CN107475243A - 一种改良酚抽提总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良酚抽提总RNA的方法，通过裂解细菌菌体、经水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1抽提获得总核酸，再使用pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液与总核酸混合，最后通过水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为125:24:1抽提纯化出不含基因组DNA的总RNA。该方法的提取过程简单，无需使用DNA酶消化去除总核酸中的基因组DNA；提取得到的总RNA样品的纯度高，扩增能力较强。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改良酚抽提总RNA的方法。
背景技术
随着分子生物学的不断发展，高质量RNA样品是很多实验的关键所在。而一些实验如逆转录PCR(RT-PCR)、基因芯片等，更需要高纯度高质量的RNA样品。稳定高效的RNA提取方法对于相关实验研究至关重要。
最为经典的抽提RNA的方法当属“酚抽提法”，然而，目前学术界对于酚抽提过程中pH值的定义并不明确，甚至有些错误的认识。《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，科学出版社2002，第1587页提到所谓酚相的pH值，但实际上酚是一种有机溶剂，并非水溶液，所以酚相的pH值是没有意义的。
一种常用于抽提RNA的“酸性酚”，是使用固定pH值的酸性缓冲液(醋酸钠或者柠檬酸钠缓冲液)对水饱和酚进行反复的平衡，直至最终平衡之后的水相缓冲液pH值不再变化。这种“酸性酚”制备十分费时费力，而且在实际使用中，这种“酸性酚”对于去除RNA样品中基因组DNA的残留效果也并不稳定。
如何利用酚抽提方法，在合适的条件下精准地将DNA和RNA分离，成为了目前亟待解决的问题。
发明内容
基于以上背景，本发明提供了一种改良酚抽提总RNA的方法，通过裂解细菌菌体、第一次酚抽提获得总核酸，再使用pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液与总核酸混合，最后通过第二次酚抽提纯化出不含基因组DNA的总RNA。
本发明采取的技术方案为：
一种改良酚抽提总RNA的方法，包括如下步骤：
a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；
b)加入与重悬液体积相同的裂解液，室温裂解3-5分钟，或65℃裂解0.5-1分钟；
c)加入与a)b)两步中溶液总体积相等的酚抽提液1，反复振荡混匀；12000r/min离心10-15分钟；吸取上清液；
d)向c)步骤所得上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，上下反复颠倒，待充分沉淀；12000r/min离心10分钟；弃上清；
e)向d)步骤所得的沉淀中加入洗涤液，洗涤1～2次，再用超纯水溶解沉淀，所得即为总核酸溶液。
f)取e)步骤中的总核酸溶液，加入与总核酸溶液等体积的酸性醋酸钠溶液，以及等体积的氯化钠溶液；
g)加入同f)步骤中溶液等体积的酚抽提液2，反复混匀之后，12000r/min离心5-10分钟；吸取上清液；
h)向g)步所得的上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；
i)加入洗涤液洗涤一次后，加入超纯水溶解沉淀，所得即为RNA样品。
步骤a)中，所述重悬液为超纯水；所述生物材料为细菌菌体，菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100μL，以避免菌体过多造成纯化困难和菌体过少导致产物得率下降。
步骤b)中，所述裂解液为十二烷基硫酸钠溶液，其重量浓度为2±0.2％。选用十二烷基硫酸钠溶液作为裂解液裂解较为简单，且优于其他一些裂解法，比如异硫氰酸胍+酚作为裂解液的裂解。
步骤c)中，所述酚抽提液1为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液，此种比例是抽提总核酸的最佳比例，可避免在抽提过程中核酸的损失。
步骤e)中，所述洗涤液为75±5％乙醇溶液，选用75±5％乙醇溶液作为洗涤液既能有效洗涤去除盐分等杂质，同时又能避免样品在洗涤的过程中过多损失。
步骤f)中，所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液，其pH为3.85±0.10；其中，醋酸钠和醋酸的摩尔浓度均为50mmol/L，
步骤f)中，所述氯化钠溶液浓度为150±0.1mol/L，此浓度的氯化钠溶液一方面可以为总核酸溶液提供一定的离子强度，又有利于提高步骤h)中乙醇沉淀RNA的效率。
步骤g)中，所述酚抽提液2为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液，此种比例最适合提取RNA，并能更有效吸附去除基因组DNA。
本发明公开的改良酚抽提总RNA的方法，采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂裂解生物材料，先利用第一次酚抽提法抽提样品的总核酸，总核酸中包含总RNA和基因组DNA，并去除生物材料的其他杂质。然后在总核酸中加入酸性醋酸钠溶液，创造酸性的水相环境，使部分核酸可被酚抽提液吸附。酚相所吸附的核酸分子量的大小与水相环境的pH值密切相关。当水相pH值较低时，大量核酸会分配到酚相当中。随着水相pH值的不断提高，分配到水相中的RNA不断增多。当水相pH值更高时，基因组DNA也会被抽提出来。
利用这一现象，本发明选择了pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液，在第二次酚抽提时将总RNA纯化出来，而将基因组DNA分配到酚相去除。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.总RNA的提取过程简单，无需使用DNA酶消化去除总核酸中的基因组DNA；
2.提取得到的总RNA样品的纯度高，样品中残留基因组DNA较少；
3.根据本发明公开的方法提取得到的RNA的扩增能力较强。
附图说明
图1为实施例1和实施例2中的方法提取得到的RNA的电泳结果。M：DNA MarkerVII；泳道1-10，从左向右分别为所加醋酸钠pH值：3.13、3.51、3.85、4.21、4.56、4.83、5.36、5.73、6.35、7.20；泳道12，抽提RNA所用总核酸。
图2为实施例3中实时定量PCR检测本法提取RNA样品以及其他方法所得RNA样品中残留基因组DNA的含量。
图3为实施例4中实时定量PCR检测本法提取RNA样品以及其他方法所得RNA样品的扩增能力。
具体实施方式
实施例1
a)挑取平板划线培养大肠杆菌菌株DH5α单菌落，至100ml LB液体培养基，37度过夜振荡培养。离心收获菌液。1.5mL菌液离心所得菌体用100μL超纯水进行重悬，所述菌体的质量为20-50mg；
b)加入100μL重量浓度为2±0.2％的十二烷基硫酸钠溶液，充分混匀，室温裂解3分钟。
c)加入200μL酚抽提液1，所述酚抽提液1为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液，反复振荡混匀；12000r/min离心10-15分钟；吸取上清液200μL；
d)将c)步骤所得上清液中加入400μL无水乙醇，轻柔地颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；
e)将d)步骤所得RNA沉淀用75±5％乙醇溶液洗涤两次，加入100μL的超纯水溶解。所得即为总核酸溶液；
f)取e)步骤中的总核酸溶液50μL，加入50μL酸性醋酸钠溶液和50μL 150±0.1mol/L氯化钠溶液；所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液，其pH为3.85±0.10；
g)加入150μL酚抽提液2，所述酚抽提液2为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液，反复混匀之后，12000r/min离心10分钟；吸取上清液140μL；
h)向g)步所得的上清液中加入280μL无水乙醇，轻柔地颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；
i)加入75±5％乙醇溶液洗涤一次后，加入50μL超纯水重悬沉淀，所得沉淀即为RNA样品。
如图1所示：第3泳道为通过该方法纯化得到的RNA，具有3条完整的核糖体RNA条带(23S、16S、5S)，不含有基因组DNA。
实施例2：
本法与使用不同pH醋酸钠溶液酚抽提RNA结果的比较：
重复实施例1中a)至e)步骤；分别取e)步骤中的总核酸溶液50μL，相应加入50μLpH 3.13-7.20的50mmol/L醋酸钠溶液，50μL氯化钠溶液；重复g)至i)步骤，即得到RNA样品，其电泳检查结果如图1所示。
从图1中可以看出，当缓冲液pH值小于等于3.51时，纯化出来的样品仅包含部分RNA；当缓冲液pH大于等于4.21值时，纯化出核酸样品包含有基因组DNA；当缓冲液pH等于3.85时，即实施例1中公开的方法，纯化的样品包含完整的总RNA，且不含基因组DNA。
实施例3：
基因组DNA残留检测：
取实施例1中i)步中所得总RNA样品1微克，以及Trizol法和酚抽提法所得RNA样品，采用RNA酶处理后，采用基因组特异性引物扩增。根据与标准样品的域循环数的对比，标准样品为已知拷贝数的大肠杆菌基因组DNA，可见本法所得样品残留基因组DNA最少，约每微克104拷贝。采用Trizol法和酚抽提法所得样品残留基因组DNA分别约为每微克105拷贝和107拷贝，如图2所示。
实施例4：
RNA扩增能力检测：
取实施例1中i)步中所得总RNA样品，以及对相同质量菌体样品采用Trizol法和酚抽提法提取的RNA样品，分别经DNase I处理后，分别作为模板，使用AMV逆转录酶进行逆转录。逆转录所得cDNA作为模板进行实时定量PCR反应。所用引物为大肠杆菌pgi基因的特异性引物，其引物序列为pgiL：GCCGTTACTCTTTGTGGTC-3；pgiR：GCGGGTTATGGGTGATAG。根据与标准样品的域循环数的对比，标准样品为已知拷贝数的目的基因cDNA片段。可见本法和酚抽提法所提取的RNA扩增能力较强，而Trizol法所提取的RNA扩增能力较弱，说明Trizol法不适合提取细菌样品的RNA，结果如图3所示。
上述参照实施例对一种改良酚抽提总RNA的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种改良酚抽提总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；
b)加入与重悬液体积相同的裂解液，室温裂解3-5分钟，或65℃裂解0.5-1分钟；
c)加入与a)b)两步中溶液总体积相等的酚抽提液1，反复振荡混匀；12000r/min离心10-15分钟；吸取上清液；
d)向c)步骤所得上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，上下反复颠倒，待充分沉淀；12000r/min离心10分钟；弃上清；
e)向d)步骤所得的沉淀中加入洗涤液，洗涤1～2次，再用超纯水溶解沉淀，所得即为总核酸溶液。
f)取e)步骤中的总核酸溶液，加入与总核酸溶液等体积的酸性醋酸钠溶液，以及等体积的氯化钠溶液；
g)加入同f)步骤中溶液等体积的酚抽提液2，反复混匀之后，12000r/min离心5-10分钟；吸取上清液；
h)向g)步所得的上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；
i)加入洗涤液洗涤一次后，加入超纯水溶解沉淀，所得即为RNA样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述重悬液为超纯水；所述生物材料为细菌菌体，菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述裂解液为十二烷基硫酸钠溶液，其重量浓度为2±0.2％。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述酚抽提液1为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤e)中，所述洗涤液为75±5％乙醇溶液。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤f)中，所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液，其pH为3.85±0.10；其中，醋酸钠和醋酸的摩尔浓度均为50mmol/L。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤f)中，所述氯化钠溶液浓度为150±0.1mol/L。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤g)中，所述酚抽提液2为水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液。
9.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于，根据此方法提取得到的RNA中，不含有基因组DNA。
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