CN102061283A - 一株产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建及其定向改造方法 - Google Patents

Abstract

一株产精氨酸脱亚胺酶（ADI）的重组菌的构建及其定向改造方法，属于医药生物工程技术领域。其中包括：采用PCR方法，扩增变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）CGMCC No.2039的ADI编码基因arcA，构建ADI重组表达菌种，对该重组ADI酶进行酶学性质研究，其K_m为2.88mmol/L（pH6.0），最适反应pH为6.0，比酶活为20.85U/mg，当pH升高至生理pH（7.4）时，比酶活下降超过90%。采用易错PCR突变技术，对该重组ADI酶进行定向改造以提高其在生理中性条件pH下的活性及底物亲和力。通过一轮定向改造，筛选获得一株优良的突变株ADIM314，ADIM314酶和野生酶相比：其生理pH条件下比酶活提高20倍以上，K_m值下降至0.65mmol/L（pH7.4），最适反应pH从6.0提高至6.5。

Description

一株产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建及其定向改造方法

技术领域

本发明包括采用基因工程技术构建精氨酸脱亚胺酶（ADI）重组菌及其定向改造的方法，属于医药生物工程技术领域。

背景技术

精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase，EC 3.5.3.6，简称ADI）是一种极具潜力的用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的抗癌新药，包括目前尚缺乏有效药物治疗的肝细胞瘤（hepatocellular carcinomas，简称HCCs）以及黑素瘤（melanomas）。人们对ADI的抗癌活性的认识始于精氨酸对肿瘤细胞生长所起的重要作用。精氨酸是一种对人类以及鼠的正常细胞都是非基本氨基酸，因为精氨酸可以由瓜氨酸，通过尿素循环的过程中的两种酶，精氨基琥珀酸合成酶（ASS）和精氨基琥珀酸裂解酶（AL）而生成。但是一些精氨酸缺陷型肿瘤细胞不表达ASS，自身无法合成精氨酸。研究显示ADI对于精氨酸缺陷型肿瘤，特别是黑素瘤以及肝细胞瘤，具有显著的抑制作用。

目前，ADI基因已经从细菌和厌氧真核细胞中被分离出来，然而在高等真核细胞中目前还没有发现有ADI基因和ADI活性的报道。目前，来源于Streptococcus sanguis、Mycoplasma arginini、Giardia intestinals、Pseudomonas aeruginosa和Lactococcus lactis的ADI编码基因被克隆并在大肠杆菌中表达。1966年，Schimke等人发现由支原体Mycoplasma hominis对肿瘤细胞的抑制作用是通过一种降解精氨酸的酶引起的，这种酶就是ADI。1971年，日本的Kakinoto等人筛选出一株具有很高ADI酶活性的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）；并纯化得到ADI的蛋白质晶体。但是真正将ADI应用于癌症治疗是最近二十年来才为人们所接受并关注。2002年，Ensor等发现在大肠杆菌中重组表达的支原体ADI对精氨酸营养缺陷型的23种人的黑素瘤以及16种人的肝细胞瘤在体外和体内都具有活性，通过对ADI进行聚乙二醇（PEG）化提高了ADI在体内的半衰期。2004年，他们将ADI-PEG-20用于肝癌的临床实验，结果成功使患者血浆中的精氨酸的可检测浓度降为零。目前，Pheonix Pharmacologic公司开发的支原体来源的ADI-PEG-20制剂用于肝细胞癌和黑素瘤（药品名称分别为Hepacid和Melanocid）的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验正在美国和意大利进行。

本研究室通过筛选得到一株具有较高ADI活性的变形假单胞菌（P. plecoglossicida）CGMCC2039，通过PCR扩增获得该ADI基因（中国专利：200710107822.X）并构建重组菌。研究表明，该重组ADI的最适pH为6.0，生理pH7.4的残余酶活低于10％，且K _m 较高（2.88mmol/L，pH6.0），限制了该重组ADI酶作为抗癌药物的应用前景。为解决这一问题，本发明对该重组ADI进行定向改造以提高其在生理中性条件pH下的活性并降低其K _m 值，采用error-prone PCR（易错PCR）突变技术，从P. plecoglossicida CGMCC 2039的ADI编码基因出发，基于改良的二乙酰一肟硫胺脲（测定瓜氨酸）方法，建立了简便灵敏的96孔板高通量筛选模型。

发明内容

本发明的目的：本发明的目的是采用PCR扩增获得P. plecoglossicida CGMCC 2039的ADI编码基因，构建重组质粒并于大肠杆菌中表达选取具有改良酶活的ADI突变体，对其进行定向改造。

本发明的技术方案：一种产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建方法，步骤如下： 

1）由产精氨酸脱亚胺酶ADI的变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）CGMCC No.2039，扩增ADI的编码基因arcA；

2）将arcA基因连接在表达质粒pET24a上，酶切位点为Nde I及Xho I，获得重组质粒pET24a-ADI；

3）将重组质粒pET24a-ADI转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得产ADI的大肠杆菌重组菌；该重组菌产生的重组ADI基因全长1254bp，编码417个氨基酸，蛋白质分子量为92.6kDa，由两个相同的亚基组成。

所述产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的定向改造方法，步骤如下：

1）采用易错PCR技术，以所述重组质粒pET24a-ADI为模板，设计引物，扩增获得ADI突变基因；

2）将步骤（1）所得易错PCR产物及表达质粒pET24a用Nde I及Xho I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)构建重组ADI基因突变库；

3）采用改良的二乙酰一肟硫胺脲测定瓜氨酸方法，建立96孔板高通量筛选模型，用于筛选生理pH条件下酶活9.02U/mg以上和K _m 值低于0.65mmol/L的ADI，获得重组菌ADI M314。

所述重组ADI突变株M314携带三个突变位点分别为A128T，H404R和I410L；在生理pH条件下即pH7.4下较野生ADI酶活提高20倍以上，达到9.02U/mg，K _m 值下降至0.65mmol/L，最适pH从6.0提高至6.5。

所述重组ADI M314，经过酶活和酶学性质改善后应用于医药方面。

所述重组ADI酶活测定方法如下：

    将适量酶液加入到L-精氨酸盐酸盐-磷酸缓冲液中，37℃反应30min，100℃水浴终止反应，测定瓜氨酸含量。

酶活定义：37℃时，每分钟转化1μmol精氨酸盐酸盐生成瓜氨酸所需的酶量。

二乙酰一肟硫氨脲溶液：1g二乙酰一肟，30mg硫氨脲，蒸馏水定容至100mL；十六烷基三甲基溴化铵溶液（CTAB）：1g CTAB，蒸馏水定容至1000mL；混酸：量取70mL浓磷酸，160mL浓硫酸，缓缓加于600mL蒸馏水中，冷却后加入10mL 10 g/L的三氯化铁溶液，加蒸馏水定容至1000mL；L-精氨酸盐酸盐-磷酸缓冲液：0.2mol/L pH6.0 磷酸钠缓冲液1L，加0.01mol/L-精氨酸盐酸盐。

本发明的有益效果：原有技术将变形假单胞菌（P. plecoglossicida）ADI编码基因于大肠杆菌中表达。重组菌诱导培养后，经阴离子交换和凝胶过滤层析得到电泳纯重组ADI，比酶活为20.85U/mg（pH 6.0，37℃）。对该酶进行酶学性质研究，其K _m 为2.88mmol/L（pH6.0）；V _max 为31.68μmol/min·mg；最适反应pH为6.0，当pH升高至生理pH（7.4）时，其酶活下降超过90%。该ADI在生理pH条件下较低的酶活和较高的K _m 值成为其抗癌活性研究的限制性因素。

本发明基于改良的二乙酰一肟硫胺脲（测定瓜氨酸）方法，建立了简便灵敏的96孔板高通量筛选模型，用于获得生理pH条件下具有高酶活和低K _m 值的ADI。通过一轮易错PCR，筛选获得一株优良的突变株M314。将该重组菌诱导培养后，经阴离子交换和凝胶过滤层析得到电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶，其生理pH条件下比酶活提高20倍以上，K _m 值下降至0.65mmol/L（pH7.4），最适pH从6.0提高至6.5。本发明为获得优良的ADI突变株提供了有效的定向改造方法并对开发有市场前景和自主知识产权的抗癌新药有重要实践价值。

附图说明

图1 重组ADI突变株M314和野生型ADI在不同pH条件下的活性变化。

具体实施方式

实施例1 重组ADI的构建

根据该ADI的基因序列，设计引物：

F：5’- GCTCATATGTCCGCTGAAAAACAGAAGTACG -3’ (NdeI)

R：5’- ATCTCGAGTTAGTAGTTGATCGGGTCGCGCA -3’ (XhoI)

上下游分别引入NdeI和XhoI酶切位点（下划线标出），本发明中所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以变形假单胞菌菌体为模板，PCR扩增ADI基因片段，反应体系50 μL，如表1所示：

表1 PCR扩增ADI基因片段反应体系

10×Ex Taq   Buffer	5 μL
		2.5 mM   dNTPs	4 μL
F-Primer   (20 μM)	1 μL
		R-Primer   (20 μM)	1 μL
菌体	-
		Ex Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)	0.5 μL
ddH2O	38.5 μL

反应程序：在94 ℃变性10 min；以94 ℃ 1 min、56 ℃ 45 s、72 ℃ 2 min的条件反应30循环后，72 ℃延伸10 min，得到PCR产物ADI。

将PCR产物ADI进行切胶纯化处理后，与pMD18-T Simple Vector载体连接并转入大肠杆菌JM109感受态细胞。感受态细胞制备采用CaCl₂法：将宿主菌E. coli JM 109 接种于LB液体培养基中，37℃、200 r/min条件下培养过夜；转接，培养至OD₆₀₀ 0.4左右，冰浴10 min；离心（4 ℃、4000 r/min 10 min）收集菌体；将细胞用 0.1 mol/L 的MgCl₂/CaCl₂(4℃)溶液悬浮；离心（4 ℃、4000 r/min 10 min）收集菌体，去上清液；加入0.1 mol/L CaCl₂ 1mL，分装至1.5 mL 离心管内，每管100 μL，-80 ℃保存。

将100 μL感受态细胞冰浴，加入已连接的重组质粒，轻柔混匀，于冰浴中静置30 min；42 ℃热转化90 s后，冰浴2 min；加入890 μL SOC培养基(室温)，培养1 h，涂布 LB/Amp平板37℃培养过夜。

将重组pMD18-T-ADI质粒与表达pET24a双酶切，重组质粒pMD18-T-ADI的酶切反应体系组成如表2所示，表达载体pET24a的酶切反应体系如表3所示。

表2 重组质粒pMD18-T-ADI的酶切反应体系

pMD18-T-ADI	15 μL (约1.5 μg)
		10×H Buffer	3 μL
Nde I (10 U/μL)	1 μL
		Xho I (10 U/μL)	1 μL
ddH2O	10 μL
		总体积	30 μL

表3 表达载体pET24a的酶切反应体系

pET24a	15 μL (约1.5 μg)
		10×H Buffer	3 μL
NdeI (10 U/μL)	1 μL
		XhoI (10 U/μL)	1 μL
ddH2O	10 μL
		总体积	30 μL

将上述反应液加入Nde I并于37 ℃水浴反应4 h后，加入Xho I继续反应12 h。

经Nde I和Xho I酶切的ADI基因片段在DNA连接酶作用下，与pET24a表达载体相连接，得到重组质粒pET24a-ADI。将此重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）（感受态细胞制备及转化方法同上），即得到ADI重组菌。

实施例突变体库的构建

易错PCR主要是通过降低Taq DNA聚合酶在PCR扩增过程中的保真度而向基因中引入错误碱基。引入的错误碱基被翻译成相应的氨基酸从而导致酶的突变，产生突变体。易错PCR是在标准PCR条件的基础上可通过以下修改以增加突变率：MgCl₂浓度增加到7mmol/L以稳定非互补的碱基对；加入MnCl₂以降低聚合酶对模板的特异性；dCTP和dTTP的浓度增加到1mmol/L以促进错误掺入；Taq DNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续。

以重组质粒pET24a-ADI为模板，易错PCR扩增ADI基因片段，所采用的引物为（pADI-fwd：5′-AATTAATACGACTCACTATAGGGGA-3′,以及pADI-rev： 5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′）；10×易错PCR 缓冲液：70mmol/L MgCl₂，500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl pH 8.3 (25℃)，0.1%(w/v)明胶；10×dNTP混合物：2mmol/L dGTP，2mmol/L dATP，10mmol/L dCTP，10mmol/L dTTP；反应体系50 μl，如表4所示。

表4 重组质粒pET24a-ADI反应体系

10×epPCR   Buffer	5 μl
		10×dNTPs	5 μl
pET24a-ADI(50ng/μl)	1 μl
		pADI-fwd   Primer（20μM）	0.5 μl
pADI-rev   Primer（20μM）	0.5 μl
		Taq DNA 聚合酶 (5U/μl)	1 μl
5mmol/L   MnCl2	3 μl
		ddH2O	34 μl
总体积	50 μl

反应程序：以94℃ 1 min，52℃ 1min，72℃ 2 min反应30循环后，72℃ 5 min。

将纯化后的易错PCR产物—ADI基因用Nde I和Xho I双酶切后（酶切反应体系及反应条件同实施例1），割胶回收ADI基因片段，再与同样用Nde I和Xho I双酶切并割胶回收后的pET24a进行连接，将连接产物转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，涂布含30μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养至长出菌落，培养液体系如表5所示。

表5 培养液体系表

pET24a	7 μl (0.03   pmol)
		ADI基因	3 μl (0.15   pmol)
10×Ligation   buffer	2 μl
		ddH2O	7 μl
T4连接酶 (5U/μl)	1 μl
		总体积	20 μl

上述反应体系混匀后，于16℃放置过夜。

实施例3  ADI突变文库的筛选

将ADI突变库中的单菌落，转接至含有IPTG（终浓度0.2 mmol/L）的LB/Kan平板，30℃诱导培养至长出单菌落。

根据ADI催化精氨酸产生瓜氨酸和氨的反应，设计96孔板筛选具有ADI活性突变株的方法。具体操作：取96孔板，首先于每孔中加入0.2mol/L 磷酸缓冲液50μl（pH 7.4），挑取IPTG诱导培养单菌落于孔中混匀（不加菌体的样品作为对照），然后加入50μl 1 mmol/L L-精氨酸盐酸盐，0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)，37℃反应15 min后，加入90μl混酸终止反应，再加入30μl二乙酰一肟-硫胺脲溶液，混匀，37℃反应2h后，测OD₅₃₀。具有ADI活性的菌株所在孔的反应液呈紫红色，最大吸收波长为λ530nm。

实施例4  ADI突变株M314 

将ADI突变株M314的单菌落接入LB/Kan液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养。收集菌体，提取质粒，并纯化。质粒交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序见序列表SEQ ID NO: 1，测得M314携带三个突变位点分别为A128T，H404R和I410L。

实施例5  重组ADI的纯化

Buffer A：20 mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液；Buffer B：20 mmol/L、pH 7.0、PBS含1 mol/L NaCl的缓冲液；Buffer C：20 mmol/L、pH 7.0、PBS含0.15 mol/L NaCl的缓冲液。

发酵液于800 0 r/min条件下离心10 min，收集菌体。用20 mmol/L，pH7.0的磷酸缓冲液（PBS）洗涤两次。按10:1(发酵液体积/缓冲液体积)的比例将菌体悬浮于PBS缓冲液中，冰浴条件下超声波破碎8 min，超声强度400 W，超声1 s，间隙3 s。取破碎液于4 ℃，10000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，测定其蛋白浓度及酶活。

HiPrep DEAE FF 阴离子交换柱用Buffer A平衡。上样后，先用Buffer A洗脱未吸附蛋白，洗至基线后，采用Buffer B梯度洗脱，流速2 mL/min，收集活性部分，透析后进行凝胶过滤。Superdex ^TM200凝胶柱用Buffer C平衡。上样后用Buffer C以1.5 mL/min的流速进行洗脱。收集活性成分，透析后冷冻干燥，备用。纯化结果见表6。

表6重组精氨酸脱亚胺酶纯化结果

纯化步骤	总蛋白(mg)	总活力(U)	比活力(U/mg)	纯化倍数	回收率(%)
						粗酶液	156.4	1174.5	7.5	1	100
离子交换层析	69.2	1041.6	15.1	2.0	88.7
						凝胶过滤层析	36.3	756.4	20.9	2.8	72.6

由表5可以看出，每升发酵液中可获得36.3 mg活性蛋白，比酶活为20.9U/mg蛋白，纯化倍数2.8倍，酶活回收率为72.6%。

实施例6  ADI突变株M314的比酶活和酶学性质

比酶活

将纯化后的ADI酶液（2 μg/μl，10 μl）加入L-精氨酸盐酸盐-磷酸缓冲液中(L-精氨酸盐酸盐 10 mmol/L，磷酸缓冲液 0.2 mmol/L，990μl)，37℃条件下反应30min，100℃水浴终止反应，稀释适当倍数后测定瓜氨酸含量。

pH

酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系。每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH值。只有在适宜的pH值条件下，酶才能显示其最高催化活性。在pH为4-8.5 (pH 4-5，0.2 mol/L柠檬酸缓冲液；pH 5.5-8.5，0.2 mol/L磷酸钠缓冲液)的缓冲液中，底物浓度0.1 mol/L，反应温度37 ℃条件下，考察不同pH对rADI活性的影响。

K _m

K _m 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同酶的K _m 值不同，同一种酶与不同底物反应K _m 值也不同，K _m 值可近似地反映酶与底物的亲和力的大小。以L-精氨酸为底物，在不同pH、37 ℃条件下，测定ADI在不同底物浓度下（2-10mmol/L）的反应速度。并按Lineweaver-Burk双倒数法作图，求出K _m 。结果见表7。

表7 突变株M314与野生型ADI在pH6.0和pH7.4条件下的比酶活和K _m 参数比较

<210> SEQIDNO:1

<211> 1254

<212> DNA

<213> 产精氨酸脱亚胺酶的重组菌ADIM314

 

<400> 1

atgtccgccgaaaaacagaagtacggtgtccactccgaagcaggcaagctgcgcaaggta   60

atggtctgcgctccgggactggcgcacaagcgcctgaccccgagcaactgcgacgagctg  120

ctgttcgacgatgtgatctgggtcgaccaggccaagcgcgaccacttcgacttcgtcacc    180

aagatgcgcgagcgcggcgtggatgtgctggaaatgcataacctgctcaccgatatcgtg    240

cagaaccccgaggccctgaagtggatcctcgaccgcaagatcacccctgacaccgtcggg   300

gtgggcctgaccaacgaagtgcgcagctggctggagggccaggagccacgccacctcgcc  360

gagttcctgatcggcggcgtgaccggccaggacctgccggagagcgaaggtgccagcgtg    420

gtcaagatgtacaacgactacctgggccactccagcttcatcctgccgccgctgcccaac       480

acccagttcacccgcgacaccacctgctggatctacggcggcgtgaccctcaacccgatg     540

tactggccggcgcgacgccaggaaaccctgctgaccaccgccatctacaagttccacccc     600

gagttcaccaaggccgacttccaggtctggtacggcgacccggaccaagagcacggccag    660

gccaccctcgaaggcggcgacgtcatgccgatcggcaagggcatcgtgctgatcggcatg     720

ggtgagcgcacctcgcgccaggccatcggccaactggcacagaacctcttcgccaagggc    780

gcagtggagcaagtgatcgtcgccgggctgccgaagtcccgtgcggccatgcacctggac     840

accgtgttcagcttctgcgaccgcgacctggtcacggttttcccggaagtggtgcgcgag       900

atcgtgccgttcatcatccgcccggacgaaagcaagccctacggcatggacgtacgccgc      960

gagaacaagtcgttcatcgaggtggtcggcgagcagctgggcgtcaagctgcgtgtcgtc     1020

gagaccggcggcaacagcttcgccgccgagcgcgagcagtgggatgacggcaacaacgtg   1080

gtggcactggagccaggtgtggtcatcggctacgaccgcaacacctacaccaataccttg      1140

ctgcgcaaggccgggatagaggtcatcaccatcagtgccggcgaactgggccggggccgt     1200

ggcggcggccgttgcatgacctgcccgctcgtgcgcgacccgatcaactactaa              1254

 

Claims (4)

1.一种产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建方法，其特征在于：

（1）由产精氨酸脱亚胺酶ADI的变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）CGMCC No.2039，扩增ADI的编码基因arcA；

（2）将arcA基因连接在表达质粒pET24a上，酶切位点为Nde I及Xho I，获得重组质粒pET24a-ADI；

（3）将重组质粒pET24a-ADI转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得产ADI的大肠杆菌重组菌；该重组菌产生的重组ADI基因全长1254bp，编码417个氨基酸，蛋白质分子量为92.6kDa，由两个相同的亚基组成。

2.一种权利要求1所述方法构建的产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的定向改造方法，其特征在于步骤如下：

（1）采用易错PCR技术，以权利要求1所述重组质粒pET24a-ADI为模板，设计引物，扩增获得ADI突变基因；

（2）将步骤（1）所得易错PCR产物及表达质粒pET24a用Nde I及Xho I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)构建重组ADI基因突变库；

（3）采用改良的二乙酰一肟硫胺脲测定瓜氨酸方法，建立96孔板高通量筛选模型，用于筛选生理pH条件下酶活9.02U/mg以上和K _m 值低于0.65mmol/L的ADI，获得重组菌ADI M314。

3.根据权利要求2所述的定向改造方法，其特征在于所述重组菌ADI M314携带三个突变位点分别为A128T，H404R和I410L；在生理pH条件下即pH7.4下较野生ADI酶活提高20倍以上，达到9.02U/mg，K _m 值下降至0.65mmol/L，最适pH从6.0提高至6.5。

4.权利要求2所述的定向改造方法获得的重组菌ADI M314的应用，其特征在于所述重组ADI M314，经过酶活和酶学性质改善后应用于医药方面。

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