CN103243063A

CN103243063A - 枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶(ansZ)在大肠杆菌中的高效表达

Info

Publication number: CN103243063A
Application number: CN2013101962095A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 贾明媚; 徐美娟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2013-08-14

Abstract

以B.subtilis6-7基因组DNA为模板，扩增得到编码L-天冬酰胺酶的基因ansZ，将其克隆到表达载体pGEX-6P-1上，首次实现枯草芽孢杆菌ansZ在E.coli BL21中高效表达，酶活测定表明重组菌酶活较原始菌提高了266倍。用GST融合蛋白亲和层析法纯化L-天冬酰胺酶。对该酶的酶学性质进行了初步研究，该酶的反应最适pH为7.5，在pH值6.0-9.0的范围内稳定，反应最适温度为40℃，在60℃处理2h后仍有10％的剩余酶活，没有发现对该酶有明显激活作用的金属离子，酶动力学参数以L-天冬酰胺为底物的Km值为0.43mmol/L，Vmax为77.51μmol/(mL/min)。

Description

枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶(ansZ)在大肠杆菌中的高效表达

技术领域

利用重组大肠杆菌高效表达B.subtilis6-7L-天冬酰胺酶，并首次对来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬酰胺酶的酶学性质进行研究，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)即L-天酰胺酰胺基水解酶，能专一性地催化L-天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶是是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，且对骨髓没有抑制作用。

L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。

1922年Clamenti首先发现豚鼠血清中含有丰富的L-天冬酰胺酶，1953年Kiddd观察到豚鼠血清有破坏Gardner小鼠癌细胞6C3HED的作用，1961年Broome用层析法将豚鼠血清分离提纯后，在有抗癌活力的部分测出极高的L-天冬酰胺酶活力，1964年Mashbum和Wriston从Escherichia coli B中部分提纯了L-天冬酰胺酶，发现其同样具有抗癌作用。2004年Amrein等提出用L-天冬酰胺酶代替其他方法减少食物中丙烯酰胺含量。2009年Hendriksen等研究证明在高温处理食品时加入L-天冬酰胺酶不会产生危害，同时有众多学者通过具体的实验证明L-天冬酰胺酶可以降低炸土豆片、马铃薯干粉、面团等食物中丙烯酰胺的含量。目前美国、德国、日本等国均已有产品出售，1995年美国还将L-天冬酰胺酶作为抗癌新药开发。

L-天冬酰胺酶来源多样，一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。Campbell等发现E.coli B中的L-天冬酰胺酶有EC-1和EC-2两种组分，仅具有相对热稳定性的EC-2组分有抗癌作用。Schwartz等人在E.coli K-12中也发现两种天冬酰胺酶：天冬酰胺酶I和II。Escherichia coli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。

因为野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来随着基因工程技术的快速发展，利用基因工程技术构建L-天冬酰胺酶工程菌的报道日益增多，采用基因工程菌产L-天冬酰胺酶逐渐成为一个重要来源。

本发明通过分子生物学技术获得L-天冬酰胺酶基因，将其连接于表达载体上并转化大肠杆菌成功构建基因工程菌，实现L-天冬酰胺酶的高效表达，并对重组酶的酶学性质进行研究。发明内容

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自B.subtilis6-7的L-天冬酰胺酶基因(简称ansZ)，构建重组表达载体pGEX-6P-1-ansZ，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pGEX-6P-1-ansZ/BL21，其酶活较原始菌提高了266倍。利用亲和层析法对表达的重组蛋白进行纯化，纯酶比酶活为56.30U/mg，并对该酶的酶学性质进行了研究，为该酶在食品及医药方面的应用提供一些理论基础。

本发明的技术方案：

1.L-天冬酰胺酶引物设计

根据NCBI枯草芽孢杆菌全基因组核酸序列中ansZ基因序列，设计L-天冬酰胺酶基因的PCR引物P1和P2。

P1：5’-GAC GGA TCC ATG AAAAAA CAA CGAATG CT-3’(BamHI)

P2：5’-GAC CTC GAG TTAATA CTC ATT GAAATAAG-3’(Xho I)

2.重组菌的构建

从B.subtilis6-7中抽提染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pGEX-6P-1和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄的10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。

3.重组蛋白的表达

将构建好的工程菌接种于LB培养基中进行活化，次日转接于发酵培养基中，IPTG诱导表达，离心收集菌体，破细胞获得粗酶液，采用氨电极法测定酶活。

3.重组菌L-天冬酰胺酶的表达纯化

将获得的粗酶液通过亲和层析得到纯酶液，对该酶的酶学性质进行初步研究，蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。

本发明的有益效果：

L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效，L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，而且L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。本发明首次探索了枯草芽孢杆菌来源的L-天冬酰胺酶基因在E.coliBL21中的表达，构建了高产L-天冬酰胺酶的基因工程菌株，并对重组蛋白的酶学性质进行研究，适用于工业化的生产和应用，具有一定的理论价值和应用价值。

附图说明

图1质粒pGEX-6P-1-ansZ酶切验证。

1：pGEX-6P-1-ansZ/BamH I；2：pGEX-6P-1-ansZ/BamH I+Xho I；3：DNAMarker：DL-2000；4：DNA Marker：λ-Hind III

图2L-天冬酰胺酶的表达与纯化。

1：pGEX-6P-1/BL21全细胞；2：pGEX-6P-1-ansZ/BL21全细胞；3：Protein Marker4：pGEX-6P-1-ansZ/BL21破碎上清液；5：pGEX-6P-1-ansZ/BL21穿透液；6：pGEX-6P-1-ansZ/BL21洗脱液

具体实施方式

实施例1：重组质粒pGEX-6P-1-ansZ的构建及转化

[1]从B.subtilis6-7抽提染色体DNA作为模板。

[2]以B.subtilis6-7总DNA为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix4pL，10×Ex Taq Buffer5μL，灭菌ddH₂O37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[3]构建重组质粒pMD18-T-ansZ，导入感受态E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，16℃过夜连接。连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-ansZ，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。

[4]将[3]中提取的质粒和表达载体pGEX-6P-1分别用BamHI和XhoI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pGEX-6P-1-ansZ转化到感受态E.coilBL21，转化方法参照实施例[3]，用氨苄抗性平板筛选阳性克隆。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40℃冰箱保藏备用。

实施例2：L-天冬酰胺酶高效表达及酶活测定

[1]将构建好的工程菌接入10mL液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按2％的接种量转接于发酵培养基中，37℃培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，置于16℃摇床过夜诱导表达。低温离心收集菌体，用超声波破碎细胞，离心收集上清液作为粗酶液，12％SDS-PAGE检测及分析。

[2]酶活测定采用25mL测定体系，取两支比色管，一支作为对照，一支为样品管，均加9mL50mM的Tris-HCl(pH7.5)，10mL50mM的L-天冬酰胺底物，于37℃预热，对照管加入5mL15％的三氯乙酸，对照管与样品管均加0.5mL细胞破碎上清液，37℃反应15min，样品管加入5mL15％的三氯乙酸终止反应。将反应溶液转入50mL烧杯中并加入高浓度NaOH1mL，于电磁搅拌状态下，用氨气敏电极检测L-天冬酰胺酶酶活。重组菌的酶活为10.41U/mL，较原始菌株酶活提高了266倍。

实施例3：L-天冬酰胺酶的纯化及酶学性质

[1]粗酶液经GST亲和柱纯化后得到纯的L-天冬酰胺酶，纯酶液比活力为56.30U/mg，利用纯化的酶液进行酶学性质研究。

[2]最适pH及pH稳定性：用底物缓冲液L-Asn配制不同pH(3～10)的底物溶液，将酶加入不同pH底物缓冲液中，37℃下反应15min，测定不同pH条件下酶的活性，并进行比较，确定酶反应的最适pH值。将一定量的纯酶液加入到不同pH值的缓冲液中，每隔一定时间取样，测定酶的剩余活性，观察该酶在不同pH条件下的稳定性。

[3]最适温度和热稳定性：在20℃～80℃设置11个反应温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，测定不同温度下酶的活力，确定酶的最适反应温度。将纯化的酶液分别在-20℃、0℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃保温，每隔2h取样，测定酶的剩余活力，研究该酶在不同温度下的热稳定性。

[4]不同金属离子以及EDTA对酶活的影响：分别在反应体系中加入终浓度为1mmol/L的Ca²⁺、Ba²⁺、Ni⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、La³⁺、Fe³⁺、Al³⁺离子以及EDTA，以不添加任何金属离子的酶活为100％，研究各金属离子对酶活的影响。

[5]Km值及Vmax的测定：配置不同浓度的底物，进行酶促反应，反应时间控制在5min。采用双倒数作图法确定L-天冬酰胺酶的Km及Vmax值。

该酶反应最适pH为7.5，在pH值6.0-9.0的范围内稳定，反应最适温度为40℃，在60℃处理2h后仍有10％的剩余酶活，Cu²⁺、La³⁺、Fe³⁺对L-天冬酰胺酶有明显的抑制作用，而Na+和EDTA对酶的影响非常小，没有发现对该酶有明显激活作用的金属离子，酶动力学参数以L-天冬酰胺为底物的Km值为0.43mmol/L，Vmax为77.51μmol/(mL/min)。

Claims

1.高产L-天冬酰胺酶重组菌E.coli BL21(DE3)/pGEX-6P-1-ansZ的构建，其特征是以B.subtilis6-7基因组DNA为模板，扩增得到编码L-天冬酰胺酶的基因ansZ，将其克隆到表达载体pGEX-6P-1上并转化E.coli BL21(DE3)，实现B.subtilis6-7L-天冬酰胺酶基因在E.coliBL21(DE3)中高效表达，重组菌E.coli BL21(DE3)/pGEX-6P-1-ansZ的酶活达到10.41U/mL，较出发菌株酶活提高了266倍。

2.将重组蛋白纯化，其特征在于利用表达载体pGEX-6P-1上的GST标签，用GST融合蛋白亲和层析法纯化L-天冬酰胺酶；酶学性质结果表明该重组L-天冬酰胺酶具有如下酶学性质，该酶的反应最适pH为7.5，在pH值6.0-9.0的范围内稳定，反应最适温度为40℃，在60℃处理2h后仍有10％的剩余酶活，Cu²⁺、La³⁺、Fe³⁺对L-天冬酰胺酶有明显的抑制作用，而Na+和EDTA对酶的影响非常小，没有发现对该酶有明显激活作用的金属离子，酶动力学参数以L-天冬酰胺为底物的Km值为0.43mmol/L，Vmax为77.51μmol/(mL/min)。