CN107130470A - 一种复合过滤膜及其制备方法和应用 - Google Patents

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黄美艳
曹建苹
孟兴
王家亮
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Shanghai Teng Teng Biological Technology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及核酸提取领域，公开了一种复合过滤膜的制备方法，该方法包括：(1)将纸浆原料进行打浆，制得纸浆浆料；(2)将所述纸浆浆料和硅类填料进行混合打浆，制得含硅浆料；其中，以所述含硅浆料的干重为基准，所述含硅浆料中以SiO2计的硅的含量为30‑99重量％；(3)将所述含硅浆料加入到纸样抄取器中，抄造成型成膜。本发明还公开了由上述方法制得的复合过滤膜。通过采用本发明的方法，能够简单且低廉地制得复合过滤膜，且所得的复合过滤膜具有优异的核酸提取效果，适于工业化生产。

Description

一种复合过滤膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，具体地，涉及一种复合过滤膜及其制备方法和应用。
背景技术
核酸的提取与纯化是分子生物学研究与应用的基础，核酸提取的效果直接关系着后续的工作与研究，但核酸的提取与纯化一直是耗时繁琐的过程，国内外许多学者立志于探索各种核酸的提取纯化方法。
硅胶膜离心吸附柱核酸提取试剂盒是目前已经商品化的核酸提取技术，其利用特制的硅胶膜吸附柱选择性吸附裂解细胞释放的DNA或RNA，操作简单快速，能有效的去除样本中的各种PCR抑止物，获得较纯的DNA或RNA。这样的硅胶膜离心吸附柱核酸提取试剂盒制备过程繁琐，且材料成本高，导致其造价高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的用于核酸提取的硅胶膜制备过程繁琐且造价高的缺陷，提供了一种制备简单且成本较低的一种复合过滤膜及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种复合过滤膜的制备方法，该方法包括：
(1)将纸浆原料进行打浆，制得纸浆浆料；
(2)将所述纸浆浆料和硅类填料进行混合打浆，制得含硅浆料；其中，以所述含硅浆料的干重为基准，所述含硅浆料中以SiO2计的硅的含量为30-99重量％；
(3)将所述含硅浆料加入到纸样抄取器中，抄造成型成膜。
本发明还提供了上述方法制得的复合过滤膜。
本发明还提供了上述复合过滤膜在核酸提取中的应用。
通过采用本发明的方法，能够简单且低廉地制得复合过滤膜，且所得的复合过滤膜具有优异的核酸提取效果，适于工业化生产。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例2所得的复合过滤膜M2的SEM图(局部放大50倍)。
图2是实施例3所得的复合过滤膜M3的实物照片。
图3是实施例3所得的复合过滤膜M3的SEM图(局部放大1000倍)。
图4是实施例4所得的复合过滤膜M4的SEM图(局部放大500倍)。
图5是对比例1所得的复合过滤膜DM1的SEM图。
图6是制备例1所得的二氧化硅纳米线的SEM图谱。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种复合过滤膜的制备方法，该方法包括：
(1)将纸浆原料进行打浆，制得纸浆浆料；
(2)将所述纸浆浆料和硅类填料进行混合打浆，制得含硅浆料；其中，以所述含硅浆料的干重为基准，所述含硅浆料中以SiO2计的硅的含量为30-99重量％；
(3)将所述含硅浆料加入到纸样抄取器中，抄造成型成膜。
根据本发明，步骤(1)将纸浆原料进行打浆即可获得制备复合过滤膜的必要原材料之一，即纸浆浆料。尽管本发明可以采用本领域常规的各种制备滤膜的纸浆原料来制备这里的纸浆浆料，但是考虑获得更为优异的核酸提取效果，优选情况下，所述纸浆原料选自针叶木浆、阔叶木浆和丝光化木浆中的一种或多种。
根据本发明，所述纸浆原料可以是干燥的固体，也可以是含水的液固混合物。含水的液固混合物形式的纸浆原料可以是商购的，也可以是自制的。例如可以将干燥的纸浆与水混合得到，特别是在水中浸泡一定时间(例如0.5h以上)所得混合物作为纸浆原料更有利于充分打浆。无论何种形式，为了能够得到纸浆浆料，需要将纸浆原料进行打浆，打浆需要在水存在下进行，本发明对这里的水含量并无特别的限定，只要所得的纸浆浆料能够适用于制备本发明的复合过滤膜即可，优选地，步骤(1)中，所述纸浆浆料中的干基含量为0.1-10重量％，更优选为0.1-1重量％，更进一步优选为0.1-0.8重量％。“干基含量”即表示所述纸浆浆料中的除去水分(以及其他溶剂，如果可能的话)后的固体的重量(即干重)占纸浆浆料总重量的百分比。为了能够获得这样的干基含量的纸浆浆料，在所述纸浆原料中的水分不足的情况下，可以加入适当的水，使得所得的纸浆浆料的干基含量在上述范围内。或者，在纸浆原料中的水分过多的情况下，可以通过蒸发等方式除去部分水后再进行打浆，以获得指定的干基含量的所述纸浆浆料。
根据本发明，所述打浆可以采用本领域常规的方式进行，例如采用纤维标准解离器进行所述打浆，例如采用北京亚欧德鹏科技有限公司DP-GBJ-A型号的纤维标准解离器、济南中仪仪器有限公司ZY-XJL型号的纤维标准解离器进行打浆。对所述打浆的条件并无特别的限定，只要能够获得适于制备本发明的复合过滤膜的纸浆浆料即可，优选情况下，步骤(1)中打浆的时间为5-60min。这里的打浆可以在任意适合的温度下进行，例如可以在10-40℃的温度下进行打浆。
根据本发明，步骤(2)将步骤(1)所得的纸浆浆料和硅类填料进行混合打浆，制得了具有特定的含硅量的含硅浆料，从而采用这样的含硅浆料可以获得本发明的有利于提取核酸的复合过滤膜。
尽管本发明的方法在步骤(2)中使得以所述含硅浆料的干重为基准，所述含硅浆料中以SiO2计的硅的含量为30-99重量％下，即可获得性能较好的复合过滤膜，但是为了能够获得核酸提取效果更好的过滤膜，优选情况下，以所述含硅浆料的干重为基准，所述含硅浆料中以SiO2计的硅的含量为40-90重量％，更优选为50-90重量％，更进一步优选为60-87重量％。在满足该范围的情况下，相对于1g的纸浆浆料的干重，所述硅类填料的用量优选为0.5-10g，更优选为0.67-9g，更进一步优选为1.5-4g。
根据本发明，所述硅类填料可以为所述复合过滤膜提供充分的二氧化硅、合适的空隙度和强度，从而能够获得核酸提取效果优良的复合过滤膜，优选情况下，所述硅类填料为二氧化硅纳米颗粒、二氧化硅纳米线、玻璃纤维、微纤维玻璃棉和石英棉中的一种或多种。
其中，所述二氧化硅纳米颗粒优选为粒度为50-200nm的二氧化硅纳米颗粒。
所述二氧化硅纳米线优选为长度为1-8μm且直径为30-150nm的二氧化硅纳米线。
所述二氧化硅纳米线可以是市售品，也可以制备而得，例如，所述二氧化硅纳米线的制备方法包括：(1)将含硅的农作物副产物和含铁化合物进行接触，将接触后的产物进行干燥，将干燥后的产物进行焙烧，其中，所述焙烧条件包括：温度为350-900℃，时间为1.5-8h；(2)在乙二胺存在下，将焙烧后的产物和水进行水热反应，其中，所述水热反应的条件包括：温度为130-200℃，时间为20-200h。所述含硅的农作物副产物中以SiO2计的硅含量为5-25重量％。
优选地，所述含硅的农作物副产物为稻壳、小麦、大麦、燕麦、甘蔗和玉米等中的一种或多种，更优选为稻壳。即本发明的所述含硅的农作物副产物更优选为以SiO2计的硅含量为10-21重量％的稻壳。
对所述含铁化合物并无特别的限定，只要能够在焙烧过程中形成Fe2O3即可，优选地，所述含铁化合物为Fe(NO3)3、FeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)2、FeCl2和FeSO4中的一种或多种，更优选为Fe(NO3)3、FeCl3和Fe2(SO4)3中的一种或多种。
优选地，相对于100重量份的以SiO2计的所述含硅的农作物副产物，以Fe2O3计的含铁化合物的用量为60-180重量份，优选为85-130重量份，更优选为90-130重量份。
优选地，步骤(1)中，所述干燥的条件包括：温度为60-120℃(优选为80-100℃)，时间为20-100h(优选为40-80h)。
其中，乙二胺既可提供碱性环境，又可参与并促进水热反应的进行。优选情况下，步骤(2)中，相对于1g焙烧后的产物，所述乙二胺的用量为2-20g，优选为10-18g。
根据本发明，对水的用量并无特别的限定，只要能够进行所述水热反应即可，优选地，步骤(2)中，相对于1g焙烧后的产物，水的用量为2-20g，优选为5-15重量份，更优选为8-13重量份。
所述玻璃纤维优选为直径为3-15μm的玻璃纤维。
所述微纤维玻璃棉中的玻璃棉微纤维的直径优选为0.5-5μm。
所述石英棉优选中的石英棉纤维的直径优选为2-9μm。
根据本发明，优选情况下，步骤(2)中打浆的时间为5-60min。这里的打浆可以在任意适合的温度下进行，例如可以在10-40℃的温度下进行打浆。通过上述两个步骤的打浆，优选获得打浆度为21-55°SR的含硅浆料。
为了方便操作，该步骤(2)可以直接将硅类填料加入到步骤(1)打浆后的打浆机中与纸浆浆料混合。
根据本发明，步骤(3)将所述含硅浆料加入到纸样抄取器中，抄造成型成膜，即可获得本发明的复合过滤膜的湿膜，将该湿膜进行干燥后即可获得本发明的复合过滤膜。
其中，所述纸样抄取器可以为本领域常规的各种纸样抄取器，例如可以为兴平市中通试验装备有限公司ZT6-00/Φ200型号的纸样抄取器、咸阳泰思特试验设备有限公司PL6-C型号的纸样抄取器、东莞市英特耐森精密仪器有限公司IMT型号的纸样抄取器等。纸样抄取器的一般操作包括：将含硅浆料加入到纸样抄取器料筒中，鼓泡匀浆，打开放水开关进行放水，待液位降至低于网面数十毫米以后(例如可以为20-50毫米)，抽滤使得滤膜成型，随后便可获得湿膜。其中，为了能够获得所需的复合过滤膜，骤(3)还包括采用水对加入到纸样抄取器中的含硅浆料进行稀释，该水的用量使得稀释后的浆料的干基含量为0.03-1重量％。结合到纸样抄取器的操作来说，就是打开上水开关，当抄取筒内水位上升到一定刻度后，停止上水，将含硅浆料加入到纸样抄取器料筒中，随之如上所述进行操作。
根据本发明，该方法还可以包括将步骤(3)所得的膜进行干燥，优选情况下，所述干燥的条件包括：温度为50-120℃，时间为2-24h。更优选地，所述干燥的条件包括：温度为50-100℃，时间为4-20h。
本发明还提供了由上述方法制得的复合过滤膜。
根据本发明所得的复合过滤膜的厚度优选为0.5-1.5mm。
本发明的方法通过采用资源丰富易得的纸浆原料和硅类填料作为原料，且操作简单，使得所得的复合过滤膜的造价得到大大的降低，非常利于工业化生产。并且所得的复合过滤膜中组分分散均匀，具有适当的介孔结构和空隙，具有优异的核酸提取效果。
本发明还提供上述复合过滤膜在核酸提取中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中：
纸样抄取器采用的是咸阳泰思特试验设备有限公司PL6-C型号的纸样抄取器。
SEM谱图是通过HITACHI公司S-3400N型号的扫描电子显微镜。
制备例1
本制备例用于说明二氧化硅纳米线的制备方法。
(1)将10g稻壳水洗干净后与13.2g的55重量％的Fe(NO3)3水溶液在80℃下、以500rpm进行搅拌混合60min，将所得产物在鼓风干燥箱中于80℃下干燥48h至烘干，得到褐色干燥的产物；将该干燥的产物放入马弗炉中，于400℃下焙烧4h，得到4.37g表面附着有砖红色的氧化铁的粉体；
(2)将步骤(1)所得的粉体、62.93g的乙二胺和43.7g的水混合，并于200℃下进行水热反应96h；
(3)将步骤(2)水热反应后的产物静置冷却至室温(约20℃)，倾出上层清液后，加入200g的30重量％的盐酸水溶液，并在搅拌下加热至60℃反应3h，然后水洗至中性，将所得固相在鼓风干燥箱中于80℃下烘干24h，得到白色的二氧化硅纳米线1.78g，收率为89％，纯度为97.2％，平均长度约为5.02μm，直径约为50～100nm，其SEM图谱见图6。
实施例1
本实施例用于说明本发明的复合过滤膜及其制备方法。
(1)将3g阔叶木浆纸浆(购自肥城东升纸业有限公司)于500g的水中浸泡2h，制得纸浆原料，其干基含量为0.6重量％；将该纸浆原料加入到纤维解离器中于室温(约25℃)下打浆5min；
(2)之后加入7g的二氧化硅纳米颗粒(购自上海迈坤化工有限公司，粒度为100nm)，继续打浆10min，得到打浆度为34°SR的含硅浆料，其中以所述含硅浆料的干重为基准，以SiO2计的硅的含量为70重量％；
(3)打开上水开关，往纸样抄取器料筒中，加入1000g的水，然后加入上述含硅浆料(则浆料的干基含量为0.67重量％)，并鼓泡匀浆；打开放水开关放水，待液位降至低于网面约20毫米以后，抽滤使得滤膜成型，打开料筒，揭下湿膜；将该湿膜在80℃下干燥6h至烘干，得到复合过滤膜M1，其厚度为约1mm。
将滤膜M1随机选块剪裁成直径为0.7cm的膜，装柱，将所得柱子替换RNA纯化试剂盒(购自上海润腾生物科技有限公司，QIAGEN，货号74104)中的柱子以从小鼠的肝脏组织细胞分离提纯RNA，并通过微量分光光度计NANO-200(上海昨非实验室设备有限公司)进行RNA纯度测试，最后得到的A260/280和A260/230的值分别为2.01和1.85，这表明复合过滤膜M1具有很好的提纯RNA性能。
实施例2
本实施例用于说明本发明的复合过滤膜及其制备方法。
(1)将3.5g阔叶木浆纸浆(购自肥城东升纸业有限公司)于1000g的水中浸泡1.5h，制得纸浆原料，其干基含量为0.35重量％；将该纸浆原料加入到纤维解离器中于室温(约25℃)下打浆5min；
(2)之后加入6.5g的二氧化硅纳米线(制备例1所得，以下同)，继续打浆10min，得到打浆度为49°SR的含硅浆料，其中以所述含硅浆料的干重为基准，以SiO2计的硅的含量为65重量％；
(3)打开上水开关，往纸样抄取器料筒中，加入1000g的水，然后加入上述含硅浆料(则浆料的干基含量为0.5重量％)，并鼓泡匀浆；打开放水开关放水，待液位降至低于网面约20毫米以后，抽滤使得滤膜成型，打开料筒，揭下湿膜；将该湿膜在100℃下干燥4h至烘干，得到复合过滤膜M2，其厚度为约1.2mm，其SEM图如图1所示。
将滤膜M2随机选块剪裁成直径为0.7cm的膜，装柱，将所得柱子替换RNA纯化试剂盒(购自上海润腾生物科技有限公司，QIAGEN，货号74104)中的柱子以从小鼠的肝脏组织细胞分离提纯RNA，并通过微量分光光度计NANO-200(上海昨非实验室设备有限公司)进行RNA纯度测试，最后得到的A260/280和A260/230的值分别为2.02和1.88，这表明复合过滤膜M2具有很好的提纯RNA性能。
实施例3
本实施例用于说明本发明的复合过滤膜及其制备方法。
(1)将0.5g针叶木浆纸浆(购自肥城东升纸业有限公司)于500g的水中浸泡0.5h，制得纸浆原料，其干基含量为0.1重量％；将该纸浆原料加入到纤维解离器中于室温(约25℃)下打浆5min；
(2)之后加入3.5g的微纤维玻璃棉(购自重庆再升科技股份有限公司，微纤维玻璃棉的纤维的平均直径约为2～3μm，以下同)，继续打浆10min，得到打浆度为34°SR的含硅浆料，其中以所述含硅浆料的干重为基准，以SiO2计的硅的含量为87.5重量％；
(3)打开上水开关，往纸样抄取器料筒中，加入1000g的水，然后加入上述含硅浆料(则浆料的干基含量为0.26重量％)，并鼓泡匀浆；打开放水开关放水，待液位降至低于网面约20毫米以后，抽滤使得滤膜成型，打开料筒，揭下湿膜；将该湿膜在50℃下干燥20h至烘干，得到复合过滤膜M3，其厚度为约1.3mm，其实物照片如图2所示，SEM图如图3所示。
将滤膜M3随机选块剪裁成直径为0.7cm的膜，装柱，将所得柱子替换RNA纯化试剂盒(购自上海润腾生物科技有限公司，QIAGEN，货号74104)中的柱子以从小鼠的肝脏组织细胞分离提纯RNA，并通过微量分光光度计NANO-200(上海昨非实验室设备有限公司)进行RNA纯度测试，最后得到的A260/280和A260/230的值分别为2.03和1.91，这表明复合过滤膜M3具有很好的提纯RNA性能。
实施例4
本实施例用于说明本发明的复合过滤膜及其制备方法。
(1)将1g阔叶木浆纸浆(购自肥城东升纸业有限公司)于500g的水中浸泡1h，制得纸浆原料，其干基含量为0.2重量％；将该纸浆原料加入到纤维解离器中于室温(约25℃)下打浆6min；
(2)之后加入3.5g的微纤维玻璃棉和0.5g的二氧化硅纳米线，继续打浆8min，得到打浆度为34°SR的含硅浆料，其中以所述含硅浆料的干重为基准，以SiO2计的硅的含量为80重量％；
(3)打开上水开关，往纸样抄取器料筒中，加入500g的水，然后加入上述含硅浆料(则浆料的干基含量为0.5重量％)，并鼓泡匀浆；打开放水开关放水，待液位降至低于网面约20毫米以后，抽滤使得滤膜成型，打开料筒，揭下湿膜；将该湿膜在100℃下干燥5h至烘干，得到复合过滤膜M4，其厚度为约1.4mm，其SEM图如图4所示。
将滤膜M4随机选块剪裁成直径为0.7cm的膜，装柱，将所得柱子替换RNA纯化试剂盒(购自上海润腾生物科技有限公司，QIAGEN，货号74104)中的柱子以从小鼠的肝脏组织细胞分离提纯RNA，并通过微量分光光度计NANO-200(上海昨非实验室设备有限公司)进行RNA纯度测试，最后得到的A260/280和A260/230的值分别为2.05和1.95，这表明复合过滤膜M4具有很好的提纯RNA性能。
对比例1
根据实施例2所述的方法，不同的是，加入了0.5g的二氧化硅纳米线，使得所得的含硅浆料以SiO2计的硅的含量为12.5重量％；从而复合过滤膜DM1，其厚度为约1.1mm，其SEM图如图5所示，该过滤膜的RNA纯化性能较差。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种复合过滤膜的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将纸浆原料进行打浆，制得纸浆浆料；
(2)将所述纸浆浆料和硅类填料进行混合打浆，制得含硅浆料；其中，以所述含硅浆料的干重为基准，所述含硅浆料中以SiO2计的硅的含量为30-99重量％；
(3)将所述含硅浆料加入到纸样抄取器中，抄造成型成膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述含硅浆料的干重为基准，所述含硅浆料中以SiO2计的硅的含量为40-90重量％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)中，所述纸浆浆料中的干基含量为0.1-10重量％。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(1)中，所述纸浆浆料中的干基含量为0.1-1重量％。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，步骤(2)中，所述硅类填料为二氧化硅纳米颗粒、二氧化硅纳米线、玻璃纤维、微纤维玻璃棉和石英棉中的一种或多种。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，步骤(3)还包括采用水对加入到纸样抄取器中的含硅浆料进行稀释，该水的用量使得稀释后的浆料的干基含量为0.03-1重量％。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，步骤(1)中打浆的时间为5-60min；步骤(2)中打浆的时间为5-60min。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括将步骤(3)所得的膜进行干燥，所述干燥的条件包括：温度为50-120℃，时间为2-24h。
9.由权利要求1-8中任意一项所得的复合过滤膜。
10.权利要求9所述的复合过滤膜在核酸提取中的应用。
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