CN104130967B - 一株共表达l‑乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株共表达L‑乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌，其特征在于，它是导入了来源于凝结芽孢杆菌的L‑乳酸脱氢酶基因ldhL和来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh的大肠杆菌；其中，所述的L‑乳酸脱氢酶基因ldhL，其核苷酸序列的GenBank登记号为KF386111；所述的甲酸脱氢酶基因fdh，其核苷酸序列的GenBank登记号为AJ011046。本发明还公开了上述重组大肠干菌的构建方法和应用。本发明方法具有操作简单，成本低，产物合成效率高，光学纯度高的特点，为生物合成L‑苯乳酸提供了有效途径。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，又名3-苯基乳酸或β-苯乳酸，是近年来发现的一种新型天然防腐剂，它具有较广的抑菌谱，不仅能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，对引起食物腐败的多种霉菌等真菌也有明显的抑制作用，且安全性能高，在食品工业中具有较好的应用前景。此外，苯乳酸还是多种药物的前体，苯乳酸的衍生物丹参素(3,4-二羟基苯基乳酸)具有抑制血小板凝集和扩张冠状动脉的作用，因而具有重要的医药应用价值。苯乳酸α位的碳原子是手性碳原子，故有两种对映体，L-苯乳酸和D-苯乳酸。L-苯乳酸和D-苯乳酸具有不同的光学性质，也具有不同的生物活性。
苯乳酸合成方法有化学合成法和生物转化法两种。由于化学合成法具有技术复杂、污染环境等缺点，目前更多的是采用生物转化法，主要包括乳酸菌发酵和酶催化。乳酸菌发酵合成苯乳酸过程中，不仅同时有L-苯乳酸和D-苯乳酸生成，还往往伴随乳酸等有机酸的生成，难以获得高光学纯度的L-苯乳酸。体外酶催化反应过程中酶易受外界环境影响，底物耐受性差，活力损失快，同时需要外源添加价格昂贵的辅酶NADH，也不适宜工业应用。目前尚未有简单高效的L-苯乳酸合成技术相关报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一株共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述大肠杆菌在催化合成L-苯乳酸中的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌，其特征在于，它是导入了来源于凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因ldhL和来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh的大肠杆菌；
其中，所述的L-乳酸脱氢酶基因ldhL，其核苷酸序列的GenBank登记号为KF386111；所述的甲酸脱氢酶基因fdh，其核苷酸序列的GenBank登记号为AJ011046。
以上所述的共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，将来源于凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因ldhL和来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh分别克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1的多克隆位点1和多克隆位点2处，得到重组质粒pETDuet-ldhL-fdh，将该质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21，利用氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)。
以上所述的共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌在催化制备L-苯乳酸中的应用。
其中，所述的应用包括如下步骤：
(1)细胞的准备：将重组大肠杆菌按体积比为0.1～3％的量转接到发酵培养基中，当细胞OD600达到0.4～0.8后，加入终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG，在16～30℃继续培养1～12h，培养结束后，收集重组大肠杆菌；
(2)催化方法：将步骤(1)中得到的重组大肠杆菌加入含有苯丙酮酸和甲酸钠的反应体系中，催化制备L-苯乳酸。
其中，步骤(1)中，所述的发酵培养基为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素100mg/L。
其中，步骤(2)中，反应的温度为在20～70℃，优选为35～55℃，最优选37℃。
其中，步骤(2)中，反应的时间为5min～10h，优选为0.5～2h。
其中，重组大肠杆菌的干菌添加量为1～36g/L，优选为10～30g/L。
其中，步骤(2)中，所述的反应体系，其苯丙酮酸的初始浓度为1～100mmol/L，优选为50～100mmol/L。
其中，步骤(2)中，所述的反应体系，其甲酸钠的初始浓度为1～200mmol/L，优选为100～200mmol/L。
其中，步骤(2)中，所述的反应体系，其初始pH值为3～9，优选为5～7。
有益效果：
本发明具有如下显著的特征和效果：
(1)所得L-苯乳酸光学纯度高，产率高，合成效率高，同时全细胞催化法反应体系成分简单，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
(2)不需要添加辅酶，而且增加了酶的稳定性，生物转化过程操作简单，成本低，产物光学纯度高，副产物少，后续分离简单。
附图说明
图1 pETDuet-ldhL-fdh质粒的图谱。
图2 L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和甲酸脱氢酶(FDH)共表达后的SDS-PAGE图谱。
图3利用共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌细胞催化制备L-苯乳酸所得产物光学纯度检测液相色谱图。A为D-苯乳酸标准品，B为L-苯乳酸标准品，C为细胞转化液样品。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中L-苯乳酸产量的检测方法如下：将反应混合物离心除去菌体，稀释上清液并用0.22微米滤膜过滤，采用Agilent 1200液相色谱仪，配备ZORBAX 300 SB C18(4.6×250mm)分离柱，流动相为85％的1mmol/L硫酸和15％的乙腈，流速为0.7mL/min，进样量5μL，紫外检测器，检测波长为210nm，柱温箱温度为30℃。
以下实施例中L-苯乳酸纯度的检测方法如下：将反应混合物离心除去菌体，稀释上清液并用0.22微米滤膜过滤，采用Agilent 1200液相色谱仪，配备MCI GEL CRS10W(4.6×50mm)手性分离柱，流动相为85％的2mmol/L硫酸铜和15％的乙腈，流速为0.7mL/min，进样量10μL，紫外检测器，检测波长为254nm，柱温箱温度为25℃。
实施例1：大肠杆菌基因工程菌株E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)的构建。
(1)甲酸脱氢酶基因fdh基因的获得与重组质粒pETDuet-fdh的构建。
大肠杆菌表达质粒pETDuet-1(Novagen)有两个多克隆位点，可以同时表达两个目的基因。首先通过化学合成法合成编码本发明中博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh(GenBank登记号为AJ011046)，并在序列两端引入能插入pETDuet-1质粒多克隆位点2处的Nde I和Xho I酶切位点，将其双酶切后连接到pETDuet-1质粒中，转化到大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄青霉素抗性筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析，验证得到载有fdh基因的重组质粒pETDuet-fdh。
(2)L-乳酸脱氢酶ldhL基因的获得与重组质粒pEasy-Blunt-ldhL的构建。
设计引物，引入能插入pETDuet-1质粒多克隆位点1处的的BamH I和Sac I酶切位点，序列如下：
ldhL.f：5’-GGATCCGATGAAAAAGGTCAATCGTATTGCAG-3’
ldhL.r：5’-GAGCTCTTACAATACAGGTGCCATCGTTTC-3’
以凝结芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增总体系为100μL，含超纯水64μL，5×FastPfu PCR Buffer 20μL，dNTPs 0.25 mmol/L，引物各0.2～0.4μmol/L，模板50～200ng，TransGen公司的FastPfu DNA Polymerase 5 U。PCR扩增条件为：95℃预变性2分钟，按如下参数30个循环(95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒)，循环结束后72℃延伸5分钟。PCR反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。将PCR反应获得的产物回收后连接到TransGen公司的pEasy-Blunt克隆载体，转化大肠杆菌Mach1-T1感受态细胞，经过氨苄青霉素抗性筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析，验证得到载有ldhL基因的重组质粒pEasy-Blunt-ldhL。
(3)pETDuet-ldhL-fdh质粒的构建。
将重组质粒pETDuet-fdh和pEasy-Blunt-ldhL分别用BamH I和Sac I双酶切处理，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后采用NEB公司的T4 DNA连接酶22℃连接1小时后转化大肠杆菌Mach1-T1感受态细胞，经过氨苄青霉素抗性筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析，验证得到载有ldhL基因和fdh基因的重组质粒pETDuet-ldhL-fdh，随后将重组质粒pETDuet-ldhL-fdh转化导入大肠杆菌BL21(DE3)，经氨苄青霉素筛选获得的阳性克隆菌株命名为E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)。
实施例2：L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)中的偶联表达。
将实施例1筛选到的正确重组菌株E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)接种于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养12小时，转接于1L含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养，当培养液OD600nm达到0.4～0.8后加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，25℃继续培养5小时。诱导培养结束后，于12,000转/分钟离心5分钟，获得细胞沉淀，生理盐水洗涤两次后，重悬于100mL pH7.4、50mmol/L的磷酸盐缓冲液中。在冰水混合物中利用超声波破碎细胞壁，破碎时间为30分钟，破壁后的溶液以16,000转/分钟离心60分钟，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE检测蛋白表达情况(图2)。
实施例3：E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)在不同pH条件下生产L-苯乳酸。
在10mL反应体系中，分别加入50mmol/L底物苯丙酮酸、100mmol/L辅助底物甲酸钠，干重为7g/L的重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在37℃恒温摇床上振荡反应，反应体系的pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，1小时后将反应混合物离心除去菌体，取上清液检测生成的L-苯乳酸产量和光学纯度，结果显示(表1)，反应体系pH在5.5～6.0时，L-苯乳酸产量最高，为40.1mmol/L，L-苯乳酸光学纯度大于99.9％。
表1不同pH条件下L-苯乳酸产量
| pH | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 |
| L-苯乳酸产量(mmol/L) | 36.3 | 40.1 | 39.5 | 34.8 | 27.8 | 17.6 |
实施例4：E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)在不同苯丙酮酸浓度条件下生产L-苯乳酸。
在10mL反应体系中，分别加入浓度为50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L和100mmol/L的底物苯丙酮酸、相应分别加入浓度为100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、160mmol/L、180mmol/L和200mmol/L的辅助底物甲酸钠，干重为7g/L重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在37℃恒温摇床上振荡反应，反应体系的pH为6.0，1小时后将反应混合物离心除去菌体，取上清液检测生成的L-苯乳酸产量和光学纯度，结果显示(表2)，苯丙酮酸浓度低于90mmol/L时，L-苯乳酸产量随苯丙酮酸浓度升高而升高，L-苯乳酸最高产量为56.7mmol/L，光学纯度大于99.9％。当苯丙酮酸浓度继续增加时，L-苯乳酸产量出现下降。
表2不同苯丙酮酸浓度条件下L-苯乳酸产量
| 苯丙酮酸浓度(mmol/L) | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 |
续表2
| L-苯乳酸产量(mmol/L) | 42.2 | 47.9 | 51.8 | 53.8 | 56.7 | 55.5 |
实施例5：E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)在不同菌体浓度条件下生产L-苯乳酸。
在10mL反应体系中，分别加入60mmol/L底物苯丙酮酸、120mmol/L辅助底物甲酸钠，干重分别为9g/L、18g/L、27g/L和36g/L的重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在37℃恒温摇床上振荡反应，反应体系的pH为6.0，0.5小时后将反应混合物离心除去菌体，取上清液检测生成的L-苯乳酸产量和光学纯度，结果显示(表3)，干重为18g/L、27g/L和36g/L的重组大肠杆菌湿菌体生产的L-苯乳酸产量高于干重为9g/L的重组大肠杆菌湿菌体生产的L-苯乳酸产量，但三者差别不大，L-苯乳酸最高产量为53.1mmol/L，光学纯度大于99.9％。
表3不同菌体浓度条件下L-苯乳酸产量
| 菌体干重(g/L) | 9 | 18 | 27 | 36 |
| L-苯乳酸产量(mmol/L) | 31.8 | 50.4 | 53.1 | 53.0 |
实施例6：E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)在优化后的条件下生产L-苯乳酸。
在10mL反应体系中，分别加入90mmol/L底物苯丙酮酸、180mmol/L辅助底物甲酸钠，干重为18g/L的重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在37℃恒温摇床上振荡反应，反应体系的pH为6.0，分别在反应0、6、12、18、24、30和40分钟后取样检测生成的L-苯乳酸产量和光学纯度，结果显示，L-苯乳酸产量随时间延长而升高，L-苯乳酸最高产量为80mmol/L，光学纯度大于99.9％(图3)。
Claims (7)
1.共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌在催化制备L-苯乳酸中的应用，
所述共表达L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌是导入了来源于凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因ldhL和来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh的大肠杆菌；
其中，所述的L-乳酸脱氢酶基因ldhL，其核苷酸序列的GenBank登记号为KF386111；所述的甲酸脱氢酶基因fdh，其核苷酸序列的GenBank登记号为AJ011046；
其中，将来源于凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因ldhL和来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因fdh分别克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1的多克隆位点1和多克隆位点2处，得到重组质粒pETDuet-ldhL-fdh，将该质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21，利用氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌E.coli BL21(pETDuet-ldhL-fdh)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)细胞的准备：将重组大肠杆菌按体积比为0.1～3％的量转接到发酵培养基中，当细胞OD600达到0.4～0.8后，加入终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG，在16～30℃继续培养1～12h，培养结束后，收集重组大肠杆菌；
(2)催化方法：将步骤(1)中得到的重组大肠杆菌加入含有苯丙酮酸和甲酸钠的反应体系中，在20～70℃条件下反应5min～10h催化制备L-苯乳酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的发酵培养基为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄青霉素100mg/L。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，重组大肠杆菌的干菌添加量为1～36g/L。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的反应体系，其苯丙酮酸的初始浓度为1～100mmol/L。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的反应体系，其甲酸钠的初始浓度为1～200mmol/L。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的反应体系，其初始pH值为5～7.5。
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Effective date of registration: 20181022 Address after: 810000 Qinghai Xining biological science and Technology Industrial Park, No. four road 10. Patentee after: Van Neng special sugar industry Co., Ltd. Address before: 210037 Xinzhuang 9, long pan Road, Nanjing, Jiangsu Patentee before: Nanjing Forestry University |
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Effective date of registration: 20200214 Address after: 518000 floor 28-03, Weisheng technology building, No. 9966, Shennan Avenue, Maling community, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: Shenzhen hualikang fiber Biotechnology Co., Ltd Address before: 810000 Xining biological science and Technology Industrial Park, No. four, No. 10, Qinghai Patentee before: Van Neng special sugar industry Co., Ltd. |