CN108130325B - 一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μm的无机纤维制成。本发明提供的这种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱，内部滤芯对于核糖核酸具有更高的吸附效果。根据人体血清miRNA提取实验的qPCR检测实验结果，本发明的纯化效果相比国产纯化柱提高10倍左右，而相比某进口纯化柱提高4倍左右，进一步提升了已有核糖核酸纯化柱的纯化品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱。
背景技术
核糖核酸纯化柱(Spin column)是目前公知的用于各种材料的RNA提取以及精制的核心装置。其具有操作简单、回收率高、性能稳定等特点，目前这种产品已经为国内外大多数实验室和公司使用。
已知的纯化柱的滤芯主要采用硅胶膜、硅基质膜或者硝化纤维等有机材料作为核糖核酸的特异性吸附材料，这类材料对其他生物材料基本不吸附，可以保障最大程度地回收样品中的DNA\RNA，同时去除其他杂质。
众所周知，分子生物学研究中MicroRNA(miRNA)是由内源基因编码、长度约21～25nt的一类非编码单链RNA分子，其主要功能是参与动植物转录后的基因表达与调控。提取纯化RNA是一个基础性的工作，各种临床检测或者基础科研中都需要提取纯化RNA。在核酸样本中低丰度的核酸检测中，纯化效率高则低丰度的核酸能获得更多，便于下游检测”等以突出该纯化柱的优势。
目前国内外提取纯化RNA的方法中较为常见的一种为Trizol法。以提取正常人体血清microRNA为例，其流程通常为先取一定量的血清样品，加入Trizol裂解液和氯仿，离心取上清液，把上清液与乙醇混一起，上纯化柱提取，最后采用无RNase水(无RNA酶的水)洗脱。
由于不同滤芯材料的纯化柱对于RNA的提取效果是不同的，因此对于提取后的RNA含量的后续检测也是评定纯化柱对于核酸吸附效果的重要环节。通常情况下，如果纯化柱的提取效果好则提取的总RNA含量高，那么在其中miRNA含量相对也高。当然现有技术中主要采取qPCR检测法，即实时PCR检测法专门检测个别miRNA的含量，如果含量高，则对应的Ct值小，说明纯化柱的提取效果好(提取物纯度高)；如果含量低，则对应的Ct值大，说明纯化柱提取效果差(提取物纯度低)，对于目前的纯化柱来说，在相同的提取方法及操作条件下，最后能通过Ct的大小判断核酸纯化柱，或者说核酸纯化柱的滤芯的提取吸附效果。当然，RNA要进行PCR检测，必须将RNA先转换为DNA，所以在PCR检测环节中，RNA提取之后需要通过逆转录反应将RNA转换为DNA后再进行PCR检测。
根据我们了解的情况并通过长期实践，目前以有机材料作为滤芯的纯化柱在提取效果上(miRNA含量)的提升有限，提取含量低于预期。这主要归结为现有纯化柱中滤芯材料的性能，因此为了提取得到纯度更高，量更大的核糖核酸，必须寻找更好的纯化柱滤芯替代材料。
发明内容
本发明目的是：提供一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱，提取效果更好。
本发明的技术方案是：一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μm的无机纤维制成。
进一步的，本发明中所述无机纤维选用下述单一或几种物质的混合物：氧化铝纤维、硅酸铝纤维及玻璃纤维。
更进一步的，本发明中所述玻璃纤维是指C-玻璃纤维，D-玻璃纤维，E-玻璃纤维和AR玻璃纤维中的一种或几种的混合物。
进一步的，本发明中所述氧化铝纤维的组分质量百分比含量为：Al2O3 65～99％，SiO2 1～35％。
更进一步的，本发明中所述硅酸铝纤维的组分质量百分比含量为：Al2O3 30～55％，SiO2 60～35％，ZrO2 0～17％。
更进一步的，本发明中所述玻璃纤维的组分质量百分比含量为：SiO2 50～67％。Al2O3 0～16％，CaO+MgO 0～25％，R2O 0～18％，ZrO2 0～21％，B2O3 0～10％，其中R2O是指Na2O和K2O中的一种。
进一步的，本发明中所述无机纤维密度为0.2～1g/cm3。
更进一步的，本发明中所述无机纤维密度为0.3～0.5g/cm3。
本发明的优点是：
本发明提供的这种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱，内部滤芯对于核糖核酸具有更高的吸附效果。根据人体血清miRNA提取实验的qPCR检测实验结果，本发明的纯化效果相比国产纯化柱提高10倍左右，而相比某进口纯化柱提高4倍左右，进一步提升了已有核糖核酸纯化柱的纯化品质。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为Hsa-miR-16的一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-1纯化柱与国产、进口纯化柱比较)；
图2为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-2纯化柱与国产、进口纯化柱比较)；
图3为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱与国产、进口纯化柱比较)；
图4为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱中去除偏差最大的一个后与国产、进口纯化柱比较)；
图5为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱中最好的三个与国产、进口纯化柱比较)；
图6为hsa-miR-122的一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-1纯化柱与国产、进口纯化柱比较)；
图7为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-1纯化柱中去除偏差最大的一个后与国产、进口纯化柱比较)；
图8为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(3个NO-2纯化柱与国产、进口纯化柱比较)；
图9为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱与国产、进口纯化柱比较)；
图10为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图(6个NO-3纯化柱中最好的三个与国产、进口纯化柱比较)。
具体实施方式
实施例1：纯化柱的编号NO-1，其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径1.8μm的氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为：Al2O3 72％，SiO2 28％。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米、氧化铝纤维密度0.38g/cm3。
实施例2：纯化柱的编号NO-2，其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料是平均直径1.8μm的氧化铝纤维、平均直径1.2μm的C玻璃纤维和平均直径1.2μm的E玻璃纤维的混合物，它们各自质量百分含量为氧化铝纤维20％，C玻璃纤维40％，E玻璃纤维40％。其中：
氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为Al2O372％，SiO2 28％；
C玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO2 60％，Al2O3 6％，CaO+MgO 20％，Na2O10％，B2O3 4％；
E玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO2 52％，Al2O3 16％，CaO+MgO 25％，K2O0.6％，B2O3 6.4％。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，该滤芯材料密度0.38g/cm3。
实施例3：纯化柱的编号NO-3，其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径0.5μm的硅酸铝纤维，其组分质量百分比含量为：Al2O3 46％，SiO2 54％。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，硅酸铝纤维密度0.42g/cm3。
作为比较例：
国产纯化柱：为目前市面上可以买到的硅胶膜滤芯纯化柱。
该硅胶膜滤芯重量0.03克，厚度2毫米，其滤芯材料密度0.38g/cm3。
进口纯化柱：某欧洲公司的217004miRNeasy Mini Kit，其中纯化柱滤芯材料为有机高分子树脂。该进口纯化柱使用滤芯重量0.03克，厚度2毫米，其滤芯材料密度0.38g/cm3。
下面通过将上述实施例的纯化柱样例与国产、进口纯化柱共同进行人体血清miRNA的提取，并且通过qPCR检测法检测总RNA中特定基因Hsa-miR-16，Hsa-miR-122两种miRNA的Ct值来评估纯化柱性能。对应纯化柱检测得到的Ct值越小，说明对应纯化柱得到的miRNA越多，则其纯化效率越高。
1.纯化柱：
2.RNA提取方法采用经典的Trizol法：
取3ml血清样品，加入Trizol裂解液裂解，再加入氯仿，离心后取上清，上清液中加入结合液，混匀后将混合液均匀加入17个纯化柱内(一定要保证每个纯化柱内加入的混合液均匀且量相等)提取RNA，之后用100ul无RNase水洗脱得到样品。
对17个纯化柱分别进行编号NO-1(1)，NO-1(2)，NO-1(3)，NO-2(1)，NO-2(2)，NO-2(3)，NO-3(1)，NO-3(2)，NO-3(3)，NO-3(4)，NO-3(5)，NO-3(6)，国产纯化柱(1)，国产纯化柱(2)，国产纯化柱(3)，进口纯化柱(1)，进口纯化柱(2)。
3.从各纯化柱中取等体积RNA样品做hsa-miR-16和hsa-miR-122的逆转录反应，之后用逆转录产物做qPCR检测。
4.结果：
而各纯化柱提取后经qPCR检测的Hsa-miR-16的Ct值见下表(对获取的每一样品均检测记录两次Ct值)：
从上述表格我们可以看出：NO-1和NO-2纯化柱系中，Ct值结果偏差最大的一个是NO-1(2)，其获取的样品两次检测结果为25.21544和25.25136，略大于NO-1和NO-2系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。
NO-3纯化柱中最好的三个是NO-3(1)，NO-3(2)和NO-3(5)。而偏差最大的一个是NO-3(3)，其获取的样品两次检测结果为25.62504和25.68264，略大于NO-3系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。
各纯化柱提取后经PCR检测的hsa-miR-122的Ct值见下表：
从上述表格我们可以看出：NO-1纯化柱中，Ct值结果偏差最大的一个是NO-1(2)，其获取的样品两次检测结果为30.96686和30.98852，略大于NO-1系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。
NO-3纯化柱中最好的三个是NO-3(1)，NO-3(2)和NO-3(4)。
而qPCR检测hsa-miR-16的扩增曲线图如图1～图5所示，而qPCR检测hsa-miR-122的扩增曲线图如图6～图10所示。
从图中我们可以看到，经本案实施例NO-1、NO-2和NO-3纯化柱提取得到的RNA中相应基因hsa-miR-16和hsa-miR-122逆转录产物的扩增曲线明显都优于国产和进口纯化柱。
从上述表格和图中我们可以得出结论：
采用本发明无机材料滤芯的NO-1、NO-2、NO-3纯化柱提取得到的hsa-miR-16d的Ct值几乎无差异，且均小于国产纯化柱和进口纯化柱的提取样品Ct值。同样NO-1、NO-2、NO-3纯化柱提取得到的hsa-miR-122的Ct值也几乎无差异，且均小于国产纯化柱和进口纯化柱的提取样品Ct值，
Ct值小，说明纯化柱对样品的提取效果好(提取物量更大，纯度更高)。这表明本发明的纯化柱其对于miRNA的纯化效果大大优越于国产纯化柱和进口纯化柱。经过长期实验对比检测，本发明的纯化柱的纯化效果比国产纯化柱效果高10倍左右，比进口纯化柱的纯化效果高4倍左右。
实施例4：纯化柱的编号NO-4，其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径1.2μm的氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为：Al2O3 97％，SiO2 3％。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，氧化铝纤维密度0.38g/cm3。
实施例5：纯化柱的编号NO-5，其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料是平均直径1.2μm的氧化铝纤维、平均直径1.1μm的C玻璃纤维的混合物，它们各自质量百分含量为氧化铝纤维20％，C玻璃纤维80％。其中：
氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为Al2O397％，SiO2 3％；
C玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO2 67％，Al2O32％，CaO+MgO 20％，Na2O8％，B2O3 3％；每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，滤芯材料密度0.42g/cm3。
实施例6：纯化柱的编号NO-6，其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径0.8μm的硅酸铝纤维，其组分质量百分比含量为：Al2O3 35％，SiO2 50％，ZrO215％。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，硅酸铝纤维密度0.38g/cm3。
作为比较例：
自制对比例1：纯化柱结构参见现有技术，滤芯材料选用平均直径5μm的氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为：Al2O3 72％，SiO2 28％。
每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，氧化铝纤维密度0.38g/cm3。
自制对比例2：纯化柱结构参见现有技术，滤芯材料是平均直径5μm的氧化铝纤维和平均直径2.6μm的C玻璃纤维的混合物，它们各自质量百分含量为氧化铝纤维50％，C玻璃纤维50％，其中：
氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为Al2O372％，SiO2 28％；
C玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO2 60％，Al2O3 6％，CaO+MgO 20％，Na2O10％，B2O3 4％；每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，滤芯材料密度0.38g/cm3。
自制对比例3：纯化柱结构参见现有技术，滤芯材料选用平均直径3μm的硅酸铝纤维，其组分质量百分比含量为：Al2O3 46％，SiO2 54％。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，硅酸铝纤维密度0.38g/cm3。
下面通过将上述实施例4～6的纯化柱样例与三个自制对比例共同进行人体血清microRNA的提取，并且通过qPCR检测法检测总RNA中特定基因Hsa-miR-16，Hsa-miR-122两种microRNA的Ct值来评估纯化柱性能。对应纯化柱检测得到的Ct值越小，说明对应纯化柱得到的miRNA越多，则其纯化效率越高。
5.纯化柱：
6.RNA提取方法采用经典的Trizol法：
取3ml血清样品，加入Trizol裂解液裂解，再加入氯仿，离心后取上清，上清液中加入结合液，混匀后将混合液均匀加入18个纯化柱内(一定要保证每个纯化柱内加入的混合液均匀且量相等)提取RNA，之后用100ul无Rnase水洗脱得到样品。
对18个纯化柱分别进行编号NO-4(1)，NO-4(2)，NO-4(3)，NO-5(1)，NO-5(2)，NO-5(3)，NO-6(1)，NO-6(2)，NO-6(3)，NO-6(4)，NO-6(5)，NO-6(6)，自制对比例1(1)，自制对比例1(2)，自制对比例2(1)，自制对比例2(2)，自制对比例3(1)，自制对比例3(2)。
7.从各纯化柱中取等体积RNA样品做hsa-miR-16和hsa-miR-122的逆转录反应，之后用逆转录产物做qPCR检测。
8.结果：
而各纯化柱提取后经qPCR检测的Hsa-miR-16的Ct值见下表(对获取的每一样品均检测记录两次Ct值)：
从上述表格我们可以看出：NO-4和NO-5纯化柱系中，Ct值结果偏差最大的一个是NO-4(2)，其获取的样品两次检测结果为25.17644和25.23254，略大于NO-4和NO-5系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。
NO-6纯化柱中最好的三个是NO-6(1)，NO-6(2)和NO-6(5)。而偏差最大的一个是NO-6(3)，其获取的样品两次检测结果为25.52504和25.63234，略大于NO-6系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。
各纯化柱提取后经PCR检测的hsa-miR-122的CT值见下表：
从上述表格我们可以看出：NO-4、NO-5和NO-6纯化柱系中，Ct值结果偏差最大的一个是NO-6(3)，其获取的样品两次检测结果为29.98688和29.96645，略大于系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。
从上述表格我们可以得出结论：
采用本发明无机材料滤芯的NO-4、NO-5、NO-6纯化柱提取得到的hsa-miR-16d的Ct值几乎无差异，且均小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。同样NO-4、NO-5、NO-6纯化柱提取得到的hsa-miR-122的Ct值也几乎无差异，且均小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。Ct值小，说明纯化柱对样品的提取效果好(提取物量更大，纯度更高)。这表明本发明的纯化柱其对于miRNA的纯化效果大大优越于自制对比例(以平均直径>2μm的无机材料作为滤芯)的各化柱。
当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于：所述纯化柱的滤芯选用平均直径1.2~1.8μm氧化铝纤维，或者平均直径0.5~0.8μm的硅酸铝纤维，或者平均直径1.2~1.8μm氧化铝纤维与平均直径1.1~1.2μm玻璃纤维的混合物，质量百分比含量氧化铝纤维20%，
所述氧化铝纤维的组分质量百分比含量为：Al2O3 65~99%，SiO2 1~35%，
所述硅酸铝纤维的组分质量百分比含量为：Al2O3 30~55%，SiO2 60~35%，ZrO2 0~17%，
所述玻璃纤维是指C-玻璃纤维，D-玻璃纤维，E-玻璃纤维和 AR玻璃纤维中的一种或几种的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于：所述玻璃纤维的组分质量百分比含量为：SiO2 50~67%，Al2O3 0~16%，CaO+MgO 0~25%，R2O 0~18%，ZrO2 0~21%，B2O3 0~10%, 其中 R2O 是指 Na2O 和 K2O 中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于：所述无机纤维密度为 0.2~1g/cm3。
4.根据权利要求3所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于：所述无机纤维密度为 0.3~0.5g/cm3。
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