CN111849877A - 一种心脏细胞外泌体的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种心脏细胞外泌体的制备和应用。本发明的目的在于提供一种治疗心血管及肢体缺血性疾病的外泌体，它制备方法简单，高效低毒，能有效预防和治疗心肌梗死相关疾病和肢体缺血性疾病。具体涉及从人心脏组织中提纯一种c‑Kit+细胞，培养方法，分离外泌体方法，该外泌体分离方法克服了传统方法的不足，产量高、周期短、效果好。此外，临床上尚无有效治疗心肌梗死后导致的心衰、心肌肥大以及室壁瘤的有效药物，该外泌体可以在体外促进人脐静脉内皮细胞的血管新生，体内局部注射使用可有效改善肢体缺血的组织和血管的修复，可应用于治疗心肌梗死导致的心衰、心肌肥大、室壁瘤、肢体缺血等，药理作用明确，用量很小，无毒副作用。

Description

一种心脏细胞外泌体的制备和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种心脏细胞外泌体的制备和应用。
背景技术
本发明所述心脏细胞，为心脏c-Kit+细胞，它是心脏组织中未成熟分化的一小群心脏细胞，可以分化为前体细胞，心脏c-Kit+细胞具有促进心肌细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管生成、减少心肌纤维化等有益作用，能够增加心肌血流量，减轻炎症反应，缩小心肌梗死后瘢痕面积，预防缺血/再灌注后心肌损伤，从而改善心脏功能。根据心脏细胞的不同特性和表面标志物进行鉴定，心脏祖细胞可作如下分类：c-Kit+、侧群干细胞、Sca-1+、心肌球细胞簇和心肌球来源的细胞簇等。其中，c-Kit+心脏细胞是发现最早且研究最为广泛和深入的一类心脏细胞。
本发明所述的心脏c-Kit+细胞外泌体，不同类型的细胞包括心脏细胞，在正常或病理条件下均可分泌外泌体，产生外泌体的细胞来源不同，生物学功能也不尽相同。外泌体携带有分泌细胞来源的蛋白质、脂质、核酸、细胞因子、病原体以及自身抗原等生物活性分子，包括mRNA、miRNA、长链非编码RNA(LncRNA)和DNA等。在体内，外泌体可以被相邻的细胞内吞或随血液循环与一定距离内的靶细胞相互作用，进而影响受体细胞的生理功能。心脏细胞作为一类前体细胞，有更强的分泌外泌体的能力。
本发明的目的在于提供一种心脏细胞外泌体的制备和应用，可局部给药，促进血管新生作用明确。缺血性心脏病是世界范围内发病率和死亡率很高的疾病，近年来发病呈年轻化趋势，严重危害人类健康。尽管现代医学取得了重大进展，经皮冠状动脉介入或药物溶栓等早期再灌注治疗显著降低了急性心肌梗死的死亡率，但这些治疗方法均不能挽救由严重缺血引起的心肌细胞广泛和不可逆性丢失，大多数患者都不可逆转地发展为心肌损伤，并由此发展为心力衰竭。目前心力衰竭尚无有效的治疗方法，患者的预后比大多数癌症患者差，发病后平均生存期仅为3-5年。因此，如何修复/再生受损的心肌细胞是目前心衰治疗中的重点和难点问题。国内外尚没有关于人c-Kit+心脏细胞的外泌体局部使用促进血管新生和修复心肌的报道，本发明制备方法简单稳定，为修复受损心肌的治疗带来机遇。
发明内容
本发明提供一种心脏细胞外泌体的制备和应用,作用效果明确，为了明确其上述作用,本发明提供如下技术方案：
优选地，将心脏手术患者术后切除的心脏组织，放入无钙心脏停跳液中，剪成大小约1mm3的组织碎块，用心脏细胞消化分离液分离出所有心脏细胞，应用CD117蛋白抗体免疫磁珠法，筛选人心脏c-Kit+细胞，筛选后培养扩增，细胞在2-10代用于收集培养基，分离培养基中的外泌体。当细胞融合至80-90％时，加入无血清无外泌体培养基，培养24-96小时，收集培养基，应用梯度离心法分离培养基中的外泌体，溶于PBS中，制作为针剂，可用于治疗肢体缺血的血管修复和急性心梗引起的缺血性心肌病、心衰、心肌瘤等。挑选年龄在0-5岁组织样本分离，取心脏c-Kit+细胞增殖的2-5代，这样的细胞增殖速度最快，分泌的外泌体量最多，作用效果最好。
优选地，所述无钙心脏停跳液(calcium-free cardioplegic solution)配方如下：磷酸二氢钾(CAS：7778-77-0)6.81g，硫酸镁(CAS：7487-88-9)1.97g，腺苷(CAS：58-61-7)1.34g，甘露醇(CAS：69-65-8)18.22g，葡萄糖(CAS：50-99-7)25.22g，HEPEs(CAS：7365-45-9)2.38g，牛磺酸(CAS：107-35-7)1.25g，用超纯水搅拌溶解，氢氧化钾(CAS：1310-58-3)调节pH为7.3-4，定容至1L，继而用0.22μm Millipore滤膜过滤除菌，使用前需用纯氧气充气5分钟。
优选地，心脏细胞消化分离液为，1L灭菌水里包含氯化钠8.00g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.15g、磷酸二氢钾0.20g、用去离子水搅拌溶解，盐酸或氢氧化钠调节pH为7.4、高压灭菌，使用时每5ml心脏细胞消化分离液中再加入0.05ml青霉素-链霉素100x混合液(Thermo fisher公司)，以及0.2gII型胶原酶(R&D Systems)和0.2g胰蛋白酶(R&DSystems)。
优选地，所述无钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液(CMF-DPBS)配置方法如下：氯化钠(7647-14-5)8.00g，氯化钾(7447-40-7)0.20g，磷酸氢二钠(7558-80-7)1.15g，磷酸二氢钾(7778-77-0)0.20g，用去离子水搅拌溶解，盐酸(7647-01-0)或氢氧化钠(1310-73-2)调节pH为7.4，定容至1L，高压灭菌处理后4℃保存。
优选地，所述心脏细胞专用培养基配方如下：IMDM培养基(Gibco公司，Cat No：12440-053)500ml，胎牛血清FBS(Biological Industries公司，Cat No：04-400-1B)50ml，EGF(Gibco公司，Cat No：PHG0266)2.5ug，b-FGF(Gibco公司，Cat No：PHG0311)2.5ug，β巯基乙醇(Gibco，Cat No：21985-023)0.5ml，L型谷氨酰胺(L-Glutamine)(Gibco公司，Cat No：A2916801)5ml，青霉素-链霉素混合液(Gibco公司，Cat No：15140122)5ml。
优选地，细胞培养基最佳收集时间为72小时，此时间段产生的外泌体量达到最大值，而且细胞可以保持较佳状态。
优选地，梯度离心分离方法如下：收集的心脏c-kit+细胞培养基，在高速低温离心机中4℃下转速为300g离心力离心10分钟，弃去培养基中的细胞沉淀，收集上清液；上清液再次以4℃下2000g离心15分钟，弃去培养基中的死细胞，收集上清液；上清液再次以4℃下10000g离心45分钟，收集上清液，弃去沉淀中的其他杂质；4℃下120000g离心90分钟，弃上清，用PBS清洗沉淀，溶液在4℃下120000g再离心90分钟，沉淀即为外泌体，加入少量PBS溶解。
优选地，将外泌体溶解于pH7.3-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)溶解，外泌体的浓度为1-2mg/ml，
优选地，此发明可以在体外促进血管内皮细胞的血管生成作用，有效浓度范围为0.01-1ug/ml,最佳使用终浓度为0.1ug/ml。
优选地，此发明局部多点注射，用于治疗缺血动物后肢的修复，有效作用量的范围为1-100ug/25g(外泌体质量/动物体重),最佳使用终浓度为10ug/25g(外泌体质量/动物体重)。
下面结合具体实施例进一步阐明本发明的作用，应理解，这些实施案例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
目前，国国内外尚没有关于人c-Kit+心脏细胞的外泌体局部使用促进血管新生和修复心肌的报道，本发明制备方法简单稳定，局部使用，对肢体缺血疾病和急性心梗或冠心病有较好效果，可用于治疗心梗引起的缺血性心肌病、心衰以及室壁瘤的心肌和血管修复，药理作用明确，用量很小，无毒副作用。
附图说明
图1为本发明的整体流程图。
图2为分离的心脏c-kit+细胞的图片。
图3为本发明所用细胞的鉴定结果。
图4为电子显微镜鉴定本发明。
图5为western blot检测外泌体相关标志蛋白Alix、CD9和CD63。
图6为本发明对人脐静脉内皮细胞血管新生作用对照图。
图7为本发明对后肢缺血小鼠后肢修复效果对照图。
图8为本发明对心肌梗死小鼠心功能改善对照图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
本发明的整体流程
如图1所示，为本发明的详细流程：
1：心脏组织处理：收集手术后即将弃用的心肌组织，剪成大小1mm3的组织碎块，放入无钙心脏停跳液，再用心脏细胞消化分离液分离心脏组织中的所有心脏细胞，使用微孔滤网过滤；
2：获取大量心脏细胞：用心脏细胞专用培养基大量扩增；
3：分选c-Kit+细胞：用免疫磁珠分选方法筛选出人心脏c-Kit+细胞，用CD117(c-kit)抗体标记分离扩增的所有细胞，再用标记磁珠的二抗标记细胞，用磁铁吸附细胞，清洗其他细胞，即得到磁性标记的心脏CD117(c-kit)阳性细胞。
4：收集培养基：用心脏细胞专用培养基扩增培养筛选出的心脏c-Kit+细胞，待细胞融合至80-90％时，加入无血清无外泌体的IMDM培养基，培养48-72小时；
5：获取外泌体，应用梯度离心法分离得到外泌体，收集的心脏c-kit+细胞培养基，在高速低温离心机中4℃下转速为300g离心力离心10分钟，弃去培养基中的细胞沉淀，收集上清液；上清液再次以4℃下2000g离心15分钟，弃去培养基中的死细胞，收集上清液；上清液再次以4℃下10000g离心45分钟，收集上清液，弃去沉淀中的其他杂质；4℃下120000g离心90分钟，弃上清，用PBS清洗沉淀，溶液在4℃下120000g再离心90分钟，沉淀即为外泌体，加入少量PBS溶解；将外泌体溶于PBS中，制为针剂。
6：体内和体外评估疗效：分别在血管内皮细胞，后肢缺血小鼠和心梗小鼠体内评估外泌体疗效。
实施例2
人心脏c-kit+细胞的分离
心脏组织的使用获得厦门大学附属心血管病医院伦理委员会批准，心脏组织来源为厦门大学附属心血管病医院心外科住院的先天性心脏病患儿，无微生物感染，收集年龄为0～5岁先天性心脏病患儿手术切除的右心耳组织，及时置于过氧预冷的无钙心脏停跳液中；用手术镊将心脏组织转移至金属小烧杯中，用过滤除菌的无钙心脏停跳液反复冲洗心脏组织，直至去除组织上附着的脂肪、血凝块等。将冲洗干净的心脏组织转移至新的金属小烧杯中，随后用眼科剪将心脏组织剪成大小约1mm3的组织碎块；在预冷的无菌CMF-DPBS缓冲液中加入1％的青霉素-链霉素混合液，用该含有双抗的冷CMF-DPBS缓冲液冲洗组织碎块至液体澄清，随后转移组织混悬液至15ml离心管中常温1000rpm离心3分钟，弃去上清。随后加入3～5ml的0.1％Ⅱ型胶原酶和胰酶(1:25)的混合液，37℃水浴锅中震荡消化15min；1000rpm离心3分钟，弃去上清，加入IMDM完全培养基，用滴管轻轻吹打消化后的碎组织块，随后种植到6cm细胞皿中，放置于37℃含5％CO2、95％过滤空气的细胞培养箱中培养；一周左右更换培养基(具体换液时间视细胞生长状态而定)，待细胞从组织中爬出并生长融合到80％密度时消化传代；应用CD117抗体通过磁珠分选，步骤如下：1)用CD117(c-kit)抗体(Santa cruz公司)标记分离扩增的所有细胞，2)再用标记磁珠的二抗(Santa cruz公司)标记细胞，3)用磁铁吸附细胞，清洗其他细胞，即得到磁性标记的心脏CD117(c-kit)细胞。
实施例3
人心脏c-kit+细胞的鉴定。
如图3上，应用免疫荧光法检测鉴定c-Kit+心脏细胞，显示所有分离的细胞均阳性表达c-Kit(CD117)蛋白红色；图3下，为用流式细胞术检测的细胞的表面抗原表达，可以看出CD117(c-kit)表达超过99％，由此说明分离筛选的c-Kit+心脏细胞纯度超过99％。
实施例4
人心脏c-kit+细胞中分离外泌体的鉴定
如图4，用电子显微镜观察的人心脏c-kit+细胞中分离的外泌体的照片，显示其大小约为100纳米左右(如图2)；应用western blot方法检测外泌体的标志蛋白Alix、CD9和CD63的表达均为阳性(如图3)，显示分离的颗粒为外泌体。
实施例5
人心脏c-kit+细胞中分离外泌体的鉴定
应用western blot方法检测外泌体的标志蛋白Alix、CD9和CD63的表达均为阳性(如图5)，显示分离的颗粒为外泌体。
实施例6
本发明的血管新生作用
如图6，应用matrigel基质胶方法检测，在人脐静脉内皮细胞中加入阳性对照(全血清培养基)、阴性对照(无血清培养基)和外泌体(无血清培养基含外泌体),结果显示，人心脏c-kit+细胞中分离外泌体对人脐静脉内皮细胞的血管新生有明确促进作用，作用与阳性对照相当，应用ImageJ软件进行血管生成分析，对主段总长度相对阴性对照组分别升高到10余倍，提示人心脏c-kit+细胞中分离外泌体有较强的促进血管内皮细胞的血管新生的作用。
实施例7
本发明对小鼠后肢缺血的血管修复作用。
建立C57BL/6小鼠后肢缺血模型，用10％水合氯醛0.3mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定，左后肢术野脱毛碘伏消毒，解剖游离股动脉全长，逐一结扎切断其分支至腘动脉结扎股浅动脉，在血管四周肌肉5个点注射外泌体，注射外泌体总蛋白量为10微克/只；应用激光散斑检测缺血后肢的血管状况，结果显示：溶剂对照组缺血后肢未见明显血管新生，而人心脏c-kit+细胞外泌体注射组有明显的新生血管出现，提示人心脏c-kit+细胞中分离外泌体对小鼠缺血后肢的修复有非常强的修复作用(见图7)。
实施例8
本发明对对小鼠心梗的血管修复和治疗作用。
建立C57BL/6小鼠心肌梗死模型，用异氟烷气体麻醉小鼠，确认麻醉状态后，备皮，安装后心电图监护仪，皮肤局部消毒，剪开肋间皮肤，钝性分离肌肉，打开心包，挤出心脏，暴露左冠状动脉，6-0无菌丝线快速结扎，之后在结扎下游5个点注射外泌体，每个点10微升，外泌体总蛋白量为10微克/只；模型制作1个月后心脏彩超检测各组小鼠心脏功能，结果显示，注射外泌体后小鼠心脏功能有显著改善，尤其是评估心脏功能的关键指标射血分数(EF值)和缩短分数(FS值)有显著改善(如图8)。

Claims (10)

1.一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：具体制备步骤为：
步骤一：心脏组织处理：收集手术后即将弃用的心肌组织，剪成大小1mm3的组织碎块，放入无钙心脏停跳液，再用心脏细胞消化分离液分离心脏组织中的所有心脏细胞，使用微孔滤网过滤；
步骤二：获取大量心脏细胞：用心脏细胞专用培养基大量扩增；
步骤三：分选c-Kit+细胞：用免疫磁珠分选方法筛选出人心脏c-Kit+细胞；
步骤四：收集培养基：用心脏细胞专用培养基扩增培养筛选出的心脏c-Kit+细胞，待细胞融合至80-90％时，加入无血清无外泌体的IMDM培养基，培养48-72小时；
步骤五：获取外泌体，应用梯度离心法分离得到外泌体，将外泌体溶于PBS中，制为针剂。
2.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述无钙心脏停跳液的配方如下，磷酸二氢钾6.81g、硫酸镁1.97g、腺苷1.34g、甘露醇18.22g、葡萄糖25.22g、HEPEs2.38g、牛磺酸1.25g，用超纯水搅拌溶解，氢氧化钾调节pH为7.3-4，定容至1L，继而用0.22μm Millipore滤膜过滤除菌，使用前用纯氧气充气5分钟。
3.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述心脏细胞消化分离液为，1L灭菌水里包含氯化钠8.00g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.15g、磷酸二氢钾0.20g、用去离子水搅拌溶解，盐酸或氢氧化钠调节pH为7.4、高压灭菌，在使用时每5ml心脏细胞消化分离液中再加入0.05ml青霉素-链霉素100x混合液，0.2gII型胶原酶和0.2g胰蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述微孔滤网过滤微孔滤膜孔径为0.45微米。
5.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：
所述磁珠分选方法步骤如下：
步骤一：用CD117(c-kit)抗体标记分离扩增的所有细胞；
步骤二：再用标记磁珠的二抗标记细胞；
步骤三：用磁铁吸附细胞，清洗其他细胞，即得到磁性标记的心脏CD117(c-kit)细胞。
6.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述心脏细胞专用培养基主要成分为：IMDM培养基500ml、胎牛血清FBS 50ml、EGF 2.5ug、b-FGF2.5ug、β巯基乙醇0.5ml、L型谷氨酰胺5ml、青霉素-链霉素混合液5ml。
7.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述心脏c-Kit+心脏细胞为2-10代,培养时间为48-72小时。
8.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述梯度离心法分离外泌体，具体操作如下：收集的心脏c-kit+细胞培养基，在高速低温离心机中4℃下转速为300g离心力离心10分钟，弃去培养基中的细胞沉淀，收集上清液；上清液再次以4℃下2000g离心15分钟，弃去培养基中的死细胞，收集上清液；上清液再次以4℃下10000g离心45分钟，收集上清液，弃去沉淀中的其他杂质；4℃下120000g离心90分钟，弃上清，用PBS清洗沉淀，溶液在4℃下120000g再离心90分钟，沉淀即为外泌体，加入少量PBS溶解。
9.根据权利要求1所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述外泌体应用pH7.3-7.4的磷酸盐缓冲液溶解，制为针剂，外泌体的浓度为1-2mg/ml。
10.根据权利要求1-6所述的一种心脏细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述针剂注射于缺血肢体、心梗、心衰、心肌瘤、心肌肥大疾病的缺血区域。
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