JP5318110B2 - サンプル調製装置 - Google Patents
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Description
本明細書は、2007年10月31日に出願され、その主題全体が本明細書に参照文献として援用される「核酸を精製するための装置、システムおよび方法」と題された米国特許明細書第11/933,113号の部分的延長である。
この実験においては、以下のプロトコルにより、2.0mLレイニンフィルター装着ピペットチップおよび3mmガラスフリット(ROBU Glasfilter−Geraete GmbH、ドイツ)を用いて、Bacillus anthracisを含有する血液サンプルから核酸を精製した。
1.15mgコニカルチューブ1本に「流動液」とラベルし、1.5mg遠心管4本に「エタノール1」、「エタノール2」、「エタノール3」および「溶離液」とラベルする。
2.血液360μLとBacillus anthracis(105コロニー形成単位(cfu)/mL水)40μLを「流動液」チューブ内で混合する(最終濃度104cfu/mL)。
3.キアゲンAL溶解バッファー1120μLを混合物に加える。
4.プロテイナーゼK80μLを加える(20mg/mL)。
5.リゾチーム400μLを加え、ボルテックスで混合し、遠心沈殿する。
6.サンプル混合物を55℃で1時間インキュベートする。
7.96〜100%エタノール2000μLを「流動液」チューブに加える。混合物をボルテックスミキサーで混合し、極短時間遠心沈殿する。
8.溶離バッファー(10mMトリス、pH8.0)100μLを「溶離液」遠心管に分注する。遠心管を70℃に設定したヒートブロックに載置する。(溶離バッファーは少なくとも5分間70℃に加熱しなければならない。バッファーは操作13までヒートブロック上に保持する。)
9.3本の「エタノール」遠心管に70%エタノールを1mLずつ分注する。
10.レイニン電子ピペッターに取り付けたフリットチップ(中孔径)を用いて、ピペットでサンプル混合物を「流動液」チューブに移す。ピペッティングを5サイクル繰り返す(サイクル=吸引+送出)。
11.レイニン電子ピペッターを用い、「エタノール1」遠心管内の70%EtOHで10サイクルピペッティングして結合した核酸を洗う。「エタノール2」遠心管および「エタノール3」遠心管で70%EtOHによる洗浄を繰り返す(合計3回洗浄)。
12.空気を20サイクルピペッティングしてEtOHをフリットチップよりパージする。チップの外側を拭き取り、相当量のエタノールが残っている場合はチップを穏やかにたたく。
13.操作8の70℃の溶離バッファーで10サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。バッファーに気泡が生じる始めることもあるが、ピペッティングを続け、完了したならばマイクロ遠心管を1回完全に遠心沈殿させる。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認すること。
14.溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
15.リアルタイムPCRにより溶離した核酸を定量する。
この実験においては、以下のプロトコルにより、2.0mLレイニンフィルター装着ピペットチップおよび2mmガラスフリット(ROBU Glasfilter−Geraete GmbH、ドイツ)を用いて、各濃度のStreptococcus pyogenes懸濁液に由来する核酸を精製した。
1.1.5mL遠心管3本に「サンプル+グアニジン」、「エタノール」および「溶離液」とラベル表示する。
2.ガラスビーズを用い、ボルテックスミキサーで混合して溶解する。
3.ボルテックスミキサーにより、Streptococcus pyogenesサンプル500μLを6Mグアニジン500μL、pH6.5と混合する。未処理(すなわちプレグアニジン)Streptococcus pyogenesの一部も、操作10のリアルタイムPCR分析のために保存する。
4.溶離バッファー(1mM NaOH)100μLを「溶離液」遠心管に分注する。フリットチップ(中孔径)およびレイニン電子ピペッターを用いて、サンプル/グアニジン混合物をピペッティングする。5サイクルピペッティングする(サイクル=吸引+送出)。
5.レイニン電子ピペッターを用い、70%EtOH1mLを5サイクルピペッティングして結合した核酸を洗う。
6.電子ピペッターを用い、フリットチップに空気を通過させてEtOHをパージする。ピペッティングを20サイクル繰り返して痕跡量のEtOHを除去する。相当量のエタノールが残っている場合は、フリットチップをたたく。チップの外側のEtOHをキムワイプ®で取り除く。
7.操作4の70℃の溶離バッファーで10サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認すること。
8.溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
9.リアルタイムPCRにより溶離した核酸を定量する。
この実験においては、以下のプロトコルにより、2.0mLレイニンフィルター装着ピペットチップおよび2mmガラスフリット(ROBU Glasfilter−Geraete GmbH、ドイツ)を用いて、Bacillus anthracisを含有する鼻咽頭サンプルより核酸を精製した。
1.1.5mL遠心管3本に「サンプル+グアニジン」、「エタノール」および「溶離液」とラベル表示する。
2.鼻咽頭液450μLとBacillus anthracis(105コロニー形成単位(cfu)/mL水)50μLを「サンプル+グアニジン」遠心管中で混合して鼻咽頭サンプルを調製する(最終濃度104cfu/mL)。鼻咽頭サンプルの一部は操作11のリアルタイムPCR分析の対照用に保存する。
3.グアニジンpH6.5、500μLを「サンプル+グアニジン」遠心管に加え、ボルテックスミキサーで混合する。
4.溶離バッファー(10mMトリス、pH8.0)100μLを「溶離液」遠心管に分注する。管を70℃に設定したヒートブロックに載置する(溶離バッファーは70℃で少なくとも5分間加熱しなければならない)。遠心管は操作9までヒートブロック上に保持する。
5.レイニン電子ピペッターに取り付けたフリットチップ(中孔径)を用いて、サンプル/グアニジン混合物をピペッティングする。5サイクルピペッティングする(サイクル=吸引+送出)。
6.レイニン電子ピペッターを用い、70%EtOH1mLをピペッティングして結合した核酸を洗う。
7.電子ピペッターを用い、空気をフリットチップに通してEtOHをパージする。ピペッティングを20サイクル繰り返して痕跡量のEtOHを除去する。相当量のエタノールが残っている場合は、フリットチップをたたく。チップの外側のEtOHをキムワイプ®で取り除く。
8.操作4の70℃の溶離バッファファーで10サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認すること。
9.溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
10.リアルタイムPCRにより溶離した核酸を定量する。
この実験においては、以下のプロトコルにより、2.0mLレイニンフィルター装着ピペットチップおよび5mmガラスフリット(ROBU Glasfilter−Geraete GmbH、ドイツ)を用いて、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有する血液サンプルから核酸を精製した。
1.1.5mL遠心管6本に「流動液」、「エタノール1」、「エタノール2」、「エタノール3」、「溶離液1」および「溶離液2」とラベルする。
2.血液90μLとベネズエラウマ脳炎ウイルス(105プラーク形成単位(pfu)/mL水)10μLを「流動液」遠心管中で混合する(最終濃度104cfu/mL)。
3.キアゲンAL溶解バッファー280μLを混合物に加える。
4.プロテイナーゼK40μLを加える(20mg/mL)。
5.リゾチーム100μLを加え、ボルテックスで混合し、遠心沈殿する。
6.サンプル混合物を55℃で1時間インキュベートする。
7.96〜100%エタノール500μLを「流動液」遠心管に加える。混合物をボルテックスミキサーで混合し、遠心沈殿する。
8.溶離バッファー(10mMトリス、pH8.0)100μLを「溶離液」遠心管に分注する。管を70℃に設定したヒートブロックに載置する。(溶離バッファーは少なくとも5分間70℃に加熱しなければならない。バッファーは操作13までヒートブロック上に保持する。)
9.3本の「エタノール」遠心管に70%エタノールを1mLずつ分注する。
10.ギルソン電子ピペッターに取り付けたフリットチップ(中孔径)を用いて、ピペットでサンプル混合物を「流動液」遠心管に移す。ピペッティングを5サイクル繰り返す(サイクル=吸引+送出)。電子ピペッターを用い、「エタノール1」遠心管内の70%EtOHを10サイクルピペッティングして結合した核酸を洗う。「エタノール2」遠心管および「エタノール3」遠心管で70%EtOHによる洗浄を繰り返す(合計3回洗浄)。チップの外側を拭き取り、相当量のエタノールが残っている場合はチップを穏やかにたたく。
11.操作8の70℃の溶離バッファーで10サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。サイクルが終了したならば、ヒートブロック上より溶離バッファーを取り除く。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認する。
12.「溶離液1」遠心管に溶離液を捕集する。
13.同じフリットチップを用いて操作13を繰り返し、「溶離液2」遠心管に溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
15.リアルタイムPCRにより溶離した核酸を定量する。
図2Aに示す一体型サンプル調製システムのプロトタイプを、フロープロ流動操作システム(グローバルFIA、ワシントン州フォックスアイランド)に接続した。以下のプロトコルに従い、Yersinia pestis懸濁液より核酸を精製した。
1.1.5mL遠心管2本に「サンプル」および「溶離液」とラベル表示する。
2.1mM NaOH150μLを、グローバルFIAシステム上に留置された「溶離バッファー」と指定された遠心管に分注する。
3.70%NaOH500μLを、グローバルFIAシステム上に留置された「洗浄」遠心管に分注する。
4.「サンプル」遠心管(操作1)内でYersinia pestis懸濁液(104cfu/mL水)500μLを6MグアニジンpH6.5、500μLと混合し、ボルテックスで攪拌する。後の分析のために未混合サンプルの一部を保存する。
5.レイニン電子ピペッターを用いて、フリットチップ(中孔径)にサンプル/グアニジン混合物を吸引する。
6.フリットチップ(内部にサンプルを有する)を、グローバルFIA装置上に留置したサンプル調製カートリッジ上に載置する。
7.FloLVソフトウェアを用いて、「フリットチップサンプルトグル」シークエンス(図7)を実行する。8.FloLVソフトウェアを用いて、「フリットチップEtOH洗浄」シークエンスを実行する。
9.FloLVソフトウェアを用いて、「フリットチップEtOH乾燥」シークエンスを実行する。
10.FloLVソフトウェアを用いて、「フリットチップ溶離」シークエンスを実行する。
11.シークエンスが完了したならば、グローバルFIAシステムよりフリットチップを取出し、フリットチップをレイニン電子ピペッターに着接し、溶離液を「溶離液」とラベル表示した1.5mL遠心管に分注する。
11.フリットチップを廃棄する。
12.リアルタイムPCRにより溶離した核酸を定量する。
Claims (13)
- 第1の開口部と第2の開口部の間の経路を規定するハウジング;および
サンプルフィルターが核酸と特異的に結合するモノリス吸着剤を含む、前記経路の一部分を占める前記サンプルフィルターを含み、
前記モノリス吸着材は多孔質ガラスフリットから成り、前記多孔質ガラスフリットはホットプレス内でのビーズの粉砕により単一のモノリス構造を形成された焼結ガラスであり、且つ前記サンプルフィルターは陽電化生成のため化学的に処理されている、サンプル調製装置。 - 前記サンプルフィルターが核酸と特異的に結合する第1の部分および目的の分析物と特異的に結合する第2の部分を含む、請求項1に記載のサンプル調製装置。
- 前記目的の分析物がタンパク質である、請求項2に記載のサンプル調製装置。
- 前記第1の開口部が前記第2の開口部の直径よりも大きな直径を有し、且つ前記サンプルフィルターが前記第2の開口部のごく近傍に位置する、請求項1に記載のサンプル調製装置。
- 前記フリットの側面が前記経路の輪郭に対して先細である、請求項4に記載のサンプル調製装置。
- 前記ハウジングが前記サンプルフィルターのごく近傍に留置されたプレフィルターをさらに含み、前記プレフィルターの孔径は前記サンプルフィルターの孔径より大きい、請求項1に記載のサンプル調製装置。
- 前記ハウジングが前記第1の開口部の近傍に留置されたエアロゾルフィルターをさらに含む、請求項1に記載のサンプル調製装置。
- 前記ハウジングがピペットチップ構造にある、請求項1に記載のサンプル調製装置。
- 前記ガラスフリットが核酸とは異なる目的の分析物と特異的に結合する捕捉剤によってコーティングされる、請求項1又は2に記載のサンプル調製装置。
- 前記捕捉剤が抗体である、請求項9に記載のサンプル調製装置。
- 前記捕捉剤がレクチンである、請求項9に記載のサンプル調製装置。
- 第1の開口部と第2の開口部の間の経路を規定するハウジング;および
サンプルフィルターが核酸と特異的に結合するモノリス吸着剤を含む、前記経路の一部分を占める前記サンプルフィルターを含み、前記モノリス吸着材が多孔質ガラスフリットから成り、前記多孔質ガラスフリットはホットプレス内でのビーズの粉砕により単一のモノリス構造を形成された焼結ガラスであり、前記ガラスフリットは陽電化生成のため化学的に処理されている、サンプル調製装置;
前記サンプル調製装置を受容するよう設計された第1のポート;
液状物供給装置を受容するよう設計された第2のポート;
前記第1のサンプルポートと前記第2のサンプルポートを接続する導管を含むカートリッジベース;および
前記サンプル調製装置および前記カートリッジベースにおける流動物の流動を制御する、前記カートリッジベースに接続される、液状物供給装置を含むサンプル精製システム。 - 前記液状物供給装置が前記ハウジング上の同一の開口部を経て前記サンプル調製装置に液状物を供給および取出する、請求項12に記載のサンプル精製システム。
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