CN103361339A

CN103361339A - 一种提取丝状真菌基因组dna的方法及试剂盒和遗传转化子的快速筛选方法

Info

Publication number: CN103361339A
Application number: CN2013103269246A
Authority: CN
Inventors: 潘力; 周斌; 何攀; 吕扬勇
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-07-30
Also published as: CN103361339B

Abstract

本发明公开了一种提取丝状真菌基因组DNA的方法及试剂盒和遗传转化子的快速筛选方法，该试剂盒包括电动研磨器、溶液A(裂解液)、溶液B（DNA结合液）、溶液C（DNA洗涤液）、溶液D（DNA洗脱液）和DNA吸附柱。该发明的丝状真菌基因组DNA提取方法，耗时短（30min以内），提取的基因组质量高，不会用到有毒的试剂苯酚、氯仿，能很好的满足后续的实验。本发明快速筛选丝状真菌遗传转化子的方法克服了传统转化子筛选方法耗时、耗力、筛选效率低等缺点，特别适合大规模筛选遗传转化子。

Description

一种提取丝状真菌基因组DNA的方法及试剂盒和遗传转化子的快速筛选方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种丝状真菌DNA提取试剂盒及提取方法和一种丝状真菌遗传转化子快速筛选方法。

背景技术

丝状真菌广泛存在于自然界中,在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用，多年来一直被广泛地研究。随着分子技术的发展，丝状真菌的遗传转化在理论上和应用上均取得了较大的进展（闫培生等，1999）。当前丝状真菌转化体系遇到的主要问题是如何高通量筛选遗传转化子。普通的菌落PCR不能适用于细胞壁结构复杂的丝状真菌（潘力等，2009）。虽然潘力等在丝状真菌菌落PCR有一些改良方法运用，但在实践中发现该方法还是存在一些缺陷，例如挑取的菌丝菌龄较老和挑取的菌丝量过多时，假阴性现象严重；如果挑取的菌丝污染了培养基，则出现假阳性现象。因此基因组DNA快速提取对转化子验证是一个急需解决的问题。目前提取基因组DNA最常用的方法是CTAB法（Walker WH等,1991）和SDS法，但是这些方法均需要液氮研磨，操作繁琐且耗时长，而苯酚和氯仿的使用可能导致有机溶剂残留在基因组样品中从而造成下游试验无法顺利进行，这些因素严重影响了实验进度。虽然市场上也有一些提取基因组的试剂盒，可以提取到高质量基因组DNA，但成本较高、操作同样复杂，耗时长（至少1个小时），有的公司开发的试剂盒同样会用到苯酚和氯仿试剂，这也不利于我们大规模筛选转化子。

传统的丝状真菌遗传转化子筛选方法是：将转化平板上的转化子挑选到筛选平板上，然后收集孢子，液体摇瓶培养，收集菌丝，液氮研磨，提取基因组验证。整个过程耗时耗力，而且筛选效率低。基于本发明的试剂盒开发的一种丝状真菌遗传转化子快速筛选方法，省时省力。本发明方法只需将转化平板上的转化子挑选到筛选平板上，然后直接从平板上挑取少量菌丝，试剂盒提取基因组进行转化子的进一步验证。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种从丝状真菌中快速提取基因组的方法及试剂盒，从而解决了传统丝状真菌基因组DNA提取方法中耗时长、使用有毒的有机试剂、杂质多等问题。

本发明的目的之二是提供一种丝状真菌遗传转化子快速筛选的方法，从而解决了传统丝状真菌转化子筛选方法费时费力、筛选效率低等问题。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种丝状真菌DNA提取试剂盒，包括电动研磨器、溶液A(裂解液)、溶液B（DNA结合液）、溶液C（DNA洗涤液）、溶液D（DNA洗脱液）和DNA吸附柱；其中，

溶液A：10-50mM Tris-HCl，10-50mM EDTA-2Na，1%-10%w/v SDS，2-4MNaCl，0.5%-2%v/v的β-巯基乙醇，pH8.0；

溶液B：2.5-6M的盐酸胍或异硫氰酸胍，20%-50%v/v异丙醇或无水乙醇，5mM-20mM EDTA-2Na，pH4.5-6.5；

溶液C：70%-80%v/v的无水乙醇，pH4.5-6.5；

溶液D：5-50μg/mL的RNA酶水溶液，用1M NaOH溶液将pH调到≤8.5的碱性。

上述试剂盒的优选配方如下：

溶液A：50mM Tris-HCl、50mM EDTA-2Na、3%SDS、2MNaCl、1%的β-巯基乙醇，pH8.0；

溶液B：4M的盐酸胍、20%异丙醇、10mM EDTA-2Na、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；

溶液C：70%的无水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；

溶液D：20μg/mL的RNA酶水溶液，用1M NaOH溶液将pH调到8.0。

所述电动研磨器的转速1500-9000rpm，并配有70mm的锥形研磨杵。

所述电动研磨器的转速为1800rpm。

所述DNA吸附柱为硅胶柱。

利用上述试剂盒提取丝状真菌DNA的方法，包含以下步骤：

（1）将70μL-100μL的溶液A和0.1mg-100mg菌体混合；开动电动研磨器研磨菌体1-2min；向研磨好的菌丝中加入溶液A使样品终体积为150μL；

（2）漩涡振荡器震荡30s，使菌体尽量分散；转速10000g-12000g，离心5min；取上清100μL至离心管中，加入300μL-600μL的溶液B，上下颠倒混匀；

（3）将步骤（2）的混合液加入吸附柱中，转速10000g-12000g，离心1min；弃收集管中的液体，向吸附柱中加入300μL-600μL的溶液B，转速10000g-12000g，离心1min；

（4）弃上述收集管中的液体，向吸附柱中加入500μL-700μL的溶液C，转速10000g-12000g，离心1min；

（5）重复步骤（4）一次；然后弃收集管中的液体，10000g-12000g，离心2-5min；将吸附柱转移到新离心管中，加入30-50μL的溶液D，37℃放置5min；最后，10000g-12000g，离心1-2min；即得到提取的基因组DNA溶液。

一种丝状真菌遗传转化子的快速筛选方法，包括如下步骤：

（1）将丝状真菌转化平板中长出的转化子，挑到筛选平板上；

（2）待转化子在筛选平板上培养到菌丝量在0.1mg以上时，采用上述方法提取基因组；

（3）设计特异性引物，PCR扩增、检测，得到遗传转化子。

所述转化平板为0.3%氮源，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%碳源，0.8M NaCl，0.1ug/ml筛选用抗性药物，15mM CsCl，pH5.5。

所述筛选用培养基为0.3%氮源，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%碳源，0.1ug/ml筛选用抗性药物，pH5.5。

上述培养基所用的氮源包括硝酸钠、亚硝酸钠、尿素、硫酸铵；碳源包括葡萄糖、淀粉、麦芽糖、蔗糖；筛选用抗性药物包括吡啶硫胺素、潮霉素、五氟乳清酸、乙酰胺。

本发明的主要原理：研磨器在高速条件下产生的剪切力不仅能将丝状真菌的细胞壁破碎，同时研磨杵与离心管壁的摩擦作用而产生较高的温度（50℃-70℃），有利于SDS裂解细胞。在研磨器、高温和SDS的相互作用下，丝状真菌的基因组DNA释放出来。在2MNaCl溶液中DNA的溶解度最大。EDTA是金属螯合剂能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。DNA结合液提供一个高盐低pH值的环境，在这种条件下，DNA可以与硅胶柱可逆结合。洗涤液是70%乙醇可以对硅胶柱脱盐。DNA在pH≤8.5的碱性低盐溶液中，具有最大洗脱效率。洗脱液是含有RNA酶的碱性水溶液，能将硅胶柱上DNA洗脱下来。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

（1）本发明的试剂盒不但不使用苯酚、氯仿等有机试剂，而且提取基因组耗时短，整个提取过程在30分钟以内完成。

（2）利用上述试剂盒的丝状真菌遗传转化子快速筛选方法，只需将转化平板上的转化子挑选到筛选平板上，然后直接从平板上挑取少量菌丝，试剂盒提取基因组进行转化子的验证，省时省力。

附图说明

图1为米曲霉的转化平板长出的转化子示意图，图中用方框标示的是转化子；

图2为使用该试剂盒提取米曲霉基因组电泳图；

图3为米曲霉敲除ku70基因的PCR检测原理示意图；

图4为米曲霉敲除ku70基因的PCR检测电泳图。

具体实施方式

以下实例是对本发明的进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

米曲霉基因组提取试剂盒，按以下配方制作：

电动研磨器：转速1800rpm、配有一次性70mm的塑料锥形研磨杵；

溶液A：50mM Tris-HCl、50mM EDTA-2Na、3%SDS、2M NaCl、1%的β-巯基乙醇，pH8.0；

溶液C：70%的无水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；

溶液D:20μg/mL的RNA酶水溶液，用1M NaOH溶液将PH调到8.0。

DNA吸附柱：硅胶柱。

其中，电动研磨器购自天根生化科技（北京）有限公司。

实施例2

利用实施例1的试剂盒提取米曲霉基因组的方法，步骤如下：

（1）取1.5mL的锥底离心管，加入100μL的溶液A；

（2）向（1）的离心管中加入0.1mg的米曲霉（Aspergillus oryzae niaD300,购自日本NRIB研究所）菌体；

（3）用电动研磨器研磨菌体2min；

（4）向研磨好的菌丝中加入溶液A使终体积在150μL左右；

（5）在漩涡振荡器震荡30s，使菌体尽量分散；

（6）离心机转速12000g，离心5min；

（7）小心取上清100μL至一新的1.5mL离心管中，加入300μL的溶液B，上下颠倒混匀；

（8）将（7）的混合液加入吸附柱中，12000g，离心1min；

（9）倒掉收集管中的液体，向吸附柱中加入500μL的溶液B，12000g，离心1min；

（10）倒掉收集管中的液体，向吸附柱中加入700μL的溶液C，12000g，离心1min；

（11）重复（10）；

（12）倒掉收集管中的液体，12000g，离心3min；

（13）将（12）的吸附柱加入一新的1.5mL离心管中，加入30-50μL的溶液D，37℃放置5min；

（14）12000g，离心2min；

（15）-20℃保存提取的米曲霉基因组DNA溶液。

实施例3

米曲霉遗传转化子的快速筛选方法，步骤如下：

1、将米曲霉（Aspergillus oryzae niaD300,购自日本NRIB研究所）转化平板（0.3%亚硝酸钠，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%葡萄糖，0.8M NaCl，0.1μg/mL的吡啶硫胺素（PT），15mMCsCl，pH5.5）中长出的转化子，如图1所示，用无菌牙签挑到筛选平板上（0.3%亚硝酸钠，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%葡萄糖，0.1μg/mL的吡啶硫胺素（PT），pH5.5）；

2、待转化子在筛选平板上培养到菌丝量0.1mg时，用牙签将转化子的菌丝，挑到1.5mL的离心管中并采用实施例2中的方法提取基因组，如图2所示，并测浓度。

3、设计两对扩增引物对米曲霉敲除基因ku70的遗传转化子进行PCR检测，采用两对引物:引物1,SEQ ID.1和SEQ ID.2;引物2,SEQ ID.1和SEQ ID.3，检测原理如图3所示，引物1：定位染色体未被敲除ku70基因上游，5’端引物在同源臂上游500bp，3’端引物在ku70的CDS基因中。引物2：定位染色体被敲除ku70基因上游，5’端引物在同源臂上游500bp，3’端引物在同源替换ku70基因的抗性基因中。

PCR扩增用的DreamTaq Green PCR Master Mix购自Thermo Scientific公司。

PCR扩增体系：

PCR扩增程序

4、对扩增的PCR产物进行琼脂糖电泳检测，如图4所示。在图4中，检测了24个遗传转化子，得到了一株转化子是米曲霉ku70基因被完全替换的菌株。图4中的1、2分别代表引物1和引物2；M代表250bp的marker。引物1和引物2结合起来筛选转化子，虚线方框是代表敲除ku70基因的转化子。

Claims

1.一种丝状真菌DNA提取试剂盒，其特征在于，包括电动研磨器、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D和DNA吸附柱；其中，

溶液C：70%-80%v/v的无水乙醇，pH4.5-6.5；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

溶液C：70%的无水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；

溶液D：20μg/mL的RNA酶水溶液，用1M NaOH溶液将pH调到8.0。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述电动研磨器的转速1500-9000rpm，并配有70mm的锥形研磨杵。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述电动研磨器的转速为1800rpm。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA吸附柱为硅胶柱。

6.利用权利要求1～5任意一项所述试剂盒提取丝状真菌DNA的方法，其特征在于，包含以下步骤：

（2）在漩涡振荡器上震荡30s，使菌体尽量分散；转速10000g-12000g，离心5min；取上清100μL至离心管中，加入300μL-600μL的溶液B，上下颠倒混匀；

（3）将步骤（2）的混合液加入吸附柱，转速10000g-12000g，离心1min；弃收集管中的液体，向吸附柱中加入300μL-600μL的溶液B，转速10000g-12000g，离心1min；

（5）重复步骤（4）一次；弃收集管中的液体，10000g-12000g，离心2-5min；将吸附柱转移到新离心管中，加入30-50μL的溶液D，37℃放置5min；最后，10000g-12000g，离心1-2min；即得到提取的基因组DNA溶液。

7.一种丝状真菌遗传转化子的快速筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）待转化子在筛选平板上培养到菌丝量在0.1mg以上时，采用权利要求6中的方法提取基因组；

（3）设计特异性引物，PCR扩增、检测，得到遗传转化子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转化用培养基为0.3%氮源，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%碳源，0.8M NaCl，0.1ug/ml筛选用抗性药物，15mM CsCl，pH5.5。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述筛选用培养基为0.3%氮源，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%碳源，0.1ug/ml筛选用抗性药物，pH5.5。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述氮源包括硝酸钠、亚硝酸钠、尿素、硫酸铵；所述碳源包括葡萄糖、淀粉、麦芽糖、蔗糖；所述筛选用抗性药物包括吡啶硫胺素、潮霉素、五氟乳清酸、乙酰胺。