CN107475243A - 一种改良酚抽提总rna的方法 - Google Patents

一种改良酚抽提总rna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107475243A
CN107475243A CN201710714793.7A CN201710714793A CN107475243A CN 107475243 A CN107475243 A CN 107475243A CN 201710714793 A CN201710714793 A CN 201710714793A CN 107475243 A CN107475243 A CN 107475243A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
phenol
supernatant
add
volume
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710714793.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107475243B (zh
Inventor
徐蕾
孙璐
管国宇
程星怡
张孝普
石萌
黄钱武
吕俊
凌烈锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wannan Medical College
Original Assignee
Wannan Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wannan Medical College filed Critical Wannan Medical College
Priority to CN201710714793.7A priority Critical patent/CN107475243B/zh
Publication of CN107475243A publication Critical patent/CN107475243A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107475243B publication Critical patent/CN107475243B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种改良酚抽提总RNA的方法,通过裂解细菌菌体、经水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1抽提获得总核酸,再使用pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液与总核酸混合,最后通过水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为125:24:1抽提纯化出不含基因组DNA的总RNA。该方法的提取过程简单,无需使用DNA酶消化去除总核酸中的基因组DNA;提取得到的总RNA样品的纯度高,扩增能力较强。

Description

一种改良酚抽提总RNA的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种改良酚抽提总RNA的方法。
背景技术
随着分子生物学的不断发展,高质量RNA样品是很多实验的关键所在。而一些实验如逆转录PCR(RT-PCR)、基因芯片等,更需要高纯度高质量的RNA样品。稳定高效的RNA提取方法对于相关实验研究至关重要。
最为经典的抽提RNA的方法当属“酚抽提法”,然而,目前学术界对于酚抽提过程中pH值的定义并不明确,甚至有些错误的认识。《分子克隆实验指南》(第三版),J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著,科学出版社2002,第1587页提到所谓酚相的pH值,但实际上酚是一种有机溶剂,并非水溶液,所以酚相的pH值是没有意义的。
一种常用于抽提RNA的“酸性酚”,是使用固定pH值的酸性缓冲液(醋酸钠或者柠檬酸钠缓冲液)对水饱和酚进行反复的平衡,直至最终平衡之后的水相缓冲液pH值不再变化。这种“酸性酚”制备十分费时费力,而且在实际使用中,这种“酸性酚”对于去除RNA样品中基因组DNA的残留效果也并不稳定。
如何利用酚抽提方法,在合适的条件下精准地将DNA和RNA分离,成为了目前亟待解决的问题。
发明内容
基于以上背景,本发明提供了一种改良酚抽提总RNA的方法,通过裂解细菌菌体、第一次酚抽提获得总核酸,再使用pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液与总核酸混合,最后通过第二次酚抽提纯化出不含基因组DNA的总RNA。
本发明采取的技术方案为:
一种改良酚抽提总RNA的方法,包括如下步骤:
a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料;
b)加入与重悬液体积相同的裂解液,室温裂解3-5分钟,或65℃裂解0.5-1分钟;
c)加入与a)b)两步中溶液总体积相等的酚抽提液1,反复振荡混匀;12000r/min离心10-15分钟;吸取上清液;
d)向c)步骤所得上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇,上下反复颠倒,待充分沉淀;12000r/min离心10分钟;弃上清;
e)向d)步骤所得的沉淀中加入洗涤液,洗涤1~2次,再用超纯水溶解沉淀,所得即为总核酸溶液。
f)取e)步骤中的总核酸溶液,加入与总核酸溶液等体积的酸性醋酸钠溶液,以及等体积的氯化钠溶液;
g)加入同f)步骤中溶液等体积的酚抽提液2,反复混匀之后,12000r/min离心5-10分钟;吸取上清液;
h)向g)步所得的上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇,颠倒混匀,待沉淀完全后,12000r/min离心10分钟;弃上清;
i)加入洗涤液洗涤一次后,加入超纯水溶解沉淀,所得即为RNA样品。
步骤a)中,所述重悬液为超纯水;所述生物材料为细菌菌体,菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100μL,以避免菌体过多造成纯化困难和菌体过少导致产物得率下降。
步骤b)中,所述裂解液为十二烷基硫酸钠溶液,其重量浓度为2±0.2%。选用十二烷基硫酸钠溶液作为裂解液裂解较为简单,且优于其他一些裂解法,比如异硫氰酸胍+酚作为裂解液的裂解。
步骤c)中,所述酚抽提液1为水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液,此种比例是抽提总核酸的最佳比例,可避免在抽提过程中核酸的损失。
步骤e)中,所述洗涤液为75±5%乙醇溶液,选用75±5%乙醇溶液作为洗涤液既能有效洗涤去除盐分等杂质,同时又能避免样品在洗涤的过程中过多损失。
步骤f)中,所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液,其pH为3.85±0.10;其中,醋酸钠和醋酸的摩尔浓度均为50mmol/L,
步骤f)中,所述氯化钠溶液浓度为150±0.1mol/L,此浓度的氯化钠溶液一方面可以为总核酸溶液提供一定的离子强度,又有利于提高步骤h)中乙醇沉淀RNA的效率。
步骤g)中,所述酚抽提液2为水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液,此种比例最适合提取RNA,并能更有效吸附去除基因组DNA。
本发明公开的改良酚抽提总RNA的方法,采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂裂解生物材料,先利用第一次酚抽提法抽提样品的总核酸,总核酸中包含总RNA和基因组DNA,并去除生物材料的其他杂质。然后在总核酸中加入酸性醋酸钠溶液,创造酸性的水相环境,使部分核酸可被酚抽提液吸附。酚相所吸附的核酸分子量的大小与水相环境的pH值密切相关。当水相pH值较低时,大量核酸会分配到酚相当中。随着水相pH值的不断提高,分配到水相中的RNA不断增多。当水相pH值更高时,基因组DNA也会被抽提出来。
利用这一现象,本发明选择了pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液,在第二次酚抽提时将总RNA纯化出来,而将基因组DNA分配到酚相去除。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1.总RNA的提取过程简单,无需使用DNA酶消化去除总核酸中的基因组DNA;
2.提取得到的总RNA样品的纯度高,样品中残留基因组DNA较少;
3.根据本发明公开的方法提取得到的RNA的扩增能力较强。
附图说明
图1为实施例1和实施例2中的方法提取得到的RNA的电泳结果。M:DNA MarkerVII;泳道1-10,从左向右分别为所加醋酸钠pH值:3.13、3.51、3.85、4.21、4.56、4.83、5.36、5.73、6.35、7.20;泳道12,抽提RNA所用总核酸。
图2为实施例3中实时定量PCR检测本法提取RNA样品以及其他方法所得RNA样品中残留基因组DNA的含量。
图3为实施例4中实时定量PCR检测本法提取RNA样品以及其他方法所得RNA样品的扩增能力。
具体实施方式
实施例1
a)挑取平板划线培养大肠杆菌菌株DH5α单菌落,至100ml LB液体培养基,37度过夜振荡培养。离心收获菌液。1.5mL菌液离心所得菌体用100μL超纯水进行重悬,所述菌体的质量为20-50mg;
b)加入100μL重量浓度为2±0.2%的十二烷基硫酸钠溶液,充分混匀,室温裂解3分钟。
c)加入200μL酚抽提液1,所述酚抽提液1为水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液,反复振荡混匀;12000r/min离心10-15分钟;吸取上清液200μL;
d)将c)步骤所得上清液中加入400μL无水乙醇,轻柔地颠倒混匀,待沉淀完全后,12000r/min离心10分钟;弃上清;
e)将d)步骤所得RNA沉淀用75±5%乙醇溶液洗涤两次,加入100μL的超纯水溶解。所得即为总核酸溶液;
f)取e)步骤中的总核酸溶液50μL,加入50μL酸性醋酸钠溶液和50μL 150±0.1mol/L氯化钠溶液;所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液,其pH为3.85±0.10;
g)加入150μL酚抽提液2,所述酚抽提液2为水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液,反复混匀之后,12000r/min离心10分钟;吸取上清液140μL;
h)向g)步所得的上清液中加入280μL无水乙醇,轻柔地颠倒混匀,待沉淀完全后,12000r/min离心10分钟;弃上清;
i)加入75±5%乙醇溶液洗涤一次后,加入50μL超纯水重悬沉淀,所得沉淀即为RNA样品。
如图1所示:第3泳道为通过该方法纯化得到的RNA,具有3条完整的核糖体RNA条带(23S、16S、5S),不含有基因组DNA。
实施例2:
本法与使用不同pH醋酸钠溶液酚抽提RNA结果的比较:
重复实施例1中a)至e)步骤;分别取e)步骤中的总核酸溶液50μL,相应加入50μLpH 3.13-7.20的50mmol/L醋酸钠溶液,50μL氯化钠溶液;重复g)至i)步骤,即得到RNA样品,其电泳检查结果如图1所示。
从图1中可以看出,当缓冲液pH值小于等于3.51时,纯化出来的样品仅包含部分RNA;当缓冲液pH大于等于4.21值时,纯化出核酸样品包含有基因组DNA;当缓冲液pH等于3.85时,即实施例1中公开的方法,纯化的样品包含完整的总RNA,且不含基因组DNA。
实施例3:
基因组DNA残留检测:
取实施例1中i)步中所得总RNA样品1微克,以及Trizol法和酚抽提法所得RNA样品,采用RNA酶处理后,采用基因组特异性引物扩增。根据与标准样品的域循环数的对比,标准样品为已知拷贝数的大肠杆菌基因组DNA,可见本法所得样品残留基因组DNA最少,约每微克104拷贝。采用Trizol法和酚抽提法所得样品残留基因组DNA分别约为每微克105拷贝和107拷贝,如图2所示。
实施例4:
RNA扩增能力检测:
取实施例1中i)步中所得总RNA样品,以及对相同质量菌体样品采用Trizol法和酚抽提法提取的RNA样品,分别经DNase I处理后,分别作为模板,使用AMV逆转录酶进行逆转录。逆转录所得cDNA作为模板进行实时定量PCR反应。所用引物为大肠杆菌pgi基因的特异性引物,其引物序列为pgiL:GCCGTTACTCTTTGTGGTC-3;pgiR:GCGGGTTATGGGTGATAG。根据与标准样品的域循环数的对比,标准样品为已知拷贝数的目的基因cDNA片段。可见本法和酚抽提法所提取的RNA扩增能力较强,而Trizol法所提取的RNA扩增能力较弱,说明Trizol法不适合提取细菌样品的RNA,结果如图3所示。
上述参照实施例对一种改良酚抽提总RNA的方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种改良酚抽提总RNA的方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料;
b)加入与重悬液体积相同的裂解液,室温裂解3-5分钟,或65℃裂解0.5-1分钟;
c)加入与a)b)两步中溶液总体积相等的酚抽提液1,反复振荡混匀;12000r/min离心10-15分钟;吸取上清液;
d)向c)步骤所得上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇,上下反复颠倒,待充分沉淀;12000r/min离心10分钟;弃上清;
e)向d)步骤所得的沉淀中加入洗涤液,洗涤1~2次,再用超纯水溶解沉淀,所得即为总核酸溶液。
f)取e)步骤中的总核酸溶液,加入与总核酸溶液等体积的酸性醋酸钠溶液,以及等体积的氯化钠溶液;
g)加入同f)步骤中溶液等体积的酚抽提液2,反复混匀之后,12000r/min离心5-10分钟;吸取上清液;
h)向g)步所得的上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇,颠倒混匀,待沉淀完全后,12000r/min离心10分钟;弃上清;
i)加入洗涤液洗涤一次后,加入超纯水溶解沉淀,所得即为RNA样品。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤a)中,所述重悬液为超纯水;所述生物材料为细菌菌体,菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤b)中,所述裂解液为十二烷基硫酸钠溶液,其重量浓度为2±0.2%。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法,其特征在于,步骤c)中,所述酚抽提液1为水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1组成的混合液。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,其特征在于,步骤e)中,所述洗涤液为75±5%乙醇溶液。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法,其特征在于,步骤f)中,所述酸性醋酸钠溶液为醋酸钠和醋酸组成的混合溶液,其pH为3.85±0.10;其中,醋酸钠和醋酸的摩尔浓度均为50mmol/L。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法,其特征在于,步骤f)中,所述氯化钠溶液浓度为150±0.1mol/L。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法,其特征在于,步骤g)中,所述酚抽提液2为水饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为125:24:1组成的混合溶液。
9.根据权利要求1-7任意一项所述的方法,其特征在于,根据此方法提取得到的RNA中,不含有基因组DNA。
CN201710714793.7A 2017-08-19 2017-08-19 一种改良酚抽提总rna的方法 Active CN107475243B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710714793.7A CN107475243B (zh) 2017-08-19 2017-08-19 一种改良酚抽提总rna的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710714793.7A CN107475243B (zh) 2017-08-19 2017-08-19 一种改良酚抽提总rna的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107475243A true CN107475243A (zh) 2017-12-15
CN107475243B CN107475243B (zh) 2021-03-23

Family

ID=60601858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710714793.7A Active CN107475243B (zh) 2017-08-19 2017-08-19 一种改良酚抽提总rna的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107475243B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055360A (zh) * 2018-09-14 2018-12-21 皖南医学院 一种提取按蚊总rna的方法
CN110592075A (zh) * 2019-09-29 2019-12-20 北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂 一种快速高效提取酒醅rna的方法
CN114891782A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 四川农业大学 一种利用酚氯仿法纯化rna的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080057560A1 (en) * 2004-04-16 2008-03-06 Piotr Chomczynski Reagents for isolation of purified rna
CN101381764A (zh) * 2007-09-07 2009-03-11 长沙赢润生物技术有限公司 一种从生物组织样品中分离rna的试剂及其从生物组织样品中分离提取rna的方法
CN102286459A (zh) * 2011-06-02 2011-12-21 安徽师范大学 不含基因组dna的总rna制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080057560A1 (en) * 2004-04-16 2008-03-06 Piotr Chomczynski Reagents for isolation of purified rna
CN101381764A (zh) * 2007-09-07 2009-03-11 长沙赢润生物技术有限公司 一种从生物组织样品中分离rna的试剂及其从生物组织样品中分离提取rna的方法
CN102286459A (zh) * 2011-06-02 2011-12-21 安徽师范大学 不含基因组dna的总rna制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘君星等: "《分子生物学仪器与实验技术》", 30 June 2009 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055360A (zh) * 2018-09-14 2018-12-21 皖南医学院 一种提取按蚊总rna的方法
CN110592075A (zh) * 2019-09-29 2019-12-20 北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂 一种快速高效提取酒醅rna的方法
CN114891782A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 四川农业大学 一种利用酚氯仿法纯化rna的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107475243B (zh) 2021-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101974513B (zh) 一种土壤微生物基因组dna和总rna的提取方法
CN113388611B (zh) 磁珠法提取稳定型细菌基因组dna的试剂盒及其提取方法
CN113151397B (zh) 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒
CN102286463A (zh) 一种高效去除腐殖质的环境样品总dna提取方法
CN105567678B (zh) 细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法
WO2012155577A1 (zh) 从生物材料中分离纯化rna的方法
CN103820561B (zh) 一种柑橘黄龙病亚洲种巢氏pcr扩增检测体系及应用
CN103361339A (zh) 一种提取丝状真菌基因组dna的方法及试剂盒和遗传转化子的快速筛选方法
US20190225958A1 (en) Method for enrichment and purification of cell-free dna from body fluid for high-throughput processing
CN113388610B (zh) 一种磁珠法快速提取细菌质粒dna的试剂盒及提取方法
CN107475243A (zh) 一种改良酚抽提总rna的方法
CN116286794A (zh) 一种用于土壤中微生物基因组dna的提取试剂组合、提取试剂盒及提取方法
CN102851277B (zh) 一种简单快速的肉鸭粪样总dna提取方法
WO2015159979A1 (ja) 短鎖核酸の回収方法
CN102286459B (zh) 不含基因组dna的总rna制备方法
CN104328110A (zh) 基于磁珠法提取土壤微生物dna的试剂盒及方法
CN104480103B (zh) 一种土壤微生物基因组的提取方法
KR101760726B1 (ko) 미생물 탈리 및 페놀-클로로포름을 이용한 동물성 식품으로부터 메타게놈 dna의 분리방법
CN115197997A (zh) 一种应用于植物花粉的CUT&Tag方法
CN104313014A (zh) 一种快速提取杉木总rna的方法
CN103966201A (zh) 基于样品高效保鲜的提取水生植物dna的方法
CN114292841B (zh) 核酸提取试剂和核酸提取方法
Chattopadhyay et al. Purification of quality DNA from citrus plant using iron oxide nanoparticle as solid based support
CN102936592A (zh) 一种快速高效玉米线粒体dna的提取及纯化方法
CN103194440A (zh) 一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant