CN102796694B - 高效降解两种真菌毒素的工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效降解两种真菌毒素的工程菌及应用。在本发明所述的工程菌中导入了脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）两种真菌毒素的高效降解酶的编码基因，得到具有高效降解DON和ZEN两种毒素能力的工程菌。该工程菌可直接有效地应用于真菌毒素的削减。

Description

高效降解两种真菌毒素的工程菌及应用

技术领域

本发明属于发酵及生物技术领域，具体涉及两种真菌毒素高效降解工程菌的构建及其应用。

背景技术

真菌毒素是产毒真菌在危害过程中产生的一类次生代谢物质，主要包括黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏马毒素（FUM）和赭曲霉毒素等，近几年，由于我国极端气候的频繁出现，导致了以危害小麦、玉米为主的赤霉病的大流行，该菌危害产生的DON和ZEN污染加重，污染超标的小麦和玉米不断增加，为保障我国的人民消费安全和畜牧养殖安全，国家粮食局及有关部门对2010年我国黄淮海地区小麦收获季节感染严重的赤霉病，导致脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）大面积超标毒素超标小麦及时进行了封存，共计174.5万吨。由于缺乏行之有效的安全处理技术，目前仍处于封存状态。2012年的赤霉病导致的小麦产量减产和毒素超标减产也极为严峻。

对于真菌毒素（DON和ZEN）的清除，目前国内外较为普遍的方法主要有物理去除及吸附、化学处理等。对已经污染真菌毒素谷物的物理、化学处理方法主要有：冲洗和漂洗、热处理、离子辐射、无机吸附、化学试剂的处理及臭氧氧化等，Bullerman等认为通过清洗，可以将被污染的小麦和大麦中DON降低5.5%～19%，但实际上毒素是通过浸洗过程溶解于浸液或转移到其他副产品中，并不会真正被破坏。当前的吸附剂对于这两种真菌毒素基本没有效果，而且无机吸附剂还大量吸附了饲料和食品中的微量营养物质，被黏土吸附后的DON，无法被分解，会引起二次污染。

生物降解不仅可以高效将毒素转化为无毒产物、环保安全，而且生物酶催化方法专一性强、转化效率高。已经成为当前真菌毒素削减技术中最有发展前景的处理技术途径，其不仅安全、环保、高效，而且利用现代生物技术开展研究非常符合当前我国节能减排的发展趋势。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种高效降解DON和ZEN两种真菌毒素的工程菌。具体地，利用外源基因重组表达技术获得可同时降解两种毒素的工程菌，该工程菌可直接有效地应用于真菌毒素的削减.。

本发明要解决的第二个技术问题是提供高效降解DON和ZEN两种真菌毒素的工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

本发明提供一种高效降解两种真菌毒素的工程菌，是将脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因和玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因导入宿主菌中，得到可降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的工程菌。

所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因和玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因可以采用现有技术中已经公开的降解酶编码基因。进一步地，本发明提供了一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因和玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因，其中，所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因如序列表中SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQID NO：2所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如序列表中SEQ ID NO：3所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

进一步地，所述宿主菌为酵母菌、芽孢杆菌或乳杆菌。更优选地，所述酵母菌为毕赤酵母或酿酒酵母；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌；所述乳杆菌为嗜热乳杆菌。

本发明所述工程菌可以采用现有技术中已知的构建方法，包括但不限于：

1、通过PCR方法分别扩增获得玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因，分别插入到表达载体pPIC9K上，将含有两种降解酶基因的混合载体通过电击转化毕赤酵母，得到同时表达玉米赤霉烯酮降解酶和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的毕赤酵母基因工程菌，该工程菌具有同时降解ZEN和DON两种真菌毒素的能力。

2、通过PCR的方法，以在毕赤酵母中外分泌重组表达载体DNA为模板，扩增获得具有外分泌功能的α交配因子核酸序列，通过双酶切将该核酸片段插入到酿酒酵母表达载体pYES2上，随后通过PCR方法分别扩增获得玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因，分别插入到上述新构建的含α交配因子核酸序列的酿酒酵母表达载体pYES2上；然后通过电击转化含有两种降解酶基因的混合载体，得到同时表达玉米赤霉烯酮降解酶和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的酿酒酵母工程菌，该工程菌具有表达并外分泌玉米赤霉烯酮降解酶和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的能力。

3、通过PCR扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因，分别连接入pHT315载体上，获得相应的重组表达载体，经电击转化芽孢杆菌或乳杆菌，获得含有玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的工程菌。

本发明还保护工程菌在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮中的应用。

本发明的有益效果：现有真菌毒素削减技术仅限于在被真菌毒素污染的原料中添加粘土、高岭土等物理吸附剂，也仅对黄曲霉毒素有一定的吸附效果，而对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等几乎没有吸附效果，而且由于缺乏专一性而吸附了大量营养成分。目前为止，国内外还没有可高效、绿色和规模化降解这两种真菌毒素的处理技术。本发明的工程菌为开发绿色环保、高效，可保障产品的真菌毒素大幅削减的工艺和技术提供了优良的微生物菌株。

附图说明

图1为DON降解酶基因PCR产物电泳图谱，M：Marker；1-6：DON降解酶基因PCR产物；

图2为ZEN降解酶基因PCR产物电泳图谱，M：Marker；1-5：ZEN降解酶基因PCR产物；

图3为外分泌重组质粒SCWES2的物理图谱；

图4为外分泌重组载体SCWES2双酶切验证图谱，M：Marker;B:Blank;1：SCW基因PCR片段；2：载体pYES2双酶切片段；3：外分泌重组表达载体SCWES2双酶切片段

图5为DON降解酶基因重组表达载体的物理图谱；

图6为DONase基因外分泌重组表达载体SCWTES2双酶切鉴定图，M：Marker;1：DONase基因PCR片段；2：重组载体SCWTES2双酶切片段；3：重组外分泌表达载体SCWES2双酶切片段；

图7为ZEN降解酶基因重组表达载体的物理图谱；

图8为ZDase基因外分泌重组表达载体SCWTES2双酶切鉴定图，M：Marker;1：重组外分泌载体SCWES2双酶切片段；2：重组表达载体SCWZES2双酶切片段；3：ZDase基因PCR片段；

图9为酿酒酵母转化子的DON\ZEN降解酶基因的PCR鉴定电泳图谱，M：Marker；B:Blank;1-4：酿酒酵母转化子DON\ZEN降解酶基因PCR产物；

图10为酿酒酵母工程菌表达DON降解酶和ZEN降解酶SDS-PAGE电泳图谱，M：Marker；B：Blank；1,2：酿酒酵母转化子SCWZT；

图11为受体菌株INVSc1在发酵时期对ZEN、DON两种毒素的降解能力曲线；

图12为酿酒酵母重组菌株在发酵时期对ZEN、DON两种毒素的降解能力曲线。

具体实施例方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：真菌毒素DON降解酶基因DONase的克隆

脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因质粒文库的建立

(1)将标准菌株尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）ACCC No.36245（购自中国农业微生物菌种保藏管理中心）活化后接入PDA液体培养基（马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，PH自然），然后将菌株的悬浮液接入100ml同样的培养基，摇床条件为220转/分钟，30℃，72小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。提取RNA（Trizol法）；

(2)以RNA为模板逆转录合成cDNA序列；

2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的获得

以步骤1中获得的cDNA序列为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，扩增脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的序列。

上游引物P1：5'GGAATTCCATATGACTGCACTAAACGTTACAAAC3'（划线部分碱基为Nde I识别位点）

上游引物P2：5'CCCAAGCTTCTAGCCAATGAATTGCCCATAC3′（划线部分碱基为HindⅢ识别位点）

在PCR反应中，PCR反应条件为：94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持1分钟，降温至54℃，保持1分钟，升温至68℃，保持2分钟；然后于68℃，保持10分钟，最后于4℃保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约1.4kb的单一带（见图1），扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接pMD19-TVector转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒pMD19-Dasag测序鉴定。则该脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO：1，其对应的氨基酸序列为序列表SEQ IDNO：2。

实施例2：真菌毒素ZEN降解酶基因ZDase的克隆

以标准菌株粉红粘帚霉ACCCNo.31535基因组DNA为模板进行PCR扩增。设计如下引物，分别引入EcoRI和NotI识别位点（用下划线标出）

上游引物P3：5'-CCG GAA TTC ATG CGC ACT CGC AGC ACAAT-3'

下游引物P4：5'-ATAAGAAT GCG GCC G CAAGA TAC TTC TGC GTAAAT T-3'

PCR反应在50μLPCR反应混合液中含有25μL KOD酶Mix，12.5μmoL/L引物各2μL，模板10μL，加无菌水11μL调整至50μL.条件为94℃，变性5min，循环参数：94℃变性40s；54℃退火1min；68℃延伸1min；30个循环；68℃延伸10min使产物延伸完全。将得到PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2，得到一条约0.8kb条带，其大小与预期相当，具体方法参见中国专利公开号CN102199581A“一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶及其编码基因与应用”。经测序，该玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO：3，其对应的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：4。

实施例3：重组表达载体的构建及验证

1.具有外分泌能力的重组表达载体的构建及验证

根据已报道的毕赤酵母外分泌表达载体上编码外分泌蛋白α交配因子编码基因的序列（SCW基因序列的GenBank Accession No.HQ398363.1）设计如下引物，分别引入BamHI和XbaI识别位点（用下划线标出）

上游引物P5：5'-CGCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATTTT-3'

下游引物P6：5'-GCTCTAGATTAATTCGCGGCCGCCCTAG-3′.

用毕赤酵母表达载体pPIC9k（购自Invitrogen公司）的质粒DNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应，在50μLPCR反应混合液中含有25μL KOD酶Mix，12.5μmoL/L引物各2μL，模板10μL，加无菌水11μL调整至50μL.条件为94℃，变性5min，循环参数：94℃变性40s；50℃退火1min；68℃延伸1min；30个循环；68℃延伸10min使产物延伸完全。将得到PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，得到一条约300bp的，其大小与预期相当。该SCW基因序列为序列表SEQ ID NO：5，其对应的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：6。

回收经BamHI和XbaI双酶切的SCW基因PCR片段，插入至pYES2载体上，构建了重组质粒SCWES2，物理图谱见图3。并利用BamHI和XbaI双酶切，得到5.9kb和0.3kb的两条片段，结果如图4。以P5，P6为引物，重组质粒SCWES2为模板扩增SCW基因，得到一条0.3kb的条带，验证结果表明SCWES2结构正确。

2.DON降解酶基因DONase外分泌重组表达载体SCWTES2的构建及验证

回收经EcoRI和NotI双酶切的DONase基因的PCR片段，插入至重组外分泌表达载体SCWES2，后经大肠杆菌转化，质粒提取，得到ZEN降解酶DONase基因外分泌表达重组质粒，其物理图谱见图5。

经EcoRI和NotI双酶切，得到约为6.2kb和1.3kb的两条片段，并分别与DONase基因PCR片段和载体SCWES2双酶切片段大小一致，酶切验证结果正确，结果如图6。1为DONase基因PCR片段；2为重组载体SCWTES2双酶切片段；3为重组外分泌表达载体SCWES2双酶切片段。

3.ZEN降解酶基因ZDase外分泌重组表达载体SCWZES2的构建及验证

回收经EcoRI和NotI双酶切的ZDase基因的PCR片段，插入至重组外分泌表达载体SCWES2，后经大肠杆菌转化，质粒提取，得到ZEN降解酶ZDase基因外分泌表达重组质粒，其物理图谱见图7。

经EcoRI和NotI双酶切，得到约为6.2kb和0.8kb的两条片段，并分别与ZDase基因PCR片段和载体SCWES2双酶切片段大小一致，酶切验证结果正确，结果如图8。1为重组外分泌载体SCWES2双酶切片段，2为重组表达载体SCWZES2双酶切片段，3为ZDase基因PCR片段。

实施例4：酿酒酵母基因工程菌的构建及诱导表达

1.酿酒酵母基因工程菌SCWZT的构建

（1）酿酒酵母感受态的制备

挑一环酵母菌INVSc1接种于5mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；

取1mL  一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100mM LiAc，10mM DTT，0.6M山梨醇，10mMTris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次；每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。

（2）电激转化酿酒酵母

向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的重组表达载体SCWTES2和SCWZES2，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；

立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

离心，弃上清，加入1mLYEPD后，于30℃、200rpm培养2h；

离心得菌体后，吸除550ul上清液，然后按150ul/板进行涂板。然后在30℃培养48小时后挑取若干单克隆接种于试管中，进行液体培养，利用扩增ZEN、DON降解酶基因的2对引物，进行PCR筛选阳性转化子。

（3）转化子的PCR验证

以酿酒酵母转化子SCWZT基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应以P1、P2和P3、P4为引物，在25μLPCR反应混合液中含有12.5μL taq酶Mix，12.5μmoL/L引物各0.5μL，模板1μL，加无菌水调整至25μL.条件为94℃，变性5min，循环参数：94℃变性40s；52℃退火1.5min；72℃延伸1min；30个循环；72℃延伸10min使产物延伸完全。将得到PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图9，得到分别为0.8kb和1.3kb的两条片段，大小与预期相当，经测序验证，酿酒酵母基因工程菌SCWZT构建成功。

2.酿酒酵母基因工程菌SCWZT的诱导表达

基因工程菌SCWZT的诱导表达参照Invitrogen使用说明书。取经过处理的发酵液，SDS-PAGE电泳检测，结果表明诱导表达得到大小分别约为30kDa和50kDa的两条片段，如图10，证明酿酒酵母基因工程菌SCWZT构建正确。

实施例5：酿酒酵母工程菌菌种的传代培养

把含有两种重组质粒的酵母菌株在YPD固体培养基中连续接种培养，计算不能在SC-U平板上生长的克隆数，以此判断质粒的稳定性。结果表明，质粒在酿酒酵母中连续表达150h，仍具有良好的稳定性。

表1质粒稳定性分析

实施例6：基因工程菌对DON\ZEN的发酵降解能力的实验

1、重组蛋白表达的诱导参照Invitrogen使用说明书；

2、诱导表达培养基中DON\ZEN终浓度为100μg/ml，每12h取样；

3、液相检测条件：

DON：流动相：水/甲醇=80/20(V/V),紫外检测器218nm，柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量，进样量5μL。

ZEN：流动相：水/乙腈=50/50(V/V)，荧光检测器检测Ex=274nm Em=440nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL。

实验结果见图11和图12。从图上可以看出，与不含有玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的酿酒酵母发酵结果相比，工程菌在发酵过程中对玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇两种毒素的降解迅速，在发酵的24h到36h的时候基本可将两种毒素完全降解。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110>  国家粮食局科学研究院

<120>  高效降解两种真菌毒素的工程菌及应用

<130> 

<160>  12   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1365

<212>  DNA

<213>  脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶

 

<400>  1

atgactgcac taaacgttac aaacatgagc gacctagaca tagaactaga cgtcatcggc     60

caacagcctt tcatggtcaa gatctatacc ctgatcagct tctgcttccc cgtcaccgac    120

cccaccacgc acccagccat caccgccacc atcaaaaacg gcctacaacg cctctcgcag    180

aacttcccct gggtagctgg ccaagtcaaa aacgatggca ctggcgtatt caagatcagg    240

ccgctcgaga agacaccgcc cctggtagtt aaggatctcc gagatgaccc gtcagcaccg    300

acaatggagg gtctgagaaa ggcagagttc cccatgagca tgtttgacga gaacaaaatt    360

gcaccaaaaa aaactttgcc atttggccct ggttactcac ccgatgatcc ttcgcctgtg    420

ctgatgtttc agctcaattt tattgagggc gggctcatat tcactgtcaa cggacaacat    480

ggttgcatgg acatgacggg tcaggatgag ctcattcgac tactctcgaa ggcgtgtcgc    540

ggcgaagatt tctcagaaga agagatatca acaatgaacc ttgaccgcaa gaccattgtt    600

ccgctgctcg aaaattacga actcgggcct gagttggatc atcaaatcat caagccccca    660

ccaactactg aggccccacc aacaccgcca aaagcaagct gggctttctt ctcattcagt    720

ccgcaagccc tatctgagct caaagacaag gcgacgcaga gtcttgacgg acaaacaaaa    780

ttcatctcaa cagatgatgc cctctcggcg tttatctggc aatccgtcag ccgcgcccgt    840

ctcccccgtt tggatgattc cacctcgact caattctgtc gtgccgtcga tgtacgcccc    900

cacctcaacg tgccaaagaa ctacccagga atcctccaaa acatgaccta cagcgtctca    960

aacctatctc aaatcgccaa cgagcccctc ggcatcgtag catctcgctt gcggtctcaa   1020

ctcggccgcg acgatctccg ccggcggacc caagccatgg tgacgtatct gcaagaccaa   1080

acgaacaggg cgaatgtatc tgttacggcg gatgcgaatc cgtcgacaga tattatgttg   1140

agttcgtggg cgaagctgag ttgttgggag tatgactttg ggcttggatt gggaaatcct   1200

gagagtgtga ggaggccgtt gttcgaaccg tttgagagtt tgatgtatct catgcccaag   1260

agaccagacg gagaaataac cgcagcgata tcattgaggg atgaggatat ggagagatta   1320

aagagtgatg aggagtggaa aaagtatggg caattcattg gctag                   1365

 

<210>  2

<211>  454

<212>  PRT

<213>  脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶

<400>  2

 

Met Thr Ala Leu Asn Val Thr Asn Met Ser Asp Leu Asp Ile Glu Leu

1               5                   10                  15     

Asp Val Ile Gly Gln Gln Pro Phe Met Val Lys Ile Tyr Thr Leu Ile

            20                  25                  30         

Ser Phe Cys Phe Pro Val Thr Asp Pro Thr Thr His Pro Ala Ile Thr

        35                  40                  45             

Ala Thr Ile Lys Asn Gly Leu Gln Arg Leu Ser Gln Asn Phe Pro Trp

    50                  55                  60                 

Val Ala Gly Gln Val Lys Asn Asp Gly Thr Gly Val Phe Lys Ile Arg

65                  70                  75                  80 

Pro Leu Glu Lys Thr Pro Pro Leu Val Val Lys Asp Leu Arg Asp Asp

                85                  90                  95     

Pro Ser Ala Pro Thr Met Glu Gly Leu Arg Lys Ala Glu Phe Pro Met

            100                 105                 110        

Ser Met Phe Asp Glu Asn Lys Ile Ala Pro Lys Lys Thr Leu Pro Phe

        115                 120                 125            

Gly Pro Gly Tyr Ser Pro Asp Asp Pro Ser Pro Val Leu Met Phe Gln

    130                 135                 140                

Leu Asn Phe Ile Glu Gly Gly Leu Ile Phe Thr Val Asn Gly Gln His

145                 150                 155                 160

Gly Cys Met Asp Met Thr Gly Gln Asp Glu Leu Ile Arg Leu Leu Ser

                165                 170                 175     

Lys Ala Cys Arg Gly Glu Asp Phe Ser Glu Glu Glu Ile Ser Thr Met

            180                 185                 190        

Asn Leu Asp Arg Lys Thr Ile Val Pro Leu Leu Glu Asn Tyr Glu Leu

        195                 200                 205             

Gly Pro Glu Leu Asp His Gln Ile Ile Lys Pro Pro Pro Thr Thr Glu

    210                 215                 220                

Ala Pro Pro Thr Pro Pro Lys Ala Ser Trp Ala Phe Phe Ser Phe Ser

225                 230                 235                 240

Pro Gln Ala Leu Ser Glu Leu Lys Asp Lys Ala Thr Gln Ser Leu Asp

                245                 250                 255    

Gly Gln Thr Lys Phe Ile Ser Thr Asp Asp Ala Leu Ser Ala Phe Ile

            260                 265                 270        

Trp Gln Ser Val Ser Arg Ala Arg Leu Pro Arg Leu Asp Asp Ser Thr

        275                 280                 285            

Ser Thr Gln Phe Cys Arg Ala Val Asp Val Arg Pro His Leu Asn Val

    290                 295                 300                

Pro Lys Asn Tyr Pro Gly Ile Leu Gln Asn Met Thr Tyr Ser Val Ser

305                 310                 315                 320

Asn Leu Ser Gln Ile Ala Asn Glu Pro Leu Gly Ile Val Ala Ser Arg

                325                 330                 335    

Leu Arg Ser Gln Leu Gly Arg Asp Asp Leu Arg Arg Arg Thr Gln Ala

            340                 345                 350        

Met Val Thr Tyr Leu Gln Asp Gln Thr Asn Arg Ala Asn Val Ser Val

        355                 360                 365            

Thr Ala Asp Ala Asn Pro Ser Thr Asp Ile Met Leu Ser Ser Trp Ala

    370                 375                 380                

Lys Leu Ser Cys Trp Glu Tyr Asp Phe Gly Leu Gly Leu Gly Asn Pro

385                 390                 395                 400

Glu Ser Val Arg Arg Pro Leu Phe Glu Pro Phe Glu Ser Leu Met Tyr

                405                 410                 415    

Leu Met Pro Lys Arg Pro Asp Gly Glu Ile Thr Ala Ala Ile Ser Leu

            420                 425                 430        

Arg Asp Glu Asp Met Glu Arg Leu Lys Ser Asp Glu Glu Trp Lys Lys

        435                 440                 445            

Tyr Gly Gln Phe Ile Gly

    450                

 

<210>  3

<211>  795

<212>  DNA

<213>  玉米赤霉烯酮降解酶

<400>  3

atgcgcactc gcagcacaat ctcgaccccg aatggcatca cctggtacta tgagcaggag     60

ggtaccggac ccgacgttgt cctcgtccct gatgggctcg gagaatgcca gatgtttgac    120

cgctccgtgt cgcagattgc tgctcaaggc ttcagggtca ctacgtttga tatgcccgga    180

atgtcccggt ctgtgaaggc accacccgag acctacactg aggtcacggc ccagaagctg    240

gcttcctatg tcatctccgt cctggatgct cttgacatca agcacgctac tgtctggggc    300

tgcagctcag gagcttccac cgtcgtggcg ctgttgctcg gttaccccga caggatacgc    360

aacgccatgt gccacgaact gccaacaaag ctactggacc acctttcaaa caccgctgtg    420

ctcgaagacg aggaaatctc aaagatcctg gccaatgtaa tgttgaacga cgtgtctgga    480

ggctcggagg cgtggcaagc catgggggac gaggtgcacg cgagactgca caagaactac    540

ccggtttggg ctcgaggata ccctcgcact attcctccct cagctccggt taaggatctg    600

gaggctctgc gtgggaagcc cctggactgg actgtcggcg ctgcgacacc aaccgagtct    660

ttctttgaca acattgttac cgctaccaag gctggtgtca acattgggtt gcttccaggg    720

atgcatttcc cttatgtttc ccacccggac gttttcgcta aatatgttgt ggaatttacg    780

cagaagtatc tttga                                                     795

 

<210>  4

<211>  264

<212>  PRT

<213>  玉米赤霉烯酮降解酶

<400>  4

 

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1               5                   10                  15     

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

            20                  25                  30         

Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Arg Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

        35                  40                  45             

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

    50                  55                  60                 

Val Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65                  70                  75                  80 

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Val Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

                85                  90                  95     

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

            100                 105                 110        

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

        115                 120                 125            

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

    130                 135                 140                

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly

145                 150                 155                 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

                165                 170                 175    

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

            180                 185                 190        

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

        195                 200                 205            

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

    210                 215                 220                

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225                 230                 235                 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

                245                 250                 255    

Val Glu Phe Thr Gln Lys Tyr Leu

            260                

 

<210>  5

<211>  300

<212>  DNA

<213>  SCW基因

<400>  5

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct     60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt    120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat    180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta    240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttac gtagaattcc ctagggcggc cgcgaattaa    300

 

<210>  6

<211>  99

<212>  PRT

<213>  SCW蛋白质

<400>  6

 

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1               5                   10                  15     

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

            20                  25                  30         

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

        35                  40                  45             

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

    50                  55                  60                 

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65                  70                  75                  80 

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Pro Arg Ala

                85                  90                  95     

Ala Ala Asn

        

 

<210>  7

<211>  34

<212>  DNA

<213>  上游引物P1

<400>  7

ggaattccat atgactgcac taaacgttac aaac                                 34

 

<210>  8

<211>  31

<212>  DNA

<213>  下游引物P2

<400>  8

cccaagcttc tagccaatga attgcccata c                                    31

 

<210>  9

<211>  29

<212>  DNA

<213>  上游引物P3

<400>  9

ccggaattca tgcgcactcg cagcacaat                                       29

 

<210>  10

<211>  36

<212>  DNA

<213>  下游引物P4

<400>  10

ataagaatgc ggccgcaaga tacttctgcg taaatt                               36

 

<210>  11

<211>  29

<212>  DNA

<213>  上游引物P5

<400>  11

cgcggatcca tgagatttcc ttcaatttt                                       29

 

<210>  12

<211>  28

<212>  DNA

<213>  下游引物P6

<400>  12

gctctagatt aattcgcggc cgccctag                                        28

 

Claims (6)

1.一种高效降解两种真菌毒素的工程菌，其特征在于，将脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因和玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因导入宿主菌中，得到可降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的工程菌；其中， 

所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因如序列表中SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如序列表中SEQ ID NO：3所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述宿主菌为酵母菌、芽孢杆菌或乳杆菌。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述酵母菌为毕赤酵母或酿酒酵母。

4.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌。

5.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述乳杆菌为嗜热乳杆菌。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述的高效降解两种真菌毒素的工程菌在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮中的应用。

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