CN105154379A - 一株高效转化富马酸生产l-天冬酰胺的工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株用于生产l-天冬酰胺的基因工程菌CICC？11033S，宿主为产l-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌（<i>Escherichia？coli</i>）CICC？11022S（等同于CMGCC？No.5450），含有来源于大肠埃希氏菌JM109（<i>Escherichia？coli？</i>JM109）的l-天冬酰胺合成酶基因的表达载体。利用构建的工程菌全细胞高密度催化，可以高效转化富马酸生产l-天冬酰胺，转化率为94.7%，l-天冬酰胺产量可达125.1g/L，生产速率为12.51g/(L·h)，底物廉价，生产过程简便，副产物少，有效降低生产成本，具有很好的应用价值和可观的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一株基因工程菌及其应用，以富马酸和氨水为底物一步法转化生产l-天冬酰胺，属于生物工程技术领域。
背景技术
l-天冬酰胺，又名天门冬酰胺、天门冬素、α-氨基丁二酸一酰胺（L-Asparagine，l-Asn），在食品、医药、化工合成等行业得到广泛应用。
在食品领域，l-天冬酰胺作为添加剂，与糖共热进行氨基-羰基反应，能形成特殊香味物质。用于清凉饮料。在医药行业，可以用于氨基酸输液及降压、平喘、抗消化性溃疡、胃功能障碍等，在生命科学领域研究中，常用于治疗心肌梗死、心肌代谢障碍、心力衰竭、心脏传导阻滞、疲劳等症，在微生物培养中也有添加。工业领域l-天冬酰胺可以用于医药中间体及化工原料进行合成化工，也可用于丙烯腈的污水处理等。
目前，l-天冬酰胺的制备方法主要是提取法和化学合成法。直接提取方法主要是从l-天冬酰胺含量高的羽扇豆和大豆的豆芽的水提取物分离而得，以白羽扇豆为原料，经发芽、成浆、加热处理等流程，在pH小于6的条件下，经硅藻土过滤、离心，获得粗品，随后经过浓缩、结晶获得成品，该方法受原材料质量因素影响大，并且工艺复杂不易控制，污染严重；化学合成法主要通过l-天冬氨酸与氢氧化铵进行酰胺化而得，化学方法存在普遍的污染大、副反应多等缺陷。
生物转化法在天冬酰胺生产领域的应用鲜有报道，虽然该方法具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等优点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单，易于操作控制，但是由于酶法催化过程需要ATP的参与，因ATP价格昂贵限制了生物转化法的应用，目前未进入产业化阶段。
发明内容
本发明提供一株可以同时产生l-天冬氨酸酶和l-天冬酰胺合成酶的基因工程菌株E.coli11022S/pET28-asnACICC11033S，利用菌体细胞ATP再生体系，转化富马酸和氨水生产l-天冬酰胺，以替代现有l-天冬酰胺生产工艺，实现绿色生产。
本发明成功实现了将asnA基因在携带l-天冬氨酸酶基因的E.coliCICC11022S（等同于CMGCCNo.5450）宿主菌中的高效表达，并以此基因工程菌株转化富马酸和氨水生产l-天冬酰胺，具有原料成本低、生产过程简易、简便高效等特点（附图1）。
本发明底物富马酸、中间产物l-天冬氨酸及终产物l-天冬酰胺的定量测定分析采用柱前衍生-高效液相色谱方法（HenderJW,etal.,Rapid,accurate,sensitiveandreproducibleHPLCanalysisofaminoacids.AgilentTechnologies.USA.2000）。
本发明具有的突出特点是：
（1）本发明应用同时表达l-天冬酰胺合成酶和l-天冬氨酸酶的E.coli11022S/pET28a(+)-asnACICC11033S菌株转化富马酸和氨水生产l-天冬酰胺。
（2）本发明方法成功降低了原料的成本。
（3）本发明方法构建的基因工程菌生产l-天冬酰胺的过程简便，易于操作。
（4）本发明的基因工程菌生产l-天冬酰胺，转化率为94.7%，产量可达125.1g/L，生产速率12.51g/(L·h)。
附图说明
图1工程菌CICC11033S转化富马酸生产l-天冬酰胺示意图。
图2工程菌CICC11033S全细胞高密度催化生产l-天冬酰胺。
具体实施方式
实施例1.菌株E.coli11022S/pET28-asnA的构建
利用天根基因组提取试剂盒提取大肠杆菌JM109的基因组DNA，以其为模板，以引物AsnAU（5’-GCCGAATTCATGAAAACCGCTTAC-3’，携带EcoRI酶切位点）；AsnAD（5’-GTTAAGCTTTTACAGCAGAGAAGGGAC-3’，携带HindIII酶切位点）扩增asnA基因。随后以EcoRI/HindIII同时酶切处理扩增的asnA基因和载体pET28a(+)，纯化后采用T4DNA连接酶连接，转化E.coliCICC11022S感受态细胞，挑取转化子培养并提取质粒，进行PCR及酶切鉴定后，测序分析，获得基因工程菌株，命名为E.coli11022S/pET28-asnA，于CICC保藏，保藏号：CICC11033S。
实施例2.E.coli11022S/pET28-asnACICC11033S的发酵
将基因工程菌接种到发酵培养基（1L水中加入富马酸10g，玉米浆干粉10g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钠1.5g，氨水调节pH6.5-7.5，卡那霉素0.05g）中，37±1oC摇床培养12±2h，获得种子液。随后将种子液以0.1-5%接种量转接到发酵培养基中，37±1oC，220rpm摇床培养2-3h，加入2g/L乳糖，20-25oC，160rpm诱导表达12±2h，获得发酵液。
实施例3.E.coli11022S/pET28-asnACICC11033S全细胞高密度转化生产l-天冬酰胺
富马酸溶液0.8-1.2M，以氨水调pH7-9，葡萄糖0.01-0.03M，氯化镁1-3mM，菌体浓度为OD600nm=10-20的转化体系于25-50oC，30-80rpm搅拌转化6-14h，定时取样采用柱前衍生-HPLC方法检测富马酸、l-天冬氨酸及l-天冬酰胺，筛选优选条件。随后采用优选条件，将116g富马酸加入转化罐中，加入800mL的水，然后边搅拌边加入氨水，并以pH计测定溶液pH变化情况，待富马酸完全溶解，再以氨水调节pH为8.0，加入终浓度0.02M葡萄糖，2mM氯化镁，定容1L。将发酵液离心收集菌体，生理盐水悬浮后，加入富马酸铵溶液中，至菌体密度OD600nm=12。调节温度37oC，转速50rpm，HPLC定量检测富马酸、l-天冬氨酸和l-天冬酰胺（附图2）。转化10h后，富马酸转化率94.7%，l-天冬酰胺的产量可达125.1g/L，生产速率12.51g/L。
<110>中国食品发酵工业研究院
<120>一株高效转化富马酸生产L-天冬酰胺的工程菌及其应用
<141>2015-07-20
<160>1
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<210>1
<211>993
<212>DNA
<213>大肠杆菌属
<221>asnA
<222>(1)…(993)
<400>1
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Claims (5)
1.本发明公开一株基因工程菌E.coli11022S/pET28-asnACICC11033S。
2.如权利要求1所述基因工程菌株，是一株用于生产l-天冬酰胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是含有l-天冬酰胺合成酶基因载体pET28-asnA，宿主为高产L-天冬氨酸酶的E.coliCICC11022S，l-天冬酰胺合成酶基因来源于E.coliJM109或者其他能够表达相同功能酶的微生物。
3.如权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，可以高效表达l-天冬酰胺合成酶和L-天冬氨酸酶，并转化富马酸生产l-天冬酰胺；转化体系以氨水调pH7-9，葡萄糖0.01-0.03M（或0.8-1.2MATP），氯化镁1-3mM，富马酸0.8-1.2M，菌体浓度为OD600nm=10-20，25-50oC，30-80rpm搅拌，转化6-14h。
4.如权利要求3所述转化过程，优选体系为pH8.0，0.02M葡萄糖，2mM氯化镁，底物富马酸浓度为1M，菌体浓度为OD600=12，37oC，50rpm，10h。
5.如权利要求3所述转化过程，葡萄糖通过活菌体细胞ATP再生系统产生ATP，为L-天冬酰胺合成酶转化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺提供ATP。
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