CN104560927B

CN104560927B - 一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN104560927B
Application number: CN201510012021.XA
Authority: CN
Inventors: 任丽梅; 刘健; 袁国强; 郭军臣; 赵英杰; 徐永龙; 李鹤; 李晓静; 成志远
Original assignee: Shijiazhuang Pharma Group Zhongnuo Pharmaceutical Shijiazhuang Co Ltd
Current assignee: Shijiazhuang Pharma Group Zhongnuo Pharmaceutical Shijiazhuang Co Ltd
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2035-01-09
Also published as: CN104560927A

Abstract

本发明公开了一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用，所述突变的精氨酸脱亚胺酶在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D中的任意一个或多个位点发生突变，突变后的精氨酸脱亚胺酶的活性明显提高，可用于催化L‑精氨酸生产L‑瓜氨酸，转化率在95％以上。突变的精氨酸脱亚胺酶采用易错PCR体系制备得到。

Description

一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用。

背景技术

L-瓜氨酸(L-Citrulline)，化学名称为2-氨基-5-(胺基甲酰氨基)正戊酸。L-瓜氨酸是一种α氨基酸，具备肽键合成能力但不作为蛋白质正常组成氨基酸。因最先从西瓜中获取，而得名“瓜氨酸”。瓜氨酸是动物体内氨基酸代谢尿素循环的中间产物，从鸟氨酸及胺基甲酰磷酸盐在尿素循环中生成，或是透过一氧化氮合酶(NOS)催化生成精氨酸的副产物。L-瓜氨酸涉及了一系列的代谢过程，如尿素循环，精氨酸-瓜氨酸循环等。最近研究表明，L-瓜氨酸能广泛应用于医药、食品、保健品多个方面。

L-瓜氨酸主要功效体现在以下几方面：1、治疗L-精氨酸缺乏引起的相关疾病；2、防治前列腺疾病以及提高男性性功能；3、抗衰老和以及增强免疫力；4、提高运动员肌肉力量与耐力；5、维护建康的肺功能、提高脑力清晰度；6、肾脏损伤患者透析时，增加创伤愈合和改善微循环；7、治疗和缓解营养缺乏状况；8、作为异体排斥效应指示剂；9、类风湿关节炎诊断试剂；10、降低压力和克服沮丧情绪。L-瓜氨酸以其独特的保健作用正被越来越广泛地应用于食品药品行业、保健品行业和化妆品行业。许多科研机构以及医药研发中心投入较多力量进行瓜氨酸制备工艺研究。

目前，L-瓜氨酸的生产主要有化学法、提取法、酶法和发酵法。1、化学法：为L-瓜氨酸的最早生产方法。在碱性条件下水解L-精氨酸制备L-瓜氨酸。反应过程控制较为困难，污染大，且存在无法拆分DL-瓜氨酸旋光对应体等严重缺点。还有化学法报道通过L-鸟氨酸盐酸盐与碱式碳酸铜保护氨基方法、利用尿素甲酰化生成二瓜氨酸合铜、再通过硫化氢还原方法去除铜离子方法制备瓜氨酸。缺点为成本居高不下、产品纯度不高、环境污染巨大。2、提取法：L-瓜氨酸通过提取的方法从西瓜汁、野西瓜叶、核桃仁以及葫芦科植物种子中分离。但是此项技术分离纯化步骤繁琐、得到L-瓜氨酸纯度较低。原料来源受限制、规模小、产率低等缺点都严重制约了提取法在工业上的应用。3、发酵法：发酵法为目前L-瓜氨酸生产的主流方法。技术方法较为成熟，欧美对于此方面研究报道较多、日本研究比较深入。有报道可以通过发酵法生产L-瓜氨酸的菌种有：Bacillus subtilis K-X-1A-9(ATCC 15562)；石蜡节杆菌Arthrobacter paraffineus(日本Kogyo公司)；Eschierichia菌属；Kurthiasp.nov SK23.003(CN 102433289B)；粪链球菌Streptococcus faecalis BM-2CGMCC 4990(CN 102703339A)，SK23.001(CN 102433290A)。不利因素为终产物L-瓜氨酸的分离纯化困难以及最终L-瓜氨酸产率低的问题。4、酶法：L-瓜氨酸的酶法合成主要是指通过体外克隆不同物种来源的精氨酸分解酶、精氨酸脱亚氨基酶(Arginine deiminase,简称ADI)，催化底物精氨酸生成L-瓜氨酸。酶法合成L-瓜氨酸大都为一步酶催化反应。具有底物、产物浓度高、转化反应特异性高、无对映体结构的优点。因此可以避免发酵法生产L-瓜氨酸中复杂的反馈调节过程，直接投放底物L-精氨酸、实现高浓度L-瓜氨酸一步催化合成。目前已有报道表明Psudomonas putida ATCC4359、Pseudomonas fluorescen IFO3081、Pseudomonas ovalis IAM1002、Leuconostoc citrovorum ATCC8081等菌株以及人支原体感染细胞分离物(CN 102321643A)，Mycoplasma arginini(WO2011/029696 A1)中的精氨酸脱亚氨基酶具有L-瓜氨酸合成活性。

酶法生产L-瓜氨酸由于具有周期短、产物分离纯化容易等突出优势而逐渐成为瓜氨酸产业化研发的重要发展方向。但是目前报道大部分精氨酸脱亚胺酶大肠杆菌发酵单位低，大部分以无活性包涵体形式存在，酶法催化前期过程需要包涵体变性复性过程，严重制约直接酶法工业化生产而只能间接采用发酵法生产。解决这一问题的关键在于寻找到可以应用于工业化生产的高活性精氨酸脱亚胺酶基因，制作高活性液体酶制剂或者固定化酶应用于L-瓜氨酸的工业化生产领域。从而进一步提高底物浓度获得最佳L-瓜氨酸转化率与收率，提高酶活力，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是利用分子生物学手段，提供一种含点突变的高活性精氨酸脱亚胺酶，为酶法瓜氨酸工业化生产提供有效途径。

为了实现本发明所述目的，发明人提供了以下技术方案。

一种突变的精氨酸脱亚胺酶，在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个位点的氨基酸突变。

上述突变的精氨酸脱亚胺酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

上述突变的精氨酸脱亚胺酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

一种重组载体，含有权利要求2-3任一权利要求所述核苷酸序列或氨基酸序列。如pET系列载体、pWB980、pAO815等具备完整表达元件的可供目标序列表达的载体，含有操纵子，启动子，筛选标记，核糖体结合序列，多克隆位点，终止子等必备元件。

一种重组的宿主细胞，含有权利4所述重组载体。如大肠杆菌不同基因型，枯草芽孢杆菌、酵母菌等可供表上述达载体表达的宿主细胞。

本发明同时提供了上述突变的精氨酸脱亚胺酶的制备方法，包括以下操作：

(1)PCR引物设计

引物为ADI1F：5’-CGCGGATCCATGAAAATGGAACAAGCATTG-3’；

ADI1R：5’-ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC-3’

或

ADI2F：CGCGGATCCCATGAAAATGGAACAAGCATTG；

ADI2R：ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC

或

ADI3F：CCGGAATTCATGAAAATGGAACAAGCATTG；

ADI3R：CCGGAATTCTTATTTTAGATTTTCTCTAAC；

(2)PCR引物扩增ADI基因

以ADI1F、ADI1R或ADI2F、ADI2R或ADI3F、ADI3R为引物，质粒PUC 57-ADI为模板，扩增ADI基因，得到分别应用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母的待连接片段；

(3)易错PCR体系建立

易错PCR体系：

PCR反应条件为：

1、95℃5min；

2、95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；

3、72℃5min；

获得含有随机突变位点的ADI片段，通过BamH I、Sal I双酶切的方式定向克隆载体中，转化入BL21(DE)3受体菌株，Amp筛选得到含有不同突变位点的重组质粒；

(4)突变菌株的筛选

挑取含有不同突变位点的重组质粒单克隆菌株，进行培养、诱导、收集菌体，测定活性，挑选活性提升的菌株；

(5)获取突变后的精氨酸脱亚胺酶

筛选的菌株经过培养基活化，再通过摇瓶或发酵罐扩大培养并诱导表达后，离心收集菌体，通过超声破碎或均质的方法破碎菌体即可获得精氨酸脱亚胺酶粗酶液，进一步纯化后可获得纯度较高的精氨酸脱亚胺酶。

上述突变的精氨酸脱亚胺酶在催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸中的应用。

包含本发明所述核苷酸序列的表达载体可以采用含有必须表达元件(启动子、核糖体结合位点、多克隆位点，筛选基因等)的所有载体，如Novagen公司的原核表达pET系列的氨苄抗性载体、枯草芽孢杆菌表达载体pwb980、毕赤酵母表达载体pAO815，pPIC 9k等。

包含上述表达载体的宿主细胞，可以采用大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞以及毕赤酵母细胞。由于ADI在不同宿主细胞中酶活力表现差异较大，因而优选酶活力最高的大肠杆菌。在噬菌体高发季节，大肠杆菌细胞容易受噬菌体感染，传代不稳定，所以可以优选枯草芽孢细胞或毕赤酵母细胞。

本发明含有点突变的ADI基因可以通过其他途径如转染或侵染的方式转化到其他宿主而获得相应的表达酶。或通过制备该酶的固定化酶来实现生产瓜氨酸目的。

本发明所述是全基因合成Listeria monocytogenes精氨酸脱亚胺酶，通过易错PCR技术获得K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个位点突变的精氨酸脱亚胺酶。将原始基因与突变后的基因做酶活性比较，结果突变后大肠杆菌可溶性表达明显提高、酶活力具有显著增强。

本发明提供了一种高活性ADI基因和蛋白序列，该ADI可高效催化L-精氨酸水解反应生成L-瓜氨酸以及氨。同时也提供了一种有效表达ADI的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母表达系统。经5L发酵罐放大实验，大肠杆菌裂解菌体后上清酶活可达到270000U/L。同时由大肠杆菌表达体系制备的ADI冻干粉具有大于8000U/g的比活力。此外，在L-精氨酸底物浓度大于200g/L时，添加终浓度为2-5g的该冻干粉具有接近99％的产物生成率。同时该催化反应体系成分较为简单，仅需投入底物以及酶粉即可，不需额外添加其他物质，因而，十分有利于底物L-瓜氨酸的分离和纯化，利于L-瓜氨酸的规模化生产，因此，为进一步L-瓜氨酸大规模工业生产奠定了良好的基础。

附图说明

图1为ADI的PCR产物图，图中1为PCR扩增条带，与预测大小一致(1233bp)，M1为Trans 1K Marker，从上到下大小(bp)分别为10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000。

图2-1为pET 21a-ADI酶切鉴定图，图中1为构建好的重组环质粒pET 21a-ADI，2为其BamH I、Sal I双酶切后产物，从上到下大小(bp)分别为5300和1200，M2为Trans 15KMarker，从上到下大小(bp)分别为15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500。

图2-2为pWB 980-ADI酶切鉴定图，图中1为其用BamH I、Sal I双酶切后产物，从上到下分子量大小分别为3700和1200，2为构建好的重组环质粒pwb980-ADI，M2为Trans 15KMarker，从上到下大小(bp)分别为15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500。

图2-3为pAO815-ADI酶切鉴定图，图中1为构建好的重组环质粒pAO815-ADI，2为EcoR I单酶切的产物，从上到下分子量大小分别为7700和1200，M2为Trans 15K Marker，从上到下大小(bp)分别为15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500。

图3为ADI的大肠杆菌重组菌株诱导后SDS-PAGE图谱，图中M为蛋白marker图，从上到下大小(kD)分别为97.2、66.4、44.3、29.0、21.0；1为ADI的大肠杆菌重组菌株诱导后上清，与预测大小一致(45kD)。

图4为不同菌株摇瓶水平ADI酶活力变化趋势图。

图5-1、图5-2、图5-3为HPLC动态检测底物精氨酸浓度258g/L时底物产物的动态变化图，其中精氨酸的保留时间为5.1分钟，瓜氨酸的保留时间为2.7分钟；图5-1为反应开始前，图5-2为反应1h时取样，图5-3为反应结束后，此时未见底物精氨酸剩余。

图6为不同底物浓度投入量时瓜氨酸的生成百分率图。

序列表说明：

SEQ NO:1为K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个点突变的精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列。

SEQ NO:2为K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个点突变的精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明利用基因工程技术，将全基因合成的ADI基因通过易错PCR技术对其原始基因进行改造，将突变后精氨酸脱亚胺酶基因克隆到不同表达载体，并将相应的表达质粒转化到相应的宿主菌如大肠杆菌BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌(WB600)或者毕赤酵母GS115表达目的蛋白，然后对表达蛋白进行瓜氨酸生成活性测定。结果显示，本发明的ADI可高效催化底物L-精氨酸反应生成L-瓜氨酸，具有非常高的转化率。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)及毕赤酵母表达载体试剂盒(Invitrogen)中所述的方法进行。

下面结合具体实施例对本发明所述内容作进一步详细的说明。

实施例1 精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因的构建、易错PCR体系建立以及ADI活性检测体系建立、HPLC方法测定精氨酸与瓜氨酸的条件

一、引物设计

根据ADI全基因序列，以及大肠杆菌的表达载体pET-21a特点分别设计了初始构建以及易错PCR前后突变引物(两者相同)：

引物ADI1F：5’-CGCGGATCCATGAAAATGGAACAAGCATTG-3’(带下划线的碱基为Bam HI识别位点)；

引物ADI1R：5’-ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC-3’(带下划线的碱基为Sal I识别位点)。

二、PCR引物扩增ADI目的基因

分别以ADI1F、ADI1R为引物，质粒PUC 57-ADI(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板，扩增ADI基因，其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa公司购得。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

1、95℃5min；

2、95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；

3、72℃5min。

结果如附图1所示，扩增到一条目的大小为1200-1300bp的条带，PCR扩增专一性良好(如附图1所示)，利用琼脂糖切胶回收试剂盒回收该PCR产物片段后，采用限制性内切酶BamH I和SalI将PCR扩增产物定向连接入大肠杆菌表达载体pET-21a(购自Novagen公司)中相应的位点，连接产物转化到感受态E.coli Top10(购自全式金公司)中，然后在含氨苄抗性(50μg/mL)LB平板(胰化蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl 10g/L；琼脂粉15g/L)培养基上筛选阳性克隆，采用引物ADI1F，ADI1R(10μM)，菌落PCR的方法验证筛选的阳性克隆(转化子)(如附图2-1所示)，获得重组表达质粒命名为pET21a-ADI，将测序正确的阳性转化子转入E.coli BL21(DE3)(购自全式金公司)中。将E.coli BL21(DE3)pET21a-ADI置于LB液体培养基(胰化蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl 10g/L)中37℃、200rpm震荡培养，至菌密度OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG于16-20℃诱导18小时，表达精氨酸脱亚胺酶。

三、易错PCR体系建立与突变菌株筛选

易错PCR体系：

PCR反应条件为：

1、95℃5min；

2、95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；

3、72℃5min。

PCR产物加入经过与原始ADI片段相同的构建方式最终转化入BL21(DE3)菌株中。通过挑取不同单克隆诱导表达的方式确定正向突变菌株，将比原始基因对应菌株酶活明显提升的菌株提取质粒，测序确定突变位点。

四、ADI酶活性检测方法以及HPLC检测方法建立

1、化学显色法定义ADI酶活力

瓜氨酸标准曲线建立：

瓜氨酸母液配制(0.2g/L):称量20mg瓜氨酸溶解入100毫升水中。4度保存。

混酸：浓硫酸：浓磷酸体积比＝1:3。

显色液：称取双乙酰一肟1.5g溶于50毫升水中，棕色试剂瓶常温保存。

按照表1利用瓜氨酸母液分别配制以下浓度的瓜氨酸5毫升。

表1

瓜氨酸	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										母液(μL)	0	62.5	125	200	250	312.5	400	500	625
水(mL)	5.0	4.94	4.88	4.8	4.75	4.69	4.6	4.5	4.38
										终浓度(g/L)	0	0.0025	0.005	0.008	0.01	0.0125	0.016	0.02	0.025

显色过程：按照表1配好混匀后，按顺序在上述5毫升不同浓度瓜氨酸中加入2毫升混酸，250微升显色液，混匀。黑暗煮沸半小时后黑暗降至室温后，于OD490比色。

酶活定义为在37℃、pH 6.0的条件下，每分钟催化生成1ug瓜氨酸所需的酶量为一个单位(U)。

2、HPLC测定精氨酸与瓜氨酸

实验仪器：Agilent 1200型HPLC，紫外检测器

实验条件：色谱柱：大连依利特Hypersil ODS24.6*250mm*5um；柱温：25℃；检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；流动相A：0.1M KH2PO4的水溶液中加入与5mM庚烷磺酸钠离子对试剂；流动相B：乙腈；等度洗脱：A:B＝95:5洗脱时间：5min。

五、摇瓶水平大肠杆菌ADI的粗酶液的制备以及酶活力测定

原始、以及突变后菌株进行小量诱导表达，将经过IPTG诱导的菌液离心去上清，湿细胞重悬于100mM醋酸钠缓冲液(pH6.5)中，其中0.5g菌体重选入10mL缓冲液中。超声细胞破碎仪以200W的功率超声20分钟，超声结束后，将样品在10000rpm离心20分钟，离心上清作为粗酶液。依上述方法进行最终确定含有较好酶活的位点为K137A；F198W；V230A；R257L；A260D。经过酶活力测定：该菌株的酶活力比出发菌株提升30％-50％左右。SDS-PAGE显示可溶性表达良好(如附图3所示)。

经测定1L LB培养基中大肠菌种pET21a-ADI 24-36h诱导后产生酶活力为1875-2325U/L(如附图4所示)。

为了进一步研究突变后的基因在不同表达体系中的酶活力，将该基因分别克隆至大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、以及毕赤酵母体系中考察酶活力变化。

实施例2 精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因的枯草芽孢杆菌重组质粒构建及表达

一、引物设计

根据实施例1中筛选到的已经获得的含有五个突变位点的精氨酸脱亚胺酶基因序列，以及pWB980(分泌型)枯草芽孢杆菌的多克隆位点设计了克隆引物。

ADI2F：CGCGGATCCCATGAAAATGGAACAAGCATTG(带下划线的碱基为BamHI识别位点)；

ADI2R：ACGCGTCGACTTATTTTAGATTTTCTCTAAC(带下划线的碱基为Sal I识别位点)；

二、PCR引物扩增ADI目的基因

分别以ADI2F、ADI2R为引物，质粒PUC 57-ADI(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板，扩增ADI基因，其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa公司购得。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

1、95℃5min；

2、95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；

3、72℃5min。

利用琼脂糖切胶回收试剂盒回收该PCR产物片段后，采用限制性内切酶BamH I和SalI将PCR扩增产物定向连接入枯草芽孢杆菌表达质粒中相应的位点，连接产物通过电转化的方法转化到枯草芽孢杆菌WB600中，然后在含卡那抗性(50μg/mL)LB平板培养基上筛选阳性克隆，采用引物ADI2F，ADI2R(10μM)，枯草芽孢杆菌菌落PCR的方法验证筛选的阳性克隆(转化子)，而后提取质粒进行酶切鉴定(如附图2-2所示)，并进行测序验证，获得重组表达质粒命名为pWB980-ADI。

三、精氨酸脱亚胺酶(ADI)的枯草芽孢菌株表达活性测定

将该枯草芽孢杆菌表达置于LB液体培养基中35℃、200rpm震荡培养，18小时后测定培养基中分泌表达精氨酸脱亚胺酶酶活力大小为285-290U/L(如附图4所示)。

实施例3 精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因的毕赤酵母的重组质粒构建及表达

一、引物设计

根据实施例1中筛选到的已经获得的含有五个突变位点的精氨酸脱亚胺酶(ADI)基因序列，以及毕赤酵母载体的多克隆位点分别设计连接胞内、胞外表达载体引物。

ADI3F：CCGGAATTCATGAAAATGGAACAAGCATTG(带下划线的碱基为EcoRI识别位点)；

ADI3R：CCGGAATTC TTATTTTAGATTTTCTCTAAC(带下划线的碱基为EcoRI识别位点)；

二、构建毕赤酵母重组表达载体pAO815-ADI及pPic9k-ADI

分别以ADI3F、ADI3R为引物，质粒PUC 57-ADI(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板，扩增ADI基因，其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa公司购得。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

1、95℃5min；

2、95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；

3、72℃5min。

将回收的PCR产物与表达质粒pPic9k和pAO815分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ单酶切，用T4连接酶将表达载体与酶切产物连接，转化到感受态大肠杆菌Top10中，然后在含氨苄抗性(50μg/mL)LB平板培养基上筛选阳性克隆，利用5’AOX前引物与ADI3R后引物通过菌落pcr方式鉴定连接方向，通过酶切重组质粒再次验证(如附图2-3所示)，琼脂糖电泳可见1200bp左右的条带。再进行测序验证后，确认得到重组表达载体pPic9k-ADI和pAO815-ADI。

三、精氨酸脱亚胺酶(ADI)的毕赤酵母转化及鉴定

将E.coli TOP10(pPic9k-ADI)和E.coli TOP10(pAO815-ADI)置于LB液体培养基中37℃、200转震荡培养过夜，中提重组质粒。利用SalI线性化重组质粒。分别将线性化的重组质粒pPic9k-ADI及pAO815-ADI转化酵母细胞。酵母Pichia GS115感受态细胞的制备：将Pichia GS115单菌落挑入YPD培养基中活化，活化的Pichia GS115按0.5-1％的接种量接入50ml YPD培养基中培养至对数期，离心获得的菌体用15ml无菌水洗2次，再用15ml无菌1M山梨醇洗2次，加入1ml1M山梨醇重悬菌体获得Pichia GS115感受态细胞,分装90μL每只于-80冰箱冻存，可保持活性2周。

将线性化pPic9k-ADI和pAO815-ADI 10μl加入90μl Pichia GS115感受态细胞中冰浴5分钟，2000V，电击转化(击穿时间保持在5ms为宜)，立即加入1mL山梨醇重选，吸取一定体积涂MD平板，30℃倒置培养，待培养至长出菌落后，将单菌落挑入无菌水中加入适量Lyticase(sigma)后37℃温育1-2h消化细胞壁，取部分消化产物为模板，片段引物作为鉴定引物，进行PCR，检测阳性克隆。

四、重组毕赤酵母菌的摇瓶诱导表达

分别各挑选4株阳性重组菌挑入2ml的YPD液体培养基活化1-2天后，以1％的接种量转接入500ml的BMGY(pH6.0)液体培养基中，200rpm培养，28℃过夜培养，每隔24h补加1％甲醇，诱导72h后，收集菌液，用于酶活测定，其中pAO815-ADI转化菌株为收集酵母细胞。

五、酵母菌表达ADI粗酶液的制备与活性测定

1.pPic9k-ADI胞外表达重组菌粗酶液制备：取2ml发酵菌液12000rpm、离心10min，收集上清用于酶活测定。

2.pAO815-ADI胞内表达重组菌粗酶液的制备：取2ml发酵菌液离心收集菌体，菌体用1ml的pH为6.5，100mM醋酸钠缓冲液重悬，加入适量的酸洗玻璃珠震荡破碎20min后，离心上清作为粗酶液。

实验结果显示：pPic9k-ADI胞外未检测到酶活，pAO815-ADI胞内酶活为60-80U/L(如附图4所示)。

实施例4 精氨酸脱亚胺酶(ADI)大肠表达菌株的发酵放大实验、菌体处理与均质破碎后酶活性测定

将得到的含有突变位点的大肠杆菌表达菌株挑单菌落至含LB培养基的试管，37℃、200rpm过夜培养后，接种至500mL摇瓶(含150mL LB培养基)，37℃、200rpm培养3h，OD1.2，火焰接种进罐。发酵罐总体积5L，装液量3L。发酵培养基为M9培养基(Na₂HPO₄ 6g/L；KH₂PO₄ 3g/L；(NH4)₂SO₄ 2.24g/L；NaCl 0.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.246g/L；葡萄糖2g/L)，补料为60％葡萄糖，氨水调节pH。发酵培养控温37℃，pH6.5；培养8h时溶氧突变，OD20，开始补料。OD30诱导，IPTG终浓度1mM，诱导温度控至25℃，pH7.0。培养21h时放罐，OD135，放罐体积3.66L，6000rpm离心15min，称菌体湿重780g。

将菌体用20mM pH 7.5的PBK缓冲液溶解，菌体湿重/缓冲液体积＝1:3，均质机压力750Bar破碎2遍，12000rpm离心20min，得上清酶液2.2L。

采用化学显色法定义发酵上清酶活力，测定酶活力时需预先考察酶液的稀释倍数，经3次发酵测定发酵上清液酶活力可达200000-270000U/L。

实施例5 精氨酸脱亚胺酶(ADI)冻干粉的制备、酶活力测定以及大转化反应体系优化(功效实验)

将实施例4中获得的上清酶液，倒入平皿，置于-80℃冰箱冰冻1天后，将平皿放入冻干机，-40℃下抽真空至压力4par，冻干3天，收获冻干粉。

用100mM醋酸钠缓冲液(pH6.5)配制冻干粉溶液进行酶活力测定，结果显示：获得的冻干粉酶活力为8800U/g。

大反应转化体系操作：配制不同浓度精氨酸溶液，浓盐酸调节pH至6-7之间，加入获得的酶活力为8800U/g的冻干粉启动反应(如表2所示)。不同时间点取样，HPLC动态检测反应进程(如附图5-1、5-2、5-3、附图6所示)。

表2 冻干粉转化率

投入精氨酸浓度(g/l)	ADI(U/L)	时间(h)	生成瓜氨酸浓度(g/l)	转化率(％)
					94	7920	3.0	94.1	99.11
159	14080	3.0	155.8	97.55
					158	14080	3.0	154.2	97.16
181	14960	3.0	177.0	97.02
					177	17600	3.0	173.4	97.63
186	17600	4.5	178.5	95.52
					185	17600	4.5	179.8	96.63
191	17600	5.0	187.4	97.76
					190	17600	5.0	187.4	97.86
221	17600	5.5	212.8	95.57
					258	17600	5.5	251.0	96.73

由表2可见：精氨酸底物浓度为94-258g/L时加入极少量的冻干粉即可在短时间内(5.5h)获得95％以上的底物生成率，其中瓜氨酸生成的最大浓度可达251g/L。

由附图2-1、附图2-2、附图2-3可以看出，所有重组载体与预测大小一致，载体构建成功。

由附图4可以看出，ADI基因最适表达系统依次为原核表达系统(大肠杆菌)、枯草芽孢表达系统、真核表达系统(毕赤酵母)。

由附图6可以看出，随着底物精氨酸的减少，瓜氨酸含量逐渐上升。转化反应投入(94-258g/L)精氨酸时产物瓜氨酸的生成率都可达到接近100％。

Claims

1.一种突变的精氨酸脱亚胺酶，其特征在于，在K137A、F198W、V230A、R257L、A260D五个位点的氨基酸突变，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.根据权利要求1所述的一种突变的精氨酸脱亚胺酶，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述核苷酸序列。

4.一种重组的宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体。

5.如权利要求1-2任一权利要求所述突变的精氨酸脱亚胺酶在催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸中的应用。