CN110551680A - 一种提取胸水外泌体的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种提取胸水外泌体的方法和系统，包括：离心分离器，过滤设备和离心分离柱，其中，所述过滤设备能够截留0.45μm直径的物质。离心分离器将胸水进行离心分离获得上清液；过滤设备将上清液进行过滤，得到过滤液；离心柱法从过滤液中提取外泌体。本申请通过一次离心加一次过滤的方法，结合常规的膜亲和离心柱试剂盒，可以高效地从低至5mL的胸水中提取高质量的外泌体，提取的外泌体结构完整、纯度高，可直接用于理化检测、外泌体核酸提取等下游检测实验研究。从而提供了一种快速、简便的胸水外泌体提取方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取生物材料的方法，尤其涉及一种可快速提取胸水外泌体的新方法和系统。
背景技术
外泌体是一种直径在40-100nm左右、由细胞自身分泌或细胞死亡时释放的一种多囊泡体，很多组织例如血液、唾液、尿液、乳汁、胸水(胸腔积液)、腹水等的组织液中都有天然外泌体的存在。外泌体中包含来自于原细胞的蛋白质、脂质、DNA、mRNA和miRNA等多种分子，这些生物分子通过循环系统参与肿瘤等疾病的发生、生长、侵袭和转移等诸多过程，可以作为疾病诊断的生物标志物，在临床诊断和治疗上具有十分重要的意义。例如王燕报道了外泌体miRNA作为三种洗个澡胸腔积液标志物的研究(南昌大学硕士研究所学位论文，2016年)，宋郑波报道了肺癌来源的外泌体促进恶性胸腔积液形成的机制(南京大学博士研究所毕业论文，2018年)，Wang M.等报道了外泌体长非编码RNA在癌症中的功能作用(Cellular and Molecular Life Sciences,2019,Volume 76,Issue11,pp 2059–2076)。
外泌体的分离纯化一直是人们关注的问题，获得高纯度的外泌体至关重要。据了解，目前外泌体提取方法包括有超速离心法(超离法、差速离心法)、聚合物沉淀法(例如PEG-base沉淀法)、分子排阻法(空间排阻色谱法)、超滤法(例如超滤离心法)、磁珠特异捕获法(磁珠免疫法)、亲和色谱法等等，目前以这些技术为基础的外泌体提取商业试剂盒已可以满足血清、血浆、细胞培养液、尿液等一些常见组织来源的外泌体的提取。
其中，超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受？欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。在超离法基础上，还发展了密度梯度离心法和超滤离心法，其中，密度梯度离心法是利用超速离心形成密度阶层，将外泌体进行富集，但是获得的外泌体纯度更高，但步骤繁琐、耗时很长；超滤离心法是采用不同截留相对分子质量的超滤膜进行选择性分离，虽然简单高效，但是纯度不高。
磁珠免疫法是采用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育结合后，将外泌体吸附分离，特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，而且外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
PEG能够与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，从而被用沉淀外泌体，但是PEG沉淀外泌体也存在诸多问题，比如：纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等。
色谱法分离得到的外泌体大小均一，但是需要专门的色谱设备。
近年来，出现了很多商业化的外泌体提取试剂盒，不需要特殊设备，提前效率和纯化速度都逐渐提高，操作更加简单，从而广受欢迎。
但是，对于胸水等杂质较多、成分复杂的其他常见临床来源样本，采用上述方法提取外泌体通常需要几十毫升以上的起始样本量，或者在提取步骤中添加亲水性聚合物等额外物质，或者需要多步离心和沉淀步骤，过程复杂且往往会造成大量的样本损失。
发明内容
针对目前提取胸水外泌体技术存在的问题，本申请提供了一种提取胸水外泌体的方法和系统。
本申请所提供的提取胸水外泌体的方法，包括：
将胸水进行离心分离获得上清液；
将上清液进行过滤，得到过滤液，其中所述过滤能够截留0.45μm直径的物质；采用离心柱法从过滤液中提取外泌体。
在一种优选实施例中，所述的离心分离，离心力优选为5000-50000g，更优选为8000-40000g，更优选为10000-30000g，更优选为12000-20000g，更有选为14000-16000g。
在一种优选实施例中，所述胸水可以是体积≥5ml，例如5-20ml，例如5-15ml，流入5-10ml等。
在一种优选实施例中，所述胸水可以是新鲜获取或者冷冻保存的人胸腔积水。
在一种优选实施例中，所述过滤包括：将过滤器一端密封连接注射器的注射口，上清液置于注射器中，注射器将上清液推至过滤器中进行过滤。
其中，所述上清液可以是在过滤器与注射器连接之前转移至注射器中，和/或，上清液可以是在过滤器与注射器连接之后转移至注射器中。
在一种优选实施例中，所述离心柱法采用膜亲和离心柱法(亲和性膜离心柱法)。例如，通过QIAGEN exoEasy Maxi Kit外泌体提取试剂盒、exoEasy spin column离心柱进行提取。
本申请第二个方面是提供一种提取胸水外泌体的系统，包括：离心分离器，过滤设备和离心分离柱，其中，所述过滤设备能够截留0.45μm直径的物质。
在一种优选实施例中，离心分离器将胸水进行离心分离获得上清液；过滤设备将上清液进行过滤，得到过滤液；离心柱法从过滤液中提取外泌体。
在一种优选实施例中，所述的离心分离器，离心力能够达到、或优选为5000-50000g，更优选为8000-40000g，更优选为10000-30000g，更优选为12000-20000g，更有选为14000-16000g。
在一种优选实施例中，所述过滤设备包括过滤器和注射器，过滤器一端密封连接注射器的注射口。
本申请通过一次离心加一次过滤的方法，结合常规的膜亲和离心柱试剂盒，可以高效地从低至5mL的胸水中提取高质量的外泌体，提取的外泌体结构完整、纯度高，可直接用于理化检测、外泌体核酸提取等下游检测实验研究。从而提供了一种快速、简便的胸水外泌体提取方法。
附图说明
图1为本申请提取胸水外泌体的方法流程示意图；
图2为本申请获取的人胸水外泌体在透射电镜下进行观察的照片；
图3为本申请获取的人胸水外泌体进行粒径和浓度检测(NTA)分析结果；
图4为从本申请获取的人胸水外泌体中提取RNA、DNA结果。
具体实施方式
本申请提取胸水外泌体的系统包括离心分离器，过滤设备和离心分离柱，其中，所述过滤设备能够截留0.45μm直径的物质。
实施例1
参照附图1，本申请提取胸水外泌体的方法，包括：
储存于-80℃的冷冻人胸水5ml进行室温解冻；
待胸水完全解冻后，将胸水进行离心分离获得上清液，离心力为16000g；
过滤器一端与注射器的注射口密封连接，将上清液转移至注射器内，然后缓慢推动注射器的柱塞，注射器将上清液推入到过滤器中进行过滤，得到过滤液，其中所述过滤能够截留0.45μm直径的物质；
将滤液通过QIAGEN exoEasy Maxi Kit外泌体提取试剂盒，按照产品说明书上的方法进行外泌体的提取：
1)将过滤液与等体积的buffer XBP(试剂盒提供)混匀；
2)将混匀液加入到exoEasy spin column离心柱(试剂盒提供)中，500g离心1min，后除去过滤液；
3)加入10ml的buffer XWP(试剂盒提供)，5000g离心5min，后除去过滤液；加入1ml的buffer XE(试剂盒提供)，室温静置1min，后500g离心5min收集外泌体溶液。
实施例2
参照附图1，本申请提取胸水外泌体的方法，包括：
储存于-80℃的冷冻人胸水10ml进行室温解冻；
待胸水完全解冻后，将胸水进行离心分离获得上清液，离心力为12000g；
过滤器一端与注射器的注射口密封连接，将上清液转移至注射器内，然后缓慢推动注射器的柱塞，注射器将上清液推入到过滤器中进行过滤，得到过滤液，其中所述过滤能够截留0.45μm直径的物质；
将过滤液通过QIAGEN exoEasy Maxi Kit外泌体提取试剂盒，按照产品说明书上的方法进行外泌体的提取：
1)将过滤液与等体积的buffer XBP(试剂盒提供)混匀；
2)将混匀液加入到exoEasy spin column离心柱(试剂盒提供)中，500g离心1min，后除去过滤液；
3)加入10ml的buffer XWP(试剂盒提供)，5000g离心5min，后除去过滤液；加入1ml的buffer XE(试剂盒提供)，室温静置1min，后500g离心5min收集外泌体溶液。
实施例3
参照附图1，本申请提取胸水外泌体的方法，包括：
储存于-80℃的冷冻人胸水5ml进行室温解冻；
待胸水完全解冻后，将胸水进行离心分离获得上清液，离心力为20000g；
过滤器一端与注射器的注射口密封连接，将上清液转移至注射器内，然后缓慢推动注射器的柱塞，注射器将上清液推入到过滤器中进行过滤，得到过滤液，其中所述过滤能够截留0.45μm直径的物质；
将过滤液通过QIAGEN exoEasy Maxi Kit外泌体提取试剂盒，按照产品说明书上的方法进行外泌体的提取：
1)将过滤液与等体积的buffer XBP(试剂盒提供)混匀；
2)将混匀液加入到exoEasy spin column离心柱(试剂盒提供)中，500g离心1min，后除去过滤液；
3)加入10ml的buffer XWP(试剂盒提供)，5000g离心5min，后除去过滤液；加入1ml的buffer XE(试剂盒提供)，室温静置1min，后500g离心5min收集外泌体溶液。
对本申请上述实施例获取的人胸水外泌体在透射电镜下进行观察，结果参见附图2。结果显示，电镜下外泌体颗粒直径在100nm左右，符合理论预期。而且背景清晰，分辨率高，说明提取质量和纯度较好。
对本申请上述实施例获取的人胸水外泌体进行粒径和浓度检测(NTA)分析，结果参见附图3。统计数据显示胸水外泌体颗粒直径分布峰值在120nm左右。浓度为9.8E+10个/mL。结果表明，提取的胸水外泌体富集度高，富集效果好。
对获取的人胸水外泌体进行常规total DNA提取、total RNA提取，并在Agilent4200上进行成分检测，结果参见附图4。结果显示(左图)，胸水外泌体DNA峰值单一(左图中箭头所指的峰，出现在31393bp处)，说明提取的DNA无降解，完整度好。结果显示(右图)，提取的外泌体total RNA中18S/28S无峰，说明RNA中不含细胞碎片，细胞背景成分去除的较为干净；RNA中的主峰值在60bp左右(右图中箭头所指的峰，出现在56bp处)，主要为miRNA等外泌体小RNA的集中分布区域，说明RNA富集效果好。
本申请通过一次离心和一次过滤的方法，对胸水进行快速的预处理，使处理后的胸水可以通过常规的膜亲和离心柱试剂盒提取外泌体。离心步骤可以除去细胞及其碎片，过滤步骤可以去掉粒径大于0.45μm的蛋白及其他细胞杂质成分。本发明操作简单、效率高、成本低，为胸水等临床来源样本提供了一种快速的外泌体获取方案。
本申请所述的方法可以对低至5mL的胸水进行快速的外泌体提取。获取的外泌体结构完整、纯度高，可直接用于电镜检测、外泌体DNA提取、外泌体RNA提取等下游检测实验研究。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种提取胸水外泌体的方法，其特征在于，包括：
将胸水进行离心分离获得上清液；
将上清液进行过滤，得到过滤液，其中所述过滤能够截留0.45μm直径的物质；采用离心柱法从过滤液中提取外泌体。
2.根据权利要求1所述的提取胸水外泌体的方法，其特征在于，所述的离心分离，离心力为5000-50000g。
3.根据权利要求2所述的提取胸水外泌体的方法，其特征在于，所述的离心分离，离心力为10000-20000g。
4.根据权利要求1所述的提取胸水外泌体的方法，其特征在于，所述胸水体积≥5ml。
5.根据权利要求1所述的提取胸水外泌体的方法，其特征在于，所述过滤包括：将过滤器一端密封连接注射器的注射口，上清液置于注射器中，注射器将上清液推至过滤器中进行过滤。
6.根据权利要求1所述的提取胸水外泌体的方法，其特征在于，所述离心柱法采用膜亲和离心柱法。
7.一种提取胸水外泌体的系统，其特征在于，包括：离心分离器，过滤设备和离心分离柱，其中，所述过滤设备能够截留0.45μm直径的物质。
8.根据权利要求7所述的提取胸水外泌体的系统，其特征在于，所述的离心分离器，离心力为5000-50000g。
9.根据权利要求8所述的提取胸水外泌体的系统，其特征在于，所述的离心分离器，离心力为10000-20000g。
10.根据权利要求7所述的提取胸水外泌体的系统，其特征在于，所述过滤设备包括过滤器和注射器，过滤器一端密封连接注射器的注射口。
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