CN108977432A

CN108977432A - 重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用

Info

Publication number: CN108977432A
Application number: CN201810839980.2A
Authority: CN
Inventors: 金利群; 郑裕国; 柳志强; 许韦; 徐建妙; 贾东旭
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN108977432B

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用，所述固定化细胞是将木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因共同导入宿主大肠杆菌，获得含有双酶基因的重组大肠杆菌，然后将重组大肠杆菌进行发酵培养，取湿菌体细胞进行固定化，获得重组大肠杆菌固定化细胞。本发明重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet‑1‑XR‑GDH实现了木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶共表达，其双酶偶联体系不需要额外的辅酶添加，生产方法简单、高效，时空产率远高于发酵法，木糖母液中木糖转化率达到99％以上，利用葡萄糖为辅底物，该重组细胞催化200g/L木糖，反应30h后，木糖醇产率为100％。

Description

重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用

技术领域

本发明涉及一株基因工程菌株及其在利用木糖母液生产木糖醇中的应用，属于生物催化技术领域。

背景技术

木糖母液是以玉米芯、甘蔗渣等生物质资源利用化学法生产木糖后剩余的废糖液，是木糖结晶后留下的颜色较深的粘稠液体，一般来说木糖母液中含有约50～60％的糖，里面含有木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等，其中木糖含40～50％左右。由于生产工艺的原因，木糖母液粘度较大，使得木糖母液无法再次通过浓缩结晶利用单糖。通常情况下，每生产1吨木糖约产生1.5吨木糖母液，其价格低廉，利用率低，造成大量的资源浪费和严重的环境污染，因此木糖母液具有较强的开发应用潜力。目前已有学者通过化学法或者发酵法利用木糖母液，但由于工艺复杂，成本高，产品低廉，因此并未实现工业化大规模应用。中国专利CN104086607B公开了一种从木糖母液中生产L-阿拉伯糖的方法，其利用酵母发酵去除葡萄糖，然后利用色谱分离法获得L-阿拉伯糖和木糖组分，分别结晶得到阿拉伯糖和木糖产品，该方法的缺点在于使用酵母去除葡萄糖的操作复杂，并且木糖利用价值与木糖醇相比较低。中国专利CN102603814B公开了一种提高木糖母液中结晶效率的方法，其中利用酵母发酵去除葡萄糖和半乳糖，然后膜分离去除胶体、蛋白等杂质，得到主要含木糖和阿拉伯糖的清液，该方法存在发酵步骤较复杂，并且产物附加值较低，限制了其应用范围。中国专利CN107384815A公开了一株酿酒酵母工程菌株，通过发酵法利用木糖母液生产木糖醇，发酵60h后转化率达到理论值100％，该方法存在发酵周期过长，菌体重复使用困难，时空产率较低，不能达到工业化生产的要求。

相比较于化学法与发酵法，生物转化法具有反应条件简单，生产效率高等优势，因此利用生物转化法实现木糖母液的回用是一种颇有前景的方法。通过具有高催化活性的木糖还原酶催化木糖母液获得木糖醇，再根据糖醇性质差异，从转化液中分离回收木糖醇与阿拉伯糖，大大提高了木糖母液的附加值，并且解决了木糖和阿拉伯糖难于分离的问题。同时固定化技术的开发应用可以有效稳定生物催化剂酶活，提高操作稳定性，降低生产成本，提高利用。发明人构建了一株木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶共表达基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH，木糖还原酶(Xylose Reductase，XR，Rhizopus oryzae AS3.819)与葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase，GDH，Exiguobacterium sibiricum 255-15)构成辅酶循环体系，无需额外添加昂贵的辅酶，实现胞内辅酶循环，该菌株具有高效催化木糖制备木糖醇的活性，基于该重组菌建立的固定化细胞催化木糖母液制备木糖醇的工艺，可实现木糖母液的高效利用，具有较好的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株重组大肠杆菌及其在利用木糖母液生产木糖醇中的应用。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种重组大肠杆菌固定化细胞，所述固定化细胞是将木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因共同导入宿主大肠杆菌，获得含有双酶基因的重组大肠杆菌，然后将重组大肠杆菌进行发酵培养，取湿菌体细胞进行固定化，获得重组大肠杆菌固定化细胞。

进一步，所述木糖还原酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述发酵培养方法为：将重组大肠杆菌接种至含终浓度50μg/mL链霉素的LB液体培养基，37℃，150rpm培养2-8h，以体积浓度2％的接种量转接至新的含终浓度50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，于37℃，150rpm条件下培养至OD值0.6-0.8，再加入终浓度0.1mM IPTG，25℃条件下诱导12h，离心，获得湿菌体细胞。

进一步，本发明重组大肠杆菌通过不同的固定化方法进行全细胞固定，以维持胞内辅酶循环体系完整，其中固定化方法包括包埋法、吸附法、交联法和仿生矿化法，优选所述固定法方法为：称取湿菌体细胞于pH为8.5的磷酸盐缓冲液中，加入吸附载体，室温搅拌，再加入聚乙烯亚胺搅拌均匀，最后加入戊二醛，室温交联反应2h，抽滤后，滤饼用去离子水洗涤三次，得到固定化细胞；所述吸附载体为硅藻土、膨润土或活性炭；所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为100g/L，所述吸附载体加入量以缓冲液体积计为6g/L，所述聚乙烯亚胺加入体积终浓度为5％，戊二醛加入体积终浓度为50％；所述活性炭在使用前先进行活化：将活性炭过40目筛，浸入1M盐酸中，50℃搅拌1h，抽滤，用蒸馏水冲洗至滤液呈中性，放入烘箱烘干，获得活化后的活性炭。

本发明还提供一种所述重组大肠杆菌固定化细胞在利用木糖母液制备木糖醇中的应用，所述应用方法为：以pH5.0～9.0(优选pH8.0)的磷酸缓冲液为反应介质，以重组大肠杆菌固定化细胞为催化剂，以木糖母液为底物，以葡萄糖为辅助底物构成反应体系，在20～45℃(优选30℃)、100～600rpm(优选150rpm)条件下进行反应，反应完全后，将反应液过滤，滤饼回收催化剂循环利用，滤液分离纯化，获得木糖醇；所述木糖母液为生产糖醇后产生的含木糖废液用活性炭脱色获得的，通常木糖母液在使用前加水调节木糖质量浓度为20-30％。

进一步，所述木糖母液中木糖含量为400～550g/L。

进一步，所述反应体系中，催化剂加入终浓度为20～150g/L(优选100g/L)、所述底物加入终浓度为10～200g/L(优选50g/L)，所述葡萄糖加入终浓度为10～80g/L(优选50g/L)。

进一步，所述木糖母液在使用前先进行脱色预处理，所述脱色预处理方法为：在木糖母液中加入活性炭粉末，在30～60℃(优选35℃)搅拌脱色2h，过滤，收集滤液，获得脱色木糖母液，脱色率达到95％以上；所述活性炭粉末粒径为50～300目，活性炭粉末质量添加终浓度为0.2-3％，优选2％。

本发明所用的基因工程菌的优点在于：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH实现了木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶共表达。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1、本发明重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH实现了木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶共表达，其双酶偶联体系不需要额外的辅酶添加，生产方法简单、高效，时空产率远高于发酵法，木糖母液中木糖转化率达到99％以上，利用葡萄糖为辅底物，该重组细胞催化200g/L木糖，反应30h后，木糖醇产率为100％。

2、固定化细胞与游离酶相比，具有产物易分离、可重复多批次使用等优点，并且全细胞固定后提高了酶的稳定性，简化后期提纯工艺等。固定化细胞可反复使用10个批次催化木糖母液转化为木糖醇，10个批次时空产率为11.51g/(L·h)，为目前所报道的文献中最高时空产率。

3、本发明首次利用生物转化法将木糖母液转化为木糖醇，有效利用了母液中的木糖和葡萄糖，一方面有效处理了工业废料，对资源的优化和环境保护具有重要的意义，另一方面提高了木糖母液的附加值。

附图说明

图1基因工程菌的质粒构建过程。

图2胞内双酶偶联体系辅酶循环示意图。

图3固定化细胞结构电镜图。

图4固定化细胞转化木糖母液操作稳定性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

一般性说明：木糖母液来源于糖醇生产厂家，如下实施例中涉及的木糖母液来自于焦作市华康糖醇科技有限公司，木糖母液的加入量以木糖质量计。本发明实施例中所用脱色木糖母液按如下方法制备：在实施例1木糖母液中加200目活性炭粉末至质量终浓度2％，在35℃搅拌脱色2h，获得脱色木糖母液，脱色率达到95％以上。

本发明所述室温是指25-30℃。

LB液体培养基组成：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，溶剂为去离子水，pH 7.0，121℃灭菌20min补加50μg/mL的硫酸盐链霉素，用于重组菌株的培养。

实施例1木糖母液的组分分析

木糖母液中各组分采用高效液相色谱法进行检测分析，催化木糖母液生成的木糖醇及其副产物检测方法同木糖母液检测方法，高效液相色谱法检测条件如下：液相系统为Waters 2414，RID检测器。检测条件为：色谱柱为BioRad Aminex HPX-87H(300×7.8mm)，柱温60℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6ml/min，进样量为20μL。

样品处理方法：将样品稀释至5g/L左右，于1.2×10⁴rpm离心5min，保留上清液过0.22μm滤膜后进行液相分析。

该方法有效检测出木糖母液中的主要成分，根据保留时间及峰面积确定木糖母液中各组分及其含量，从木糖母液中主要检测到葡萄糖、木糖和阿拉伯糖这三种物质，检测结果及各组分含量如表1所示。

表1木糖母液中各组分含量

实施例2重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH的构建

重组大肠杆菌构建过程：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示木糖还原酶基因XR构建表达质粒pET-28b(+)-XR，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因GDH构建表达质粒pET-28b(+)-GDH。通过质粒提取试剂盒分别提取质粒pET-28b(+)-XR，pET-28b(+)-GDH以及空质粒pCDFDuet-1。通过限制性内切酶NdeⅠ及XhoⅠ分别对pET-28b(+)-GDH质粒及空质粒pCDFDuet-1进行双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳及胶回收试剂盒对GDH基因片段进行胶回收，将GDH基因片段与空质粒pCDFDuet-1的双酶切产物相连接获得质粒pCDFDuet-1-GDH。通过限制性内切酶SalⅠ及HindⅢ分别对pET-28b(+)-XR质粒及质粒pCDFDuet-1-GDH进行双酶切处理，通过琼脂糖凝胶电泳及胶回收试剂盒对XR基因片段进行胶回收，再将pCDFDuet-1-GDH酶切产物与XR基因片段相连接，获得目的质粒pCDFDuet-1-GDH-XR，然后将质粒pCDFDuet-1-GDH-XR导入大肠杆菌，构建重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH。

湿菌体制备方法及过程：将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH接种于含链霉素(终浓度为50μg/mL)的50mL LB液体培养基中，于37℃，150rpm条件下培养8h，以2％(v/v)的接种量转接至100mL含链霉素(终浓度为50μg/mL)LB液体培养基中，于37℃，150rpm条件下培养至菌液的OD值达到0.6-0.8，再向菌液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，于25℃条件下诱导培养12h，将菌液于8000rpm条件下离心10min，弃上清，用生理盐水洗涤两次获得湿菌体。

实施例3E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH全细胞固定化

1、固定化细胞的制备

本发明重组基因工程菌的全细胞的固定选择交联法。

称取2g实施例2得到的湿菌体细胞于20mL、pH为8.5的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度6g/L处理过的活性炭室温搅拌(活性炭处理方法：颗粒活性炭过40目筛，浸入1M盐酸中，50℃搅拌1h。抽滤，用蒸馏水冲洗至滤液呈中性，放入烘箱烘干，待用)，然后加入体积终浓度5％的聚乙烯亚胺搅拌均匀，再加入体积终浓度50％戊二醛，室温交联反应2h。抽滤后，滤饼用去离子水洗涤三次，得到固定化细胞2.8g。

2、固定化细胞活力检测

称取0.7g固定化细胞在pH 8.0的磷酸盐缓冲体系中，30℃，600rpm下以木糖含量10g/L的脱色木糖母液为底物，反应30min测定木糖还原酶酶活，酶活回收率较高，达到了71.8％。

固定化细胞酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 8.0条件下，每分钟生成1μmol木糖醇所需的固定化细胞用量定义为1U。

木糖醇的高效液相色谱法检测条件为Waters 2414液相系统，RID检测器。检测条件为：色谱柱为BioRad Aminex HPX-87H(300×7.8mm)，柱温60℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6ml/min，进样量为20μL。木糖和木糖醇的保留时间分别为9.63min和11.16min。

3、固定化细胞的表面结构观察

固定化细胞的表面结构通过电镜观察，主要操作流程为取样-2.5％戊二醛固定-缓冲液清洗-乙醇梯度脱水-干燥-粘样-镀膜-电镜观察，具体步骤如下：步骤1制备的固定化细胞和实施例2制备的湿菌体细胞(游离细胞)分别用蒸馏水洗净，储存于体积浓度2.5％的戊二醛水溶液中，室温固定过夜，然后用pH 7.0磷酸盐缓冲液清洗三次，每次15min，再依次用体积浓度50％、60％、70％、80％、90％的乙醇水溶液浸泡15min后离心去上清进行梯度脱水，每次脱水15min。脱水后细胞转移到冷冻干燥机中进行干燥，取一小部分样品用导电胶粘在样品托上并在真空镀膜仪中镀膜用于电镜观察(图3)。使用该方法有效观察到固定化细胞呈聚集状态，吸附于载体表面。

实施例4 pH对固定化细胞活力的影响

反应体系10mL：磷酸盐缓冲液pH梯度设为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分别添加脱色木糖母液至木糖终浓度10g/L、终浓度10g/L葡萄糖，实施例3制备的固定化细胞0.7g构成10ml反应体系，在30℃、600rpm下反应30min，取样测定底物质量转化率，结果如表2所示，pH 7.0为固定化体系最适的pH。

表2 pH对固定化细胞活力的影响

其中：木糖转化率＝(木糖初始浓度-木糖终浓度)/木糖初始浓度×100％

实施例5固定化细胞的pH稳定性研究

将实施例3步骤1制备的固定化细胞和实施例2制备的湿菌体细胞(游离细胞)分别存于pH 7.0、8.0、9.0的磷酸盐缓冲液中，置于4℃保存8h，每隔一段时间(分别0.5、1、2、3、4、6、8h取样)取样进行转化反应。

转化体系10mL：在pH值8.0的磷酸盐缓冲液中，添加脱色木糖母液使木糖终浓度为10g/L，终浓度10g/L葡萄糖，终浓度70g/L实施例3制备的固定化细胞或实施例2制备的湿菌体细胞构成10ml反应体系，在30℃、600rpm下以脱色木糖母液为底物，反应30min取样测定酶活性。根据测定结果计算酶活半衰期，pH稳定性结果如表3所示，在pH 7.0的缓冲液中，酶活最稳定，固定化细胞半衰期最长。

表3 pH稳定性

实施例6温度对固定化细胞活力的影响

在20℃-45℃的范围内考察反应温度对固定化细胞催化活性的影响，设20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃六个温度梯度。

反应体系10mL：在pH值8.0的磷酸盐缓冲液中，加入脱色木糖母液使木糖终浓度为10g/L，终浓度为10g/L葡萄糖，终浓度70g/L实施例3制备的固定化细胞构成10ml反应体系，在不同温度、600rpm下反应30min，取样测定木糖醇浓度，并计算转化率，结果如表4所示，固定化细胞最适反应温度为30℃。

表4温度对固定化细胞反应的影响

实施例7固定化细胞的温度稳定性研究

将实施例3步骤1制备的固定化细胞和实施例2制备的湿菌体细胞(游离细胞)分别在25℃、30℃、35℃这三个温度下水浴保温18h，取样测定酶活。

反应体系10mL：在pH值8.0的磷酸盐缓冲液中，加入脱色木糖母液使木糖终浓度为10g/L，终浓度为10g/L葡萄糖，终浓度70g/L保温18h后的实施例3制备的固定化细胞或实施例2制备的湿菌体细胞构成10ml反应体系，分别在25℃、30℃、35℃、600rpm下反应30min取样测定酶活。根据测定结果计算酶活半衰期，温度稳定性的结果如表5所示，固定化细胞稳定性优于游离细胞，在25℃固定化细胞最稳定，半衰期最长。

表5温度稳定性

实施例8不同木糖母液浓度对产率的影响

25mL反应体系组成：磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)，脱色木糖母液中木糖终浓度分别为10g/L、50g/L、100g/L，实施例3制备的固定化细胞加入量70g/L，终浓度50g/L葡萄糖构成25ml反应体系，在25℃，150rpm磁力搅拌下反应10h，取样，测定木糖转化率及木糖醇产率，如表6所示，当底物浓度为50g/L时，时空产率最大，为最适底物浓度。

表6不同底物浓度对反应的影响

其中：木糖醇时空产率＝木糖醇终浓度/反应时间

实施例9固定化细胞转化木糖母液操作稳定性

25mL反应体系组成如下：磷酸缓冲液(200mM、pH 7.0)中，加入6.0g(反应体系总酶活为191.63U)实施例3制备的固定化细胞，脱色木糖母液至木糖终浓度50g/L，终浓度50g/L葡萄糖构成25ml反应体系，在25℃、150rpm水浴中反应，电位滴定仪维持恒定pH 7.0，反应4h后抽滤回收固定化细胞用于下一批次的反应，产物生成量通过高效液相色谱检测，固定化细胞的操作稳定性如图4所示，结果表明反应10个批次后木糖醇产率为76.37％(其中，木糖醇产率＝木糖醇终浓度/木糖醇理论终浓度×100％)，残余酶活为初始酶活的70.54％，反应10个批次后木糖醇的时空产率为11.51g/(L·h)。

对比例1不同来源木糖还原酶对木糖转化率的比较

从NCBI数据库中筛选出三条分别来源于粗糙脉胞霉(Neurospora crassa)、米根霉(Rhizopus oryzae AS 3.819)及假丝酵母(Candida shehatae strain 20335)的木糖还原酶基因序列NCXR(Genbank:AY876382.1)、XR(Genbank:KF752418.1)、CTXR(GenBank:JF523203.1)，根据该木糖还原酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌的偏好密码子进行密码子优化后进行序列全合成。将合成的三条木糖还原酶序列分别导入到E.coli BL(DE3)中，获得工程菌E.coli BL(DE3)/pET28b(+)-NCXR、E.coli BL(DE3)/pET28b(+)-CTXR、E.coli BL(DE3)/pET-28b(+)-XR。对这三种重组木糖还原酶菌株进行诱导培养，离心收集菌体，生理盐水清洗两次。

反应体系：25mL反应体系组成：磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)，脱色木糖母液中木糖终浓度10g/L，NADPH 2mM，在25℃，150rpm磁力搅拌下反应10h，取样，测定木糖转化率，结果如表7所示。

表7不同来源木糖还原酶对木糖转化率的比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> 米根霉(Rhizopus oryzae)

<400> 1

atgaccgccg attatgttgt tctgaatcgt accggtgata aaatgccgct gcgtggtttt 60

ggttgttgga aaattgaaaa agatgtttgt gccgatgtta tttataaagc cattaaagtt 120

ggttatcgtc attttgatgg tgcctgtgat tatggtaatg aagttgaagt tggtcgtggt 180

attaaaaaag ccattgatga aggtattgtg aaacgcgaag atctgtttat tgtgaccaaa 240

ctgtggaata cctttcataa taaaaaaaat gtgcgcccgg cttgcgaacg ccagctgaaa 300

gattggggtc tggattattt tgatctgtat ctggttcatt ttccgattcc gctggcatat 360

gttgatccga gtcagaatta tccgccggaa tggtttaaag gcaatagtac cgccattgaa 420

attgaaagca gcccgatgca tgaatgttgg gcagaaatgg aacgtctggt taatgatggc 480

ctgtctcgca atattggcgt gtgcaatttt aatacccagg ctctgattga tatgctgacc 540

tatgctaaaa ttaaaccggc agttctgcag attgaactgc atccgtatct gccgcaggcc 600

gaactgacca aatgggtgaa atcacagggc attcatatta ccgcgtattc atcatttggc 660

ccggcgtctt atgtgaccct gggcgaacat ggcaaacgtg cagcaccgct gctggaacat 720

gatgcagtta aaagcctggc agataaacat aaagttagtg cgggccagat tctgctgcgc 780

tgggctctgg atcgcgaata tgtggtgatt ccgaaatctg tgaatgaaaa tcgcatgaaa 840

gctaattttg atgtgctgga tattaaactg gatgaatcag ataataaagc tctggatgcg 900

ctgaaaagta atcagcgttt taatgatccg ctggtgtggt ttgatctgcc gctgtttgcg 960

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)

<400> 2

atgtataatt ctctgaaagg caaagtcgcg attgttactg gtggtagcat gggcattggc 60

gaagcgatca tccgtcgcta tgcagaagaa ggcatgcgcg ttgttatcaa ctatcgtagc 120

catccggagg aagccaaaaa gatcgccgaa gatattaaac aggcaggtgg tgaagccctg 180

accgtccagg gtgacgtttc taaagaggaa gacatgatca acctggtgaa acagactgtt 240

gatcacttcg gtcagctgga cgtctttgtg aacaacgctg gcgttgagat gccttctccg 300

tcccacgaaa tgtccctgga agactggcag aaagtgatcg atgttaatct gacgggtgcg 360

ttcctgggcg ctcgtgaagc tctgaaatac ttcgttgaac ataacgtgaa aggcaacatt 420

atcaatatgt ctagcgtcca cgaaatcatc ccgtggccta ctttcgtaca ttacgctgct 480

tctaagggtg gcgttaaact gatgacccag actctggcta tggaatatgc accgaaaggt 540

atccgcatta acgctatcgg tccaggcgcg atcaacactc caattaatgc agaaaaattc 600

gaggatccga aacagcgtgc agacgtggaa agcatgatcc cgatgggcaa catcggcaag 660

ccagaggaga tttccgctgt cgcggcatgg ctggcttctg acgaagcgtc ttacgttacc 720

ggcatcaccc tgttcgcaga tggtggcatg accctgtacc cgagctttca ggctggccgt 780

ggt 783

Claims

1.一种重组大肠杆菌固定化细胞，其特征在于所述重组大肠杆菌固定化细胞是将木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因共同导入宿主大肠杆菌，获得含有双酶基因的重组大肠杆菌，然后将重组大肠杆菌进行发酵培养，取湿菌体细胞进行固定化，获得重组大肠杆菌固定化细胞。

2.如权利要求1所述重组大肠杆菌固定化细胞，其特征在于所述木糖还原酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述重组大肠杆菌固定化细胞，其特征在于所述发酵培养方法为：将重组大肠杆菌接种至含终浓度50μg/mL链霉素的LB液体培养基，37℃，150rpm培养2-8h，以体积浓度2％的接种量转接至新的含终浓度50μg/mL链霉素LB液体培养基中，于37℃，150rpm条件下培养至OD值0.6-0.8，再加入终浓度0.1mM IPTG，25℃条件下诱导12h，离心，获得湿菌体细胞。

4.如权利要求1所述重组大肠杆菌固定化细胞，其特征在于所述固定法方法为：取湿菌体细胞于pH为8.5的磷酸盐缓冲液中，加入吸附载体，室温搅拌，再加入聚乙烯亚胺搅拌均匀，最后加入戊二醛，室温交联反应2h，抽滤后，滤饼用去离子水洗涤三次，得到固定化细胞；所述吸附载体为硅藻土、膨润土或活性炭；所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为100g/L，所述吸附载体加入量以缓冲液体积计为6g/L，所述聚乙烯亚胺加入体积终浓度为5％，戊二醛加入体积终浓度为50％。

5.一种权利要求1所述重组大肠杆菌固定化细胞在利用木糖母液制备木糖醇中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以pH5.0～9.0的磷酸缓冲液为反应介质，以重组大肠杆菌固定化细胞为催化剂，以木糖母液为底物，以葡萄糖为辅助底物构成反应体系，在20～45℃、100～600rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液过滤，滤饼回收催化剂循环利用，滤液分离纯化，获得木糖醇；所述木糖母液为生产糖醇后产生的含木糖废液用活性炭脱色获得的。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述木糖母液中木糖含量为400～550g/L。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂加入终浓度为20～150g/L、所述底物加入终浓度为10～200g/L，所述葡萄糖加入终浓度为10～80g/L。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述木糖母液在使用前先进行脱色预处理，所述脱色预处理方法为：在木糖母液中加入活性炭粉末，在30～60℃搅拌脱色2h，过滤，收集滤液，获得脱色木糖母液；所述活性炭粉末粒径为50～300目，活性炭粉末质量添加终浓度为0.2-3％。