疫亲和载体去除血浆样品中的背景细胞外囊泡

1)将负向免疫亲和载体与血浆样品(200-500ml)直接混合、混匀(血浆预处理：样本经：4℃、3000g离心15min，除去沉淀和脂质层)。

2)4℃、旋转温育1h(10转/min)。

2)3000-5000×g离心1min，弃上清；

3)然后再用缓冲液(PBS加入1％BSA)500μL清洗3次去除未结合的细胞外囊泡：3000-5000×g离心1min，然后吸取上清液，即得去除红细胞和白细胞来源细胞外囊泡的血浆样本。

3.利用正向免疫亲和载体捕获去除红细胞和白细胞来源细胞外囊泡的血浆样本中的目标细胞外囊泡

1)将TTF-1免疫亲和载体与经步骤2处理后的血浆样本混合、混匀。

2)4℃、旋转温育1h(10转/min)。

2)3000-5000×g离心1min，弃上清；

4目标细胞外囊泡分离释放(同对照组1)

二、捕获结果验证

采用NTA测得的外泌体(或细胞外囊泡)浓度与BSA测得的总蛋白含量的比值，分析捕获到的外泌体(或细胞外囊泡)的纯度。然后RT-PCR检测外泌体(或细胞外囊泡)miRNA(miR-16)表达量，并进行分析，所用引物具体序列如下表：

①反转录RT体系：

②qPCR检测体系：

热循环程序：

结果如表1、表2所示。

表1

表2

如上表所示：与实验组相比，对照组1血浆样本直接TTF-1捕获后，所获得的细胞外囊泡纯度较差(总蛋白量很高但获得的外泌体量少)，并且外泌体miRNA量更低(CP值变大)，原因推测样本中存在的大量游离TTF-1蛋白会被捕获到，从而影响TTF-1阳性外泌体的捕获效率。

对照组2血浆样本经物理法富集总微囊泡后直接正向捕获TTF-1阳性外泌体所获得的外泌体miRNA表达量与实验组基本相同，但其获得的外泌体纯度稍差。

对照组3血液样本直接负向去除干扰外泌体后捕获TTF-1阳性细胞外囊泡所获得的外泌体纯度及miRNA表达量均比实验组略差。

综合说明对照组的方法也能捕获得到目标外泌体或细胞外囊泡，也能进行后续的检测，但捕获得到的外泌体纯度或部分miRNA检测效果略差，部分检测效果相当；实验组的方法捕获目标外泌体效率最高，最适于后续检测。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从生物体液中分离甲状腺转录因子1阳性的细胞外泌体的方法，包括：

步骤1)根据细胞外泌体的物理参数，对所述生物体液通过物理方法分离获得总细胞外泌体；

步骤2)使用红细胞和/或白细胞通用的结合剂与所述总细胞外泌体接触，除去被结合剂结合的红细胞和/或白细胞源的细胞外泌体；

步骤3)使用特异性结合甲状腺转录因子1的结合剂进一步正向捕获，得到结合剂-细胞外泌体复合物；

其中所述结合剂-细胞外泌体复合物直接用于释放出细胞外泌体，其中所述细胞外泌体为肺或甲状腺来源的外泌体。

2.根据权利要求1的方法，其中所述物理方法为尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、微流体分离。

3.根据权利要求1的方法，其中所述红细胞和/或白细胞通用的结合剂是结合选自GPA、CD45、CD16、CD19、CD3、CD50、CD69的一种或多种生物标记的一种或多种结合剂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述结合剂为抗体或其抗原结合片段。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体为合成抗体。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体为单链抗体。

8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述结合剂是单克隆抗体。

9.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述结合剂可以与固体表面或载体直接或间接相连。

10.根据权利要求9的方法，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合。

11.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述生物体液包括：血液、血清、血浆、尿、痰、腹水、唾液、支气管肺泡灌洗液、泪液、口咽洗液、排泄物、腹水液、胸腔积液、眼泪、心包液、淋巴液、食物糜、胆汁、粪便、细胞培养上清液、乳汁或其任意组合。

12.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。

13.根据权利要求1-3任一项的方法，其还包括在步骤3)之后去除复合物上非特异吸附的细胞外泌体的步骤。

14.根据权利要求13的方法，其中所述去除复合物上非特异吸附的细胞外泌体的步骤为用洗涤缓冲液洗涤以去除非特异吸附的细胞外泌体。

15.根据权利要求1-3任一项的方法，其中通过用洗脱缓冲液洗脱所述结合剂-细胞外泌体复合物释放细胞外泌体。

16.权利要求9所述的方法，其中所述载体为磁珠或树脂。

17.权利要求16所述的方法，其中磁珠浓度为1*10⁷个/ml至1*10⁸个/ml；和/或所述树脂浓度为1*10⁶个/ml至1*10⁷个/ml。

18.权利要求16所述的方法，其中磁珠浓度为3*10⁷个/ml，和/或所述树脂浓度为5*10⁶个/ml。

19.权利要求9所述的方法，其中所述结合甲状腺转录因子1的结合剂为抗甲状腺转录因子1的抗体。

20.权利要求19所述的方法，其中所述结合甲状腺转录因子1的结合剂为抗甲状腺转录因子1的单克隆抗体。

21.权利要求19所述的方法，其中所述结合甲状腺转录因子1的结合剂浓度为1～10μg/ml。

22.权利要求19所述的方法，其中所述结合甲状腺转录因子1的结合剂浓度为2μg/ml。

23.权利要求9所述的方法，其中经步骤1)或2)处理后的溶液与结合甲状腺转录因子1的结合剂温育0.5～12小时。

24.权利要求9所述的方法，其中经步骤1)或2)处理后的溶液与结合甲状腺转录因子1的结合剂温育1小时。

25.特异性结合甲状腺转录因子1的结合剂用于制备肺或甲状腺来源的外泌体分离试剂的用途,其中所述外泌体是甲状腺转录因子1阳性的。

26.权利要求25所述的用途，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。

27.权利要求26所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

28.权利要求26所述的用途，其中所述抗体为合成抗体。

29.权利要求26所述的用途，其中所述抗体为单链抗体。

30.权利要求25所述的用途，其中所述结合剂是单克隆抗体。