CN110152747B - 微流控芯片以及外泌体的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碟式的微流控芯片，包括芯片基体，所述芯片基体开设有旋转中心孔，所述芯片基体上设置集成反应单元；所述集成反应单元包括开设在所述芯片基体的同一表面的中央池、多个旁侧池以及连通所述中央池与所述旁侧池之间的通道；至少一个所述通道包括多个液体截留腔，所述液体截留腔将所述通道分隔为多段子通道，不同的所述通道包括不同数量的所述液体截留腔，通过对所述碟式的微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，能够使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通。本发明还公开了一种外泌体的分离方法。
Description
技术领域
本发明涉及材料和生物技术领域，特别是涉及一种微流控芯片以及外泌体的分离方法。
背景技术
外泌体是一种细胞内分泌至胞外的直径为30-120nm的膜性囊泡。外泌体最初发现是被认为是细胞排泄的垃圾。直到2007年发现外泌体可以作为细胞间基因交流的机制，外泌体才引起科学家们的关注。人类几乎所有的细胞都能产生和分泌外泌体，在血液、尿液、唾液、脑脊液中均可检测到外泌体，在临床上可以实现无创检测外泌体。
现有的外泌体分离提取方法主要有超高速离心，免疫法，超滤法，商业化试剂盒，色谱排阻等。超高速离心先通过差速离心除去细胞及碎片，然后超高速离心(16000rpm)富集外泌体。超高速离心法一般需要6-8小时，回收率比较低，只有5-25％，费用昂贵。免疫法主要是利用抗体修饰的磁珠来捕获外泌体，得到的外泌体高纯度，回收率高，但普适性低，只捕获含有目标蛋白的外泌体，容易造成失真的分析。超滤法是利用抽真空的方法使含外泌体的溶液通过微滤膜，从而把外泌体富集在微滤膜上，这种方法富集效率比较高，但是易于堵塞，而且外泌体会受到压力损伤。现已有一些商业化的试剂盒(比如ExoQuick，TotalExosome Isolation)来提取外泌体，使用方便，但需要过夜操作，且操作环境开放，可能会有化学试剂残留影响后续qPCR、测序等操作。这些常规的外泌体分离技术都具有操作步骤多、分离时间长、提取效率低的缺点。
发明内容
基于此，有必要针对外泌体分离操作步骤多、分离时间长、提取效率低的问题，提供一种微流控芯片以及外泌体的分离方法。
一种碟式的微流控芯片，包括芯片基体，所述芯片基体开设有旋转中心孔，所述芯片基体上设置集成反应单元；
所述集成反应单元包括开设在所述芯片基体的同一表面的中央池、多个旁侧池以及连通所述中央池与所述旁侧池之间的通道；
至少一个所述通道包括多个液体截留腔，所述液体截留腔将所述通道分隔为多段子通道，不同的所述通道包括不同数量的所述液体截留腔，通过对所述碟式的微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，能够使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通。
在其中一个实施例中，所述液体截留腔的宽度大于所述子通道的宽度，使得在所述低速离心下液体能够被截留在所述液体截留腔外，在所述高速离心下液体能够进入所述液体截留腔并突破所述液体截留腔。
在其中一个实施例中，所述中央池和所述旁侧池的深度大于所述液体截留腔的深度，所述液体截留腔的深度大于所述子通道的深度。
在其中一个实施例中，所述液体截留腔选自毛细阀、疏水阀和石蜡阀中的一种或多种。。
在其中一个实施例中，所述旁侧池为以所述旋转中心孔为中心的扇环形槽。
在其中一个实施例中，所述子通道包括多个交替设置并首尾相连的正U型和倒U型结构。
在其中一个实施例中，所述旁侧池为以所述旋转中心孔为中心的扇环形槽，所述倒U型结构的顶端与所述旋转中心孔的距离小于所述扇环形槽的内弧形侧壁与所述旋转中心孔的距离，所述正U型结构的底端与所述旋转中心孔的距离大于所述扇环形槽的外弧形侧壁与所述旋转中心孔的距离。
在其中一个实施例中，所述通道的首尾相连的一个所述正U型结构和一个所述倒U型结构组成的U型结构的组数与所述通道中的所述液体截留腔的数量相同，每组所述U型结构设置一个所述液体截留腔。
在其中一个实施例中，所述集成反应单元包括近端和远端，所述近端靠近所述旋转中心孔，所述远端远离所述旋转中心孔；所述旁侧反应池包括近端池和远端池，所述中央池设置在所述近端池和所述远端池之间，使得在离心力下，所述近端池的液体能够流入所述中央池，所述中央池的液体能够流入所述远端池。
在其中一个实施例中，一个所述集成反应单元包括多个所述近端池，每个所述近端池与所述中央池连通的所述通道包括2(n-1)个液体截留腔，所述n为正整数，代表对应的所述近端池中的液体流入所述中央池的顺序。
在其中一个实施例中，所述近端池为以所述旋转中心孔为中心的扇环形槽，所述近端池与所述中央池之间的所述通道与所述扇环形槽的外弧形侧壁相连。
在其中一个实施例中，所述近端池包括第一侧近端池和第二侧近端池，所述第一侧近端池和所述第二侧近端池分别沿所述芯片基体的转动方向设置在所述中央池的两侧。
在其中一个实施例中，所述远端池包括第一侧远端池和第二侧远端池，所述第一侧远端池和所述第二侧远端池分别沿所述芯片基体的转动方向设置在所述中央池的两侧。
在其中一个实施例中，所述集成反应单元包括近端、远端、第一侧和第二侧，所述近端靠近所述旋转中心孔，所述远端远离所述旋转中心孔，所述第一侧和第二侧沿所述芯片基体的转动方向设置在所述中央池的两侧；
所述旁侧反应池包括设置在所述近端和所述第一侧的两个第一旁侧池，分别为第一池和第二池，设置在所述近端和所述第二侧的第二旁侧池，设置在所述远端和所述第一侧的第三旁侧池，以及设置在所述远端和所述第二侧的第四旁侧池；
所述第一池与所述中央池之间的所述通道的所述液体截留腔的数量为4个，所述第二池与所述中央池之间的所述通道不包括所述液体截留腔，所述第二旁侧池与所述中央池之间的所述通道的所述液体截留腔的数量为2个。
在其中一个实施例中，所述集成反应单元有复数个，所述复数个集成反应单元围绕所述芯片基体的圆周排布，所述复数个集成反应单元以所述旋转中心孔形成中心对称。
一种外泌体的分离方法，利用所述的微流控芯片，所述旁侧池包括样品池、清洗液储存池、洗脱液储存池、废液池和收集池，并包括以下步骤：
将酸化玻璃珠设置于所述中央池；
将生物样品、清洗液和洗脱液分别设置于所述样品池、清洗液储存池、洗脱液储存池，所述生物样品中具有外泌体，所述外泌体能够结合在所述酸化玻璃珠上，所述清洗液用于去除所述生物样品和所述酸化玻璃珠结合后的杂质，所述洗脱液用于将所述外泌体从所述酸化玻璃珠上洗脱下来；
对所述微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通；
所述微流控芯片内的液体流动顺序依次为：由所述样品池流向所述中央池、由所述中央池流向所述废液池、由所述清洗液储存池流向所述中央池、由所述中央池流向所述废液池、由所述洗脱液流向所述中央池以及由所述中央池流向所述收集池。
在其中一个实施例中，所述对所述微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心的步骤包括：
S31，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述生物样品流入所述中央池；
S32，停止离心预定时间，使所述生物样品中的所述外泌体结合到所述酸化玻璃珠上；
S33，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述中央池中的未与所述酸化玻璃珠结合的所述生物样品流入所述废液池；
S34，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述清洗液和所述洗脱液在所述通道的上游向下游流动；
S35，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述清洗液流入所述中央池并将所述杂质溶解；
S36，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述洗脱液继续向所述下游流动；
S37，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述中央池中的所述清洗液和溶解在所述清洗液中的所述杂质流入所述废液池；
S38，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述洗脱液继续向所述下游流动；
S39，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述洗脱液流入所述中央池并将所述外泌体从所述酸化玻璃珠上洗脱下来；
S40，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述洗脱液和所述外泌体流入所述收集腔；
其中，所述第一速度、所述第二速度和所述第三速度依次减小。
在其中一个实施例中，所述洗脱液储存池、所述样品池和所述废液池设置在所述中央池的近端和第一侧，所述洗脱液储存池、所述样品池、所述中央池和所述废液池由近端向远端依次分布；
所述清洗液储存池和所述收集池设置在所述中央池的第二侧，所述清洗液储存池、所述中央池和所述收集池由近端至远端依次分布；
所述第一侧和第二侧沿所述芯片基体的转动方向设置在所述中央池的两侧，所述步骤S33、S34、S35和S38的离心方向为所述中央池向所述第一侧的方向，所述步骤S31、S36、S37、S39及S40的离心方向为所述中央池向所述第二侧的方向。
在其中一个实施例中，所述洗脱液储存储存池与所述中央池通过第一通道连通，所述第一通道的所述液体截留腔的数量为4个，由所述洗脱液储存池向所述中央池分别为第一液体截留腔、第二液体截留腔、第三液体截留腔和第四液体截留腔；
所述清洗液储存池与所述中央池通过第三通道连通，所述第三通道的所述液体截留腔的数量为2个，由所述清洗液储存池向所述中央池分别为第五液体截留腔和第六液体截留腔；
在所述步骤S31，所述洗脱液突破所述第一液体截留腔，所述清洗液突破所述第五液体截留腔；
在所述步骤S33，所述洗脱液突破所述第二液体截留腔，所述清洗液突破所述第六液体截留腔；在所述步骤S35，所述洗脱液突破所述第三液体截留腔；在所述步骤S37，所述洗脱液突破所述第四液体截留腔。
在其中一个实施例中，所述第一速度为1200rpm～2000rpm，所述第二速度为500rpm～1000rpm，所述第三速度为50rpm～100rpm。
在其中一个实施例中，所述S32中的所述预定时间为10分钟～20分钟，所述步骤S31、S33、S34、S35、S36、S37、S38、S39或S40的离心时间为0.5分钟～1分钟。
本发明的所述微流控芯片的中央池和旁侧池之间的通道上设置液体截留腔，在不同的离心速度下，所述通道中的液体能够被液体截留腔截留或突破液体截留腔，具体的，在低速离心下液体能够被截留在液体截留腔外，在高速离心下液体能够进入所述液体截留腔并突破所述液体截留腔。通过控制所述通道上的液体截留腔的数量，以及通过交替进行高速和低速离心，从而能够调控不同的位于近端的所述旁侧池中的液体流入所述中央池的时间，和/或所述中央池内的液体流入位于远端的所述旁侧池的时间，使得所述集成反应单元中的液体能够按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通，例如使得不同试剂依次进入所述中央池，使得在中央池内能够按照预定顺序进行反应。所述微流控芯片能够应用于多个步骤依次实施的化学反应，例如物质分离等，将连续的多个步骤集成在同一芯片中进行，仅需要预设离心条件即可完成整个反应，操作步骤少、实验效率高。所述微流控芯片能够应用于血浆中外泌体的分离。
附图说明
图1为本发明一实施例的芯片基体的结构示意图；
图2为本发明一实施例的集成反应单元的结构示意图；
图3为本发明一实施例的微流控芯片的剖面示意图；
图4为本发明一实施例的外泌体粒径分布照片；
图5为本发明一实施例的微流控芯片分离和一对比例的超速离心分离外泌体的对比照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的微流控芯片以及外泌体的分离方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1-3，本发明实施例提供一种碟式的微流控芯片，包括芯片基体10，所述芯片基体10开设有旋转中心孔100，所述芯片基体10上设置集成反应单元。所述旋转中心孔100设置于所述芯片基体10的中心，用于套设在离心仪器的离心旋转轴上，从而能够对所述碟式的微流控芯片进行离心。
在一实施例中，所述碟式的微流控芯片还包括端盖20，叠加在所述芯片基体10上，覆盖所述集成反应单元的开口，将集成反应单元中的液体密封在所述芯片基体10中。所述端盖20的形状和尺寸和所述芯片基体10相互配合。在另一实施实例中，所述微流控芯片可以通过液体胶密封。所述芯片基体10和所述端盖20可以为外径分别相同的圆盘。所述端盖20可以开设或不开设旋转中心孔100，优选为开设相同直径的旋转中心孔100。
所述集成反应单元包括开设在所述芯片基体10的同一表面的中央池200、多个旁侧池以及连通所述中央池200与所述旁侧池之间的通道。所述集成反应单元用于通过离心力实现液体在所述中央池200和与所述旁侧池之间的转移，从而实现各种连续步骤的化学反应，例如物质分离、生化反应等。
在一实施例中，所述集成反应单元可以包括近端和远端，所述近端为靠近所述旋转中心孔100的方向，所述远端为远离所述旋转中心孔100的方向，所述中央池200设置在所述近端和所述远端之间。所述旁侧反应池可以包括近端池和远端池，所述近端池相对于所述中央池200更靠近所述旋转中心孔100，所述远端池相对于所述中央池200更远离所述旋转中心孔100。连通所述近端池与所述中央池200之间所述通道为近端通道，连通所述远端池与所述中央池200之间的所述通道为远端通道。所述中央池200设置在所述近端池和所述远端池之间，使得在离心力下，所述近端池的液体能够流入所述中央池200，所述中央池200可以作为反应中心，所述近端池的液体流入所述中央池200进行化学反应；同时所述中央池200反应后的液体能够流入所述远端池，所述远端池例如可以包括废液池和/或收集池。
至少一个所述通道包括多个液体截留腔405，所述液体截留腔405将所述通道分隔为多段子通道，不同的所述通道可包括不同数量的所述液体截留腔405，通过对所述碟式的微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，能够使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池200之间流通。在一实施例中，至少一个所述近端通道包括所述多个液体截留腔405。
本发明实施例的所述微流控芯片的中央池200和旁侧池之间的通道上设置液体截留腔405，在不同的离心速度下，所述通道中的液体能够被液体截留腔405截留或突破液体截留腔405。具体的，在低速离心(例如50rpm～100rpm)条件下液体能够被截留在液体截留腔405外，在高速离心(例如500rpm以上)条件下液体能够进入所述液体截留腔405并突破所述液体截留腔405。通过控制所述通道上的液体截留腔405的数量，以及通过交替进行高速和低速离心，从而能够调控不同的位于近端的所述旁侧池中的液体流入所述中央池200的时间和/或所述中央池200内的液体流入位于远端的所述旁侧池的时间，使得所述集成反应单元中的液体能够按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池200之间流通，例如使得不同试剂依次进入所述中央池200，使得在中央池200内能够按照预定顺序进行反应。所述微流控芯片能够应用于多个步骤依次实施的化学反应，例如物质分离等，将连续的多个步骤集成在同一芯片中进行，仅需要预设离心条件即可完成整个反应，操作步骤少、实验效率高。在一实施例中，所述微流控芯片能够应用于血浆中外泌体的分离。
在一实施例中，所述通道、所述旁侧池和所述中央池200为在所述芯片基体10的同一表面向下凹陷形成的凹槽。所述凹槽的内表面可以为弧面或者矩形面。所述液体截留腔405的宽度大于所述子通道的宽度，使得在所述低速离心下，所述通道中的液体能够截留在所述液体截留腔405外；在所述高速离心下，所述通道中的液体能够从所述液体截留腔405的上游进入所述液体截留腔405中并且突破所述液体截留腔405而流向下游的所述子通道。所述上游为液体流入的方向，所述下游为液体流出的方向，所述上游至所述下游的方向为液体流动的方向。所述液体截留腔405可以选自毛细阀、疏水阀和石蜡阀中的一种或多种。在一实施例中，所述液体截留腔405选自毛细阀，所述毛细阀为圆柱体空腔。随着所述微流控芯片以所述旋转中心孔100为轴顺时针或逆时针转动，微流控芯片中的液体有随微流控芯片顺时针或逆时针转动，以及从所述旋转中心孔100向所述微流控芯片的边缘运动的趋势。所述通道中的液体在所述离心作用力下，沿转动方向由所述通道的上游向下游流动，当所述通道的宽度突然增大，即到达所述液体截留腔405的进口时，由于毛细力，液体截留在液体截留腔405外；当增大转速，使得离心作用力增大至大于所述液体截留腔405的毛细力，液体可以从所述液体截留腔405上游的子通道进入所述液体截留腔405并且突破所述液体截留腔405而继续流向所述通道的下游。优选的，所述液体截留腔405的深度可以大于所述子通道的深度，从而能够增加截留的强度和灵敏度。优选的，所述子通道的宽度可以相等。
在一实施例中，所述旁侧池可以为以所述旋转中心孔100为中心的扇环形槽，在离心力作用下，所述微流控芯片绕所述旋转中心孔100进行顺时针或逆时针旋转，所述扇环形槽有益于液体的全部流出。
在一实施例中，所述近端池与所述中央池200之间的所述通道与所述扇环形槽的外弧形侧壁相连(即距离旋转中心孔100较远的侧壁)。
在一实施例中，所述子通道可以为虹吸阀管，所述虹吸阀管为具有交替的向所述微流控芯片中心的旋转中心孔100方向弯曲和向所述微流控芯片外侧边缘方向弯曲的蜿蜒或蛇形结构。在一实施例中，所述子通道可以包括多个交替设置并首尾相连的正U型和倒U型结构，所述正U型结构为向所述旋转中心孔100弯曲的U型，倒U型结构相反，为向所述微流控芯片外侧边缘弯曲的U型。
在一实施例中，所述通道的首尾相连的一个正U型结构和一个倒U型结构组成的U型结构的组数与所述通道中的所述液体截留腔405的数量相同，每组所述U型结构设置一个所述液体截留腔405。
在一实施例中，所述倒U型结构的顶端与所述旋转中心孔100的距离小于所述扇环形槽的内弧形侧壁(即距离旋转中心孔100较近的侧壁)与所述旋转中心孔100的距离，所述正U型结构的底端与所述旋转中心孔100的距离大于所述扇环形槽的外弧形侧壁(即距离旋转中心孔100较远的侧壁)与所述旋转中心孔100的距离，使得所述旁侧池中的液体能够完全转移到下游的中央池。
在一实施例中，所述通道的内表面设置有亲水性材料或疏水性材料。通过对所述通道进行亲水或疏水处理，使所述通道对流通的液体的亲和力不同。在一实施例中，所述子通道的内表面可以设置有亲水性材料。所述液体截留腔405的内表面可以设置有疏水性材料。
在一实施例中，所述集成反应单元包括近端、远端、第一侧和第二侧，所述近端靠近所述旋转中心孔，所述远端远离所述旋转中心孔，所述第一侧和第二侧沿所述芯片基体的转动方向设置在所述中央池的两侧。一个集成反应单元可以包括多个旁侧池，分设在所述中央池200的第一侧和第二侧，可以通过对微流控芯片分别进行顺时针或逆时针离心，使所述微流控芯片中的液体分别在所述第一侧的旁侧池与所述中央池200之间流通，或者在第二侧的旁侧池与所述中央池200之间流通。两侧设置所述旁侧池可以通过离心方向的改变实现液体流动方向的转变，可以使旁侧池在所述中央池200周围的排布更紧凑，有利于节省空间。所述近端池可以包括第一侧近端池和第二侧近端池，所述第一侧近端池和所述第二侧近端池分别沿所述芯片基体100的转动方向设置在所述中央池200的两侧。所述远端池可以包括第一侧远端池和第二侧远端池，所述第一侧远端池和所述第二侧远端池分别沿所述芯片基体100的转动方向设置在所述中央池200的两侧。
在一实施例中，所述旁侧池可以包括第一旁侧池、第二旁侧池320、第三旁侧池330和第四旁侧池340，所述第一旁侧池设置在所述近端并且设置在所述中央池200的第一侧，所述第二旁侧池320设置在所述近端并且设置在所述中央池200的第二侧，所述第三旁侧池330设置在在所述远端并且设置在所述中央池200的第一侧，所述第四旁侧池340设置在在所述远端并且设置在所述中央池200的第二侧。在一实施例中，所述第一侧至所述中央池200的方向为所述芯片基体逆时针转动的方向，所述第二侧至所述中央池200的方向为所述芯片基体顺时针转动的方向，所述第一旁侧池的液体可以通过对所述微流控芯片进行逆时针离心流入所述中央池200，所述第二旁侧池320的液体可以通过对所述微流控芯片进行顺时针离心流入所述中央池200，所述中央池200的液体可以通过对所述微流控芯片进行顺时针离心流入所述第三旁侧池330，所述中央池200的液体可以通过对所述微流控芯片进行逆时针离心流入所述第四旁侧池340。所述第一旁侧池、所述第二旁侧池320、所述第三旁侧池330和所述第四旁侧池340可以分别设置一个或多个。
在一实施例中，一个所述集成反应单元包括多个所述近端池，每个所述近端池与所述中央池200连通的所述通道分别包括2(n-1)个液体截留腔405，所述n为正整数，所述n代表对应的所述近端池中的液体流入所述中央池200的顺序。
在一具体实施例中，所述第一旁侧池包括第一池312和第二池314，所述第一池312与所述中央池200通过第一通道410连通，所述第一通道410包括4个所述液体截留腔405和4组U型结构(首尾相连的一个正U型结构和一个倒U型结构为一组)，每组所述U型结构设置一个所述液体截留腔405；所述第二池314与所述中央池200通过第二通道420连通，所述第二通道420未设置所述液体截留腔405。所述第二旁侧池320与所述中央池200通过第三通道430连通，所述第三通道430包括2个所述液体截留腔405和2组U型结构，每组所述U型结构设置一个所述液体截留腔405。所述第三旁侧池330与所述中央池200通过第四通道440连通，所述第四旁侧池340与所述中央池200通过第五通道450连通，所述第四旁侧池340和所述第三旁侧池330为所述远端池，所述中央池200作为反应中心，可以不控制所述中央池200中的液体流入所述远端池的时间，所述远端池和所述中央池200之间可以不设置所述液体截留腔405，即所述第四通道440不设置所述液体截留腔405，所述第五通道450不设置所述液体截留腔405。
在所述交替的高速离心和低速离心和离心方向变化下，所述微流控芯片内的液体流动顺序可以依次为：由所述第二池314流入所述中央池200、由所述中央池200流向所述第三旁侧池330、由所述第二旁侧池320流入所述中央池200、由所述中央池200流向所述第三旁侧池330、由所述第一池312流入所述中央池200以及由所述中央池200流入所述第四旁侧池340。
在一具体实施例中，所述微流控芯片用于从生物样品中分离外泌体，所述第二池314可以为样品池，用于装载生物样品；所述第一池312可以为洗脱液储存池，用于装载洗脱液；所述第二旁侧池320可以为清洗液储存池用于装载清洗液；所述第三旁侧池330可以为废液池；所述第四旁侧池340可以为收集池。
在所述微流控芯片中，所述中央池200和所述旁侧池的深度大于所述液体截留腔405的深度，所述液体截留腔405的深度大于所述子通道的深度。
在一具体实施例中，实施例中，所述芯片基体10可以为直径80mm～120mm的圆盘。所述旁侧池和/或所述中央池200的深度可以为3.5mm～4.5mm，所述子通道的深度可以为0.2mm～0.4mm，所述子通道的宽度可以为0.05mm～0.15mm，所述液体截留腔405的深度可以为0.9mm～1.1mm，所述液体截留腔405的宽度可以为0.05mm～0.2mm，所述第二通道420的深度可以为0.4mm～0.6mm，所述第二通道420的宽度可以为0.4mm～0.6mm，所述第四通道440和/或所述第五通道450的深度可以为0.2mm～0.4mm，所述第四通道440和/或所述第五连通管的宽度可以为0.05mm～0.15mm。所述通道的深度和宽度以及所述旁侧池的深度的尺寸可以相互配合进行调整。
在一实施例中，所述集成反应单元有复数个，所述复数个集成反应单元围绕所述芯片基体10的圆周排布，所述复数个集成反应单元以所述旋转中心孔100形成中心对称。复数个所述集成反应单元设置在同一微流控芯片上，可以使离心力对称，并且可以提高单次的反应量，提高实验效率。
在一实施例中，所述中央池200和/或所述旁侧池的底部开设有微孔500，所述微孔500将所述中央池200和/或所述旁侧池的空腔的内部与大气连通。所述微孔500可以作为进样孔。
本发明实施例还提供一种外泌体的分离方法，利用所述的微流控芯片，所述旁侧池包括样品池、清洗液储存池、洗脱液储存池、废液池和收集池，并包括以下步骤：
将酸化玻璃珠设置于所述中央池200；
将生物样品、清洗液和洗脱液分别设置于所述样品池、清洗液储存池、洗脱液储存池，所述生物样品中具有外泌体，所述外泌体能够结合在所述酸化玻璃珠上，所述清洗液用于去除所述生物样品和所述酸化玻璃珠结合后的杂质，所述洗脱液用于将所述外泌体从所述酸化玻璃珠上洗脱下来；
对所述微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池200之间流通；
所述微流控芯片内的液体流动顺序依次为：由所述样品池流向所述中央池200、由所述中央池200流向所述废液池、由所述清洗液储存池流向所述中央池200、由所述中央池200流向所述废液池、由所述洗脱液流向所述中央池200以及由所述中央池200流向所述收集池。
通过所述方法分离外泌体时，只需要把生物样品、清洗液和洗脱液加入所述微流控芯片的对应反应池，并打开预先设好的离心程序即可实现生物样品中的外泌体的自动化分离，通过连续的步骤和不转移实验仪器的操作方法缩短了分离时间，提高了外泌体的回收率，并减少了人工操作步骤和人工成本。利用所述方法可以在25分钟内实现全自动外泌体分离。
通过酸化玻璃珠结合生物样品中的外泌体，不需要复杂的硅烷化修饰，而且玻璃珠粒径较小，比表面积大，与外泌体结合的效率更高，外泌体的回收率更高。
在一实施例中，所述生物样品可以选自血浆、尿液、脑脊液、汗液等。
在一实施例中，所述酸化玻璃珠可以为用有机酸进行酸洗后的玻璃珠。所述有机酸可以选自醋酸。
在一实施例中，所述对所述微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心的步骤可以包括：
S31，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述生物样品流入所述中央池200；
S32，停止离心预定时间，使所述生物样品中的所述外泌体结合到所述酸化玻璃珠上；
S33，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述中央池200中的未与所述酸化玻璃珠结合的所述生物样品流入所述废液池；
S34，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述清洗液和所述洗脱液在所述通道的上游向下游流动；
S35，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述清洗液流入所述中央池200并将所述杂质溶解；
S36，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述洗脱液继续向所述下游流动；
S37，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述中央池200中的所述清洗液和溶解在所述清洗液中的所述杂质流入所述废液池；
S38，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述洗脱液继续向所述下游流动；
S39，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述洗脱液流入所述中央池200并将所述外泌体从所述酸化玻璃珠上洗脱下来；
S40，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述洗脱液和所述外泌体流入所述收集池；
其中，所述第一速度、所述第二速度和所述第三速度依次减小。
在一实施例中，所述洗脱液储存池、所述样品池、所述废液池、所述清洗液储存池和所述收集池可以分别对应上述的所述第一池312、所述第二池314、所述第三旁侧池330、所述第二旁侧池320和所述第四旁侧池340。在一实施例中，所述第一子通道、所述第三子通道、所述第四通道440和所述第五通道450可以进行亲水性处理。所述第二通道420可以进行疏水性处理。所述液体截留腔405可以进行疏水性处理。所述亲水性处理可以为氧等离子体处理。所述疏水性处理可以为氟硅树脂溶液，例如EGC-1700处理。
在一实施例中，所述第一侧和第二侧沿所述芯片基体100的转动方向设置在所述中央池200的两侧，所述步骤S33、S34、S35和S38的离心方向为所述中央池200向所述第一侧的方向，所述步骤S31、S36、S37、S39及S40的离心方向为所述中央池200向所述第二侧的方向。
在一实施例中，所述第一侧可以为所述中央池200的顺时针侧，所述第二侧为所述中央池200的逆时针侧。所述步骤S33、S34、S35和S38的离心方向为顺时针方向，所述步骤S31、S36、S37、S39及S40的离心方向为逆时针方向。所述离心方向根据所述旁侧池和所述中央池200的位置关系进行调整。
在一实施例中，所述洗脱液存储与所述中央池200通过第一通道410连通，所述第一通道410包括4个所述液体截留腔405，由所述洗脱液储存池向所述中央池200分别为第一液体截留腔、第二液体截留腔、第三液体截留腔和第四液体截留腔；所述清洗液储存池与所述中央池200通过第三通道430连通，所述第三通道430包括2个所述液体截留腔405，由所述清洗液储存池向所述中央池200分别为第五液体截留腔和第六液体截留腔；
在所述步骤S31，所述洗脱液突破所述第一液体截留腔405，所述清洗液突破所述第五液体截留腔；在所述步骤S33，所述洗脱液突破所述第二液体截留腔405，所述清洗液突破所述第六液体截留腔；在所述步骤S35，所述洗脱液突破所述第三液体截留腔405；在所述步骤S37，所述洗脱液突破所述第四液体截留腔405。
在一实施例中，所述第一速度可以为1200rpm～2000rpm，所述第二速度可以为500rpm～1000rpm，所述第三速度可以为50rpm～100rpm。所述离心速度可以根据所述微流控芯片的各反应池的距离和尺寸进行调整。
在一实施例中，所述S32中的所述预定时间为10分钟～20分钟，所述步骤S31、S33、S34、S35、S36、S37、S38、S39或S40的离心时间为0.5分钟～1分钟。
在一实施例中，所述步骤S31-S40中的液体流动顺序可以如下表1所示。
表1液体流动顺序
实施例1
准确称取50mg玻璃珠(200μm)于1.5mL EP管中，用1mL 0.01mol/L醋酸清洗1小时得到酸化玻璃珠。
将50mg酸化玻璃珠与500μL血浆混合，孵育5-20min，使血浆中的外泌体结合在酸化玻璃珠上。
离心使酸化玻璃珠沉降到管底，小心吸弃上清，利用清洗液(50mmol/L的HEPES)清洗一遍，弃上清。
利用洗脱液(浓度为200-500mmol/L的NaCl溶液)与结合有外泌体的酸化玻璃珠进行混合，使外泌体被洗脱下来，收集外泌体溶液。
用PBS将外泌体溶液稀释50倍，利用纳米颗粒追踪分析仪测外泌体的粒径分布以及颗粒浓度，计算外泌体的回收率。
结果请参阅图4，结果表明，外泌体的粒径分布，外泌体粒径分布均一，平均粒径为120nm，说明利用酸化玻璃珠结合外泌体并进行清洗、洗脱的方法能够得到高质量的外泌体。
实施例2
利用本发明实施例的所述微流控芯片从血浆中分离外泌体。
将酸化玻璃珠预填充在中央池200，所述微流控芯片的设置有反应池的表面用液体胶密封。
将200μL血浆、清洗液和洗脱液分别通过微孔500的所述样品池、清洗液储存池、洗脱液储存池。
利用所述表2程序对所述微流控芯片进行离心，洗脱得到外泌体溶液。
用PBS将外泌体溶液稀释50倍，利用纳米颗粒追踪分析仪测微流控芯片分离得到的外泌体的粒径分布以及颗粒浓度，计算外泌体的回收率，结果如图5。
对比例1
利用超速离心从血浆中分离外泌体。
取200μL血浆，加25mL PBS稀释，然后10000g离心10min，取上清，用0.22μm的滤膜过滤。
将上清液120,000g，4℃离心70min，弃上清，收集沉淀。
用PBS重悬沉淀，120,000g，4℃离心70min，收集外泌体沉淀。
用40μL PBS重悬外泌体沉淀得到外泌体溶液。
利用纳米颗粒追踪分析仪测微流控芯片分离得到的外泌体的粒径分布以及颗粒浓度，计算外泌体的回收率，结果如图5所示。
结果表明，本发明实施例的微流控芯片分离得到的外泌体的回收率是超速离心分离得到的外泌体的3倍。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.一种碟式的微流控芯片，其特征在于，包括芯片基体，所述芯片基体开设有旋转中心孔，所述芯片基体上设置集成反应单元；
所述集成反应单元包括开设在所述芯片基体的同一表面的中央池、多个旁侧池以及连通所述中央池与所述旁侧池之间的通道；
至少一个所述通道包括多个液体截留腔，所述液体截留腔将所述通道分隔为多段子通道，不同的所述通道包括不同数量的所述液体截留腔，通过对所述碟式的微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，能够使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通；
所述旁侧池为以所述旋转中心孔为中心的扇环形槽，所述子通道包括多个交替设置并首尾相连的正U型和倒U型结构，所述倒U型结构的顶端与所述旋转中心孔的距离小于所述扇环形槽的内弧形侧壁与所述旋转中心孔的距离，所述正U型结构的底端与所述旋转中心孔的距离大于所述扇环形槽的外弧形侧壁与所述旋转中心孔的距离；
所述集成反应单元包括近端和远端，所述近端靠近所述旋转中心孔，所述远端远离所述旋转中心孔；所述旁侧池包括近端池和远端池，所述中央池设置在所述近端池和所述远端池之间，使得在离心力下，所述近端池的液体能够流入所述中央池，所述中央池的液体能够流入所述远端池，一个所述集成反应单元包括多个所述近端池，每个所述近端池与所述中央池连通的所述通道分别包括2(n-1)个液体截留腔，所述n为正整数，所述n代表对应的所述近端池中的液体流入所述中央池的顺序。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述液体截留腔的宽度大于所述子通道的宽度和深度，使得在所述低速离心下液体能够被截留在所述液体截留腔外，在所述高速离心下液体能够进入所述液体截留腔并突破所述液体截留腔。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述液体截留腔选自毛细阀、疏水阀和石蜡阀中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述集成反应单元包括近端、远端、第一侧和第二侧，所述近端靠近所述旋转中心孔，所述远端远离所述旋转中心孔，所述第一侧和第二侧沿所述芯片基体的转动方向设置在所述中央池的两侧；
所述旁侧池包括设置在所述近端和所述第一侧的两个第一旁侧池，分别为第一池和第二池，设置在所述近端和所述第二侧的第二旁侧池，设置在所述远端和所述第一侧的第三旁侧池，以及设置在所述远端和所述第二侧的第四旁侧池；
所述第一池与所述中央池之间的所述通道的所述液体截留腔的数量为4个，所述第二池与所述中央池之间的所述通道不包括所述液体截留腔，所述第二旁侧池与所述中央池之间的所述通道的所述液体截留腔的数量为2个。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述通道的首尾相连的一个正U型结构和一个倒U型结构组成的U型结构的组数与所述通道中的所述液体截留腔的数量相同，每组所述U型结构设置一个所述液体截留腔。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，在所述微流控芯片中，所述中央池和所述旁侧池的深度大于所述液体截留腔的深度，所述液体截留腔的深度大于所述子通道的深度。
7.一种外泌体的分离方法，利用根据权利要求1-6任一项所述的微流控芯片，所述旁侧池包括样品池、清洗液储存池、洗脱液储存池、废液池和收集池，并包括以下步骤：
将酸化玻璃珠设置于所述中央池；
将生物样品、清洗液和洗脱液分别设置于所述样品池、清洗液储存池、洗脱液储存池，所述生物样品中具有外泌体，所述外泌体能够结合在所述酸化玻璃珠上，所述清洗液用于去除所述生物样品和所述酸化玻璃珠结合后的杂质，所述洗脱液用于将所述外泌体从所述酸化玻璃珠上洗脱下来；
对所述微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心，使所述集成反应单元中的液体按照预定顺序在所述旁侧池和所述中央池之间流通；
所述微流控芯片内的液体流动顺序依次为：由所述样品池流向所述中央池、由所述中央池流向所述废液池、由所述清洗液储存池流向所述中央池、由所述中央池流向所述废液池、由所述洗脱液流向所述中央池以及由所述中央池流向所述收集池。
8.根据权利要求7所述的外泌体的分离方法，其特征在于，所述对所述微流控芯片进行交替的高速离心和低速离心的步骤包括：
S31，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述生物样品流入所述中央池；
S32，停止离心预定时间，使所述生物样品中的所述外泌体结合到所述酸化玻璃珠上；
S33，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述中央池中的未与所述酸化玻璃珠结合的所述生物样品流入所述废液池；
S34，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述清洗液和所述洗脱液在所述通道的上游向下游流动；
S35，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述清洗液流入所述中央池并将所述杂质溶解；
S36，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述洗脱液继续向所述下游流动；
S37，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述中央池中的所述清洗液和溶解在所述清洗液中的所述杂质流入所述废液池；
S38，对所述微流控芯片在第三速度下进行离心，使所述洗脱液继续向所述下游流动；
S39，对所述微流控芯片在第二速度下进行离心，使所述洗脱液流入所述中央池并将所述外泌体从所述酸化玻璃珠上洗脱下来；
S40，对所述微流控芯片在第一速度下进行离心，使所述洗脱液和所述外泌体流入所述收集腔；
其中，所述第一速度、所述第二速度和所述第三速度依次减小。
9.根据权利要求8所述的外泌体的分离方法，其特征在于，所述洗脱液储存池、所述样品池和所述废液池设置在所述中央池的近端和第一侧，所述洗脱液储存池、所述样品池、所述中央池和所述废液池由近端向远端依次分布；
所述清洗液储存池和所述收集池设置在所述中央池的第二侧，所述清洗液储存池、所述中央池和所述收集池由近端至远端依次分布；
所述第一侧和第二侧沿所述芯片基体的转动方向设置在所述中央池的两侧，所述步骤S33、S34、S35和S38的离心方向为所述中央池向所述第一侧的方向，所述步骤S31、S36、S37、S39及S40的离心方向为所述中央池向所述第二侧的方向。
10.根据权利要求9所述的外泌体的分离方法，其特征在于，所述洗脱液储存池与所述中央池通过第一通道连通，所述第一通道的所述液体截留腔的数量为4个，由所述洗脱液储存池向所述中央池分别为第一液体截留腔、第二液体截留腔、第三液体截留腔和第四液体截留腔；
所述清洗液储存池与所述中央池通过第三通道连通，所述第三通道的所述液体截留腔的数量为2个，由所述清洗液储存池向所述中央池分别为第五液体截留腔和第六液体截留腔；
在所述步骤S31，所述洗脱液突破所述第一液体截留腔，所述清洗液突破所述第五液体截留腔；
在所述步骤S33，所述洗脱液突破所述第二液体截留腔，所述清洗液突破所述第六液体截留腔；在所述步骤S35，所述洗脱液突破所述第三液体截留腔；在所述步骤S37，所述洗脱液突破所述第四液体截留腔。
11.根据权利要求8-10任一项所述的外泌体的分离方法，其特征在于，所述第一速度为1200rpm～2000rpm，所述第二速度为500rpm～1000rpm，所述第三速度为50rpm～100rpm。
12.根据权利要求8-10任一项所述的外泌体的分离方法，其特征在于，所述S32中的所述预定时间为10分钟～20分钟，所述步骤S31、S33、S34、S35、S36、S37、S38、S39或S40的离心时间为0.5分钟～1分钟。
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