CN108192930A - 一种木糖醇的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木糖醇的制备方法，木糖、葡萄糖、木糖还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶、CaCO3和水形成生物催化体系，催化木糖发生还原反应生成木糖醇，催化木糖发生还原反应生成木糖醇。具体地，以木糖还原酶和NADPH作为催化体系催化木糖发生还原反应生成木糖醇；以葡萄糖脱氢酶作为NADPH的再生催化剂，催化葡萄糖发生氧化反应生成葡萄糖酸，并催化NADP+发生还原反应生成NADPH。采用双酶催化生产木糖醇，反应24h后木糖和葡萄糖完全消耗，产物中木糖醇的转化率为98％，浓度可达146.23g/L；葡萄糖酸的转化率为95％，浓度可达185.05g/L。

Description

一种木糖醇的制备方法
技术领域
本发明涉及糖醇，具体涉及一种木糖醇的制备方法。
背景技术
木糖醇是一种五碳糖醇，是木糖代谢的中间产物，在自然界中广泛存在于果品、蔬菜和一些植物中，但含量较低，不适于大量提取。自19世纪60年代开始，木糖醇便被用作食品添加剂以及甜味剂，近年来，它在食品配料中的应用不断扩大，主要是由于它的物理化学特性：较高的化学和生物稳定性使它可以作为食品保藏剂用以延长食品产品货架期；同时它不与氨基酸发生美拉德反应，不会降低蛋白的营养价值；木糖醇的甜度与蔗糖相当，但是热值却远低于蔗糖，是现代人维持健康体型同时满足甜味需求的食品之一；由于具有较高的溶解热，木糖醇常被用来添加在口香糖果制品、巧克力中发挥其口感凉爽作用。此外，木糖醇还可以用作抗氧化剂、保湿剂、稳定剂、低温防护剂等。
木糖醇在医药和食品领域中的应用最广泛，此外木糖醇还广泛应用于造纸业、国防工业、皮革、蓄电池、化工行业等领域。木糖醇脱水后羟基可以和硝基反应生成爆炸性能良好的三硝基木糖醇或五硝基木糖醇，且爆破性能介于甘油和TNT之间，因此在国内外常被用于采矿业和国防工业；木糖醇还可以作为硬质泡沫塑料的原料应用在塑料工业中，由于它比以甘油为原料的同类产品硬度大，因此可以在石油、化工部门应用为耐火性绝缘材料；木糖醇还可以增加塑料的相容性，提高塑料产品质量，因此可以作为聚氨乙烯树脂塑料的添加剂；由于木糖醇在一定条件下具有吸湿性，且具有独特的防龋齿功效，可替代甘油在牙膏中的作用；在造纸工业中可以做塑化剂生产羊皮纸、铜版纸、玻璃纸等。木糖醇于2004年被美国能源部可再生资源办公室列为十二种优先开发利用的平台化合物之一。
2012年，木糖醇的市场规模达5.4亿美元左右，按2.4万元/吨计算，市场需求15万吨。我国年产量不足3万吨，对于木糖醇仍有很高的需求量。
目前合成木糖醇的方法主要有三种：化学合成、生物合成以及固液萃取法。然而由于固液萃取法原料消耗大、成分复杂，分离纯化有很大困难且不经济，不适用于大规模的木糖醇生产。化学法生产是目前工业化生产木糖醇常用的方法，有关生物法规模化生产木糖醇的报道仍少见。
化学法生产木糖醇是20世纪70年代于芬兰研究并实施的，主要包括半纤维素的酸解、木糖的提纯、木糖催化加氢、木糖醇结晶等步骤。整个工艺始于半纤维素的酸水解，由于半纤维素成分复杂，必须先对水解液进行脱毒与脱盐处理然后分离得到纯木糖，对纯木糖进行催化加氢得到木糖醇，木糖醇的得率只有50％～60％。然后对产物进行分离纯化得到产品木糖醇。高纯度的木糖是化学法最大的成本所在。
目前，生物法生产木糖醇主要集中于微生物发酵的研究。微生物发酵法主要是利用细菌、真菌等微生物发酵生产木糖醇。多数微生物特别是大肠杆菌可以利用水解液中的糖类，所以不需要分离纯化得到木糖。其次，可通过改造宿主菌的代谢途径，加快微生物对杂糖的利用速度，产物中也不会存在杂醇，无需对产物进行复杂的分离。整个过程避免了许多繁琐与复杂的分离过程，大幅降低了生产成本。因此，过去十几年大量研究致力于开发微生物菌株生产木糖醇，使其成为最合适的木糖醇的生产方法。
由于细菌代谢路径复杂，发酵法生产往往不能有效控制木糖利用途径，而且即使是在有碳源存在的条件下,木糖醇依然能够被包括大肠杆菌在内的多种微生物所利用，木糖醇被转运进细胞后磷酸化生成5-磷酸-木糖醇不能被细菌进一步代谢利用,并且对细胞产生一定的毒性。
发明内容
发明目的：为了解决现有酶法制备木糖醇过程中辅酶的用量太大和反应体系pH需要连续调节的问题，本发明提供了一种木糖醇的制备方法。
技术方案：本发明所述一种木糖醇的制备方法，木糖、葡萄糖、木糖还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶、CaCO3和水形成生物催化体系，催化木糖发生还原反应生成木糖醇。具体地，以木糖还原酶和NADPH作为催化体系催化木糖发生还原反应生成木糖醇；以葡萄糖脱氢酶作为NADPH的再生催化剂，催化葡萄糖发生氧化反应生成葡萄糖酸，并催化NADP+发生还原反应生成NADPH。
所述木糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1～1M；所述葡萄糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1～1M。
所述木糖还原酶在生物催化体系中的用量为4～8U/mL。其中，木糖还原酶的酶活定义为：用紫外分光光度仪在340nm处检测酶活性，检测条件为：25℃，在pH＝7的50mM的Tris-HCl缓冲液中反应，酶活用1分钟内NADPH的消耗量来表示。
所述木糖还原酶可以为商品酶；优选地，所述木糖还原酶由重组大肠杆菌表达，所述木糖还原酶的表达和提取步骤如下：
(1)将木糖还原酶基因进行密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)将步骤(1)得到的优化的木糖还原酶基因亚克隆至质粒pET-28a上，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入E.coli.BL21中，得到重组大肠杆菌；
(4)将步骤(3)得到的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中进行活化；
(5)将步骤(4)得到的活化的重组大肠杆菌转接于含卡那霉素的LB液体培养基中继续培养，当OD600达到0.6～0.8时，向所述LB液体培养基中添加IPTG，诱导木糖还原酶的表达，所述IPTG在LB液体培养基中的浓度为0.8～1.2mM；
(6)收集步骤(5)得到的菌体进行超声破碎，然后进行离心，上清液即为粗酶液。
其中，步骤(1)中密码子优化的步骤如下，稀有密码子的分析：稀有密码子主要通过软件E.coli Codon Usage Analysis 2.0分析得到在大肠杆菌中的使用相对频率低于阈值(10‰)的密码子。优化稀有密码子：根据不同密码子在大肠杆菌中的使用频率将使用频率低于阈值的密码子进行优化。按照大肠杆菌的密码子偏好对木糖还原酶基因序列进行优化，优化后其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
步骤(2)中将优化的木糖还原酶基因亚克隆于质粒pET-28a的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间，即构成重组质粒
步骤(5)中LB液体培养基中添加IPTG后，在18℃，200rpm培养12h进行木糖还原酶的诱导表达。
所述葡萄糖脱氢酶在生物催化体系中的用量为5～25U/mL。其中，葡萄糖脱氢酶的酶活定义：用紫外分光光度仪在340nm处检测酶活性，检测条件为：25℃，在pH＝7的50mM的tris-HCl缓冲液中反应，酶活用1分钟内NADPH的生成量来表示。
所述辅酶为NADPH，所述NADPH在生物催化体系中的浓度为0.5～20mM。木糖还原酶为辅酶依赖型还原酶，在催化木糖发生还原反应生成木糖醇时，NADPH被氧化为NADP+；葡萄糖脱氢酶在催化葡萄糖发生氧化反应生成葡萄糖酸时，NADP+被还原为NADPH，实现了辅酶的再生，继续催化木糖发生还原反应。
所述CaCO3在生物催化体系中的浓度为0.05～1g/mL。葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖生成的葡萄糖酸会降低生物催化体系的pH，加入CaCO3的目的是维持反应的pH。
所述反应温度为23～27℃，反应时间为4～24h。
有益效果：(1)针对目前发酵法生产效率低的问题，本专利申请采用酶催化生产木糖醇，用于提高木糖转化率和产物中木糖醇的浓度，并且联产高价值的葡萄糖酸，同时首次在酶催化过程中运用CaCO3稳定反应体系pH，达到节约生产成本的目的；以木糖还原酶和NADPH作为催化体系催化木糖发生还原反应生成木糖醇；以葡萄糖脱氢酶作为NADPH的再生催化剂，催化葡萄糖发生氧化反应生成葡萄糖酸，并催化NADP+发生还原反应生成NADPH，实现了辅酶的再生；(2)采用双酶催化生产木糖醇，反应24h后木糖和葡萄糖完全消耗，产物中木糖醇的转化率为98％，浓度可达146.23g/L；葡萄糖的转化率为95％，浓度可达185.05g/L。(3)反应过程中pH快速下降，使用CaCO3能有效稳定pH并使酶长期保持活性，免去了自动滴定仪的使用，为扩大化生产大大降低成本。
附图说明
图1为重组质粒的图谱；
图2为重组质粒的电泳图；
图3为重组大肠杆菌中木糖还原酶基因的电泳图；
图4为重组大肠杆菌表达的木糖还原酶的电泳图。
具体实施方式
实施例1木糖还原酶的诱导和表达
1、在NCBI数据库中查找到热带假丝酵母Candida tropicalis IFO 0618的木糖还原酶基因序列(GenBank:AB002105.2)，按照大肠杆菌的密码子偏好对木糖还原酶基因序列进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列由金唯智公司合成。
稀有密码子的分析：稀有密码子主要通过软件E.coli Codon Usage Analysis2.0分析得到在大肠杆菌中的使用相对频率低于阈值(10‰)的密码子。
优化稀有密码子：根据不同密码子在大肠杆菌中的使用频率将使用频率低于阈值的密码子进行优化。
将优化的木糖还原酶基因亚克隆于质粒pET-28a的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间，即构成重组质粒，质粒由金唯智公司合成，步骤如下：
(1)利用金唯智自有技术合成扩增DNA序列Candida tropicalis优化后的目的基因所需引物。
(2)使用步骤(1)得到的DNA扩增引物进行高保真聚合酶扩增，扩增后的目的片段使用胶回收试剂盒回收，Candida tropicalis木糖还原酶基因克隆位点为5'EcoRI/3'HindIII；载体pET-28a使用限制性内切酶EcoRI/HindIII酶切，保存待用。
(3)使用多段重组酶将Candida tropicalis插入片段和上述以限制性内切酶EcoRI/HindIII双酶切线性化后的pET-28a酶切产物分别进行重组反应，取连接后产物转化至DH5a大肠杆菌感受态细胞(自制)中，将转化菌均匀涂布在含有卡那霉素抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
多段重组体系：
基因片段6μL
酶切后载体3μL
多段重组酶(含Buffer)11μL
50℃反应1h
(4)通过菌落PCR进行阳性克隆鉴定。用无菌的牙签将单个菌落挑至200μL LB培养基中混匀，37℃培养3h。
(5)选取克隆作DNA测序
根据测序结果，确认正确克隆，需要制备质粒时，将对应的菌接种至4mL含有卡那霉素LB培养基中抽提质粒。重组质粒的图谱见图1，重组质粒的电泳图见图2。
2、构建好的重组质粒通过热激转化导入E.coli BL21(DE3)菌株，具体步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中取出E.coli BL21((DE3)的感受态细胞(SangonBiotech Order NO.B528414)，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上；
(2)加入步骤1得到的重组质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μL)，轻轻摇匀，冰上放置30min后，42℃水浴90s，热激后迅速置于冰上冷却5min；
(3)向步骤(2)得到的体系中加入1mL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达卡那霉素抗性基因；
其中，LB液体培养基配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
(4)将步骤(3)得到的菌液摇匀后取80μL涂布于含卡那霉素的LB筛选平板上，37℃培养12h。同时设置两组对照，对照一：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其他操作相同，正常情况下在含抗性的LB筛选平板上应该不生长；对照二：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取菌液涂布于不含抗性的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落；
其中，含卡那霉素的LB筛选平板的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，卡那霉素终浓度50ug/mL。
LB平板的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L。
3、挑取若干在含卡那霉素的LB筛选平板上成功生长的单菌落，转接入含抗性的LB液体培养基继续培养，提取质粒(质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司)，用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切，30℃反应1h，电泳点样结果见图3，标号1、2、5、6为挑点的酶切结果，结果显示能酶切出1000bp左右的条带，与木糖还原酶基因的条带(约为1000bp)相符，表明质粒导入成功；
其中，含抗性的LB液体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素终浓度50ug/mL。
4、将重组大肠杆菌转接于5mL含抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm条件下培养10h，取2mL转接于200mL含抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm条件下培养2h至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度1mM IPTG，在18℃，200rpm条件下培养12h进行木糖还原酶的诱导表达。
5、收集步骤4的菌体，分装，用50mM pH＝7的Tris-HC缓冲液清洗两次，每次离心弃上清，离心条件：6000rpm，4℃，离心10min。然后进行超声破碎，超声条件：200W，15min。超声后的产物离心(6000rpm，4℃，离心20min)，得到的上清即为粗酶液。
6、将步骤5得到的粗酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳结果见图4，与木糖还原酶的条带(约35KD)相符，表明木糖还原酶的诱导表达成功。
7、用紫外分光光度仪在340nm处检测酶活性，检测条件为：25℃，在pH＝7的50mM的Tris-HCl缓冲液中反应，酶活用1分钟内NADPH的消耗量来表示。
粗酶液酶活的检测结果为7U/mg粗酶液。
实施例2
按照如下体系添加进行酶催化反应：
酶解结束后加热使酶失活，经水系滤膜过滤后液相检测产物成分，液相条件：(1)层析柱为Aminex HPX-87C，流动相为超纯水，流速0.6mL/min，柱温80℃，用折光检测仪RID检测。结果显示木糖和葡萄糖已经完全转化。(2)层析柱为Aminex HPX-87H，流动相为5mMH2SO4，流速0.4mL/min，柱温45℃，用折光检测仪RID检测木糖醇含量。产物中木糖醇的转化率为98％，浓度可达146.23g/L；葡萄糖酸的转化率为95％，浓度可达185.05g/L，反应还有极少量的山梨醇和木糖酸生成。
其中，木糖醇的转化率＝产物中木糖醇的质量/底物中木糖的初始质量*100％；
葡萄糖酸的转化率＝产物中葡萄糖酸的质量/底物中葡萄糖的初始质量*100％；
其中，葡萄糖脱氢酶购自Amono公司，酶提取自Bacillus cereus。用紫外分光光度仪在340nm处检测酶活性，检测条件为：25℃，在pH＝7的50mM的tris-HCl缓冲液中反应，酶活用1分钟内NADPH的生成量来表示，结果显示在该条件下的比酶活为14.75U/mg。
实施例3
方法同实施例2，按照如下体系添加进行酶催化反应：
实施例4
方法同实施例2，按照如下体系添加进行酶催化反应：
对比例1
方法同实施例2，不同的是不添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
液相结果显示产物中木糖醇浓度为0.137g/L，木糖醇的转化率：0.09％。
对比例2
方法同实施例2，酶解体系如下：
液相结果显示产物中木糖醇的转化率为75％，浓度可达112.5g/L，木糖剩余浓度为31.2g/L。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种木糖醇的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcacca ccccgacaat tccgaccatc aagctgaaca gcggctatga aatgccgctg 60
gttggcttcg gctgttggaa agtgaccaac gcaaccgccg ccgatcagat ttataacgcc 120
atcaaaaccg gctaccgcct gtttgatggt gccgaggatt acggcaacga gaaagaagtt 180
ggcgagggta tcaaccgcgc aatcaaagaa ggcctggtta agcgcgagga actgttcatc 240
accagcaaac tgtggaacaa cttccatgat ccgaagaacg tggaaaccgc cctgaataag 300
accctgagtg atctgaatct ggattatgtg gatctgttcc tgatccactt cccgatcgcc 360
ttcaaattcg tgccgatcga agagaaatac ccgccgggct tttattgcgg cgatggcgac 420
aacttccact atgaagatgt gccgctgctg gatacctgga aagcactgga aaagctggtg 480
gaagccggca aaatcaaaag catcggcatt agcaacttca ccggcgcact gatctacgat 540
ctgattcgtg gcgccaccat caaaccggca gtgctgcaga ttgaacacca cccgtatctg 600
cagcagccga aactgatcga gtacgtgcag aaagcaggca ttgcaattac cggctacagc 660
agctttggcc cgcagagctt tctggaactg gaaagcaagc gcgccctgaa taccccgacc 720
ctgtttgagc acgagaccat caaactgatc gccgacaaac acggcaaaag cccggcacag 780
gttctgctgc gctgggcaac acagcgcaac atcgccgtga ttccgaagag caataatccg 840
gagcgcctgg cacagaacct gagcgtggtt gatttcgacc tgaccaagga cgacctggat 900
aacatcgcca aactggacat cggcctgcgc ttcaatgatc cgtgggattg ggacaacatc 960
ccgatttttg tt 972

Claims (9)

1.一种木糖醇的制备方法，其特征在于，木糖、葡萄糖、木糖还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶、CaCO3和水形成生物催化体系，催化木糖发生还原反应生成木糖醇。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1～1M。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖在生物催化体系中的初始浓度为0.1～1M。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木糖还原酶在生物催化体系中的用量为4～8U/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木糖还原酶由重组大肠杆菌表达，所述木糖还原酶的表达和提取步骤如下：
(1)将木糖还原酶基因进行密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)将步骤(1)得到的优化的木糖还原酶基因亚克隆至质粒pET-28a上，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入E.coli.BL21中，得到重组大肠杆菌；
(4)将步骤(3)得到的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中进行活化；
(5)将步骤(4)得到的活化的重组大肠杆菌转接于含卡那霉素的LB液体培养基中继续培养，当OD600达到0.6～0.8时，向所述LB液体培养基中添加IPTG，诱导木糖还原酶的表达，所述IPTG在LB液体培养基中的浓度为0.8～1.2mM；
(6)收集步骤(5)得到的菌体进行超声破碎，然后进行离心，上清液即为粗酶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶在生物催化体系中的用量为5～25U/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辅酶为NADPH，所述NADPH在生物催化体系中的浓度为0.5～20mM。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CaCO3在生物催化体系中的浓度为0.05～1g/mL。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为23～27℃，反应时间为4～24h。
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