CN113025516A - 一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，对木糖二次母液与木糖浓缩液混合液进行发酵处理，并在发酵过程中使用木糖二次母液代替后续葡萄糖流加，既满足发酵体系中葡萄糖含量稳定，同时能够提供部分木糖，既能节省葡萄糖用量，缩减成本，也能维持体系木糖相对稳定，提升整体转化率。本发明通过混合发酵及流加等方式添加的木糖二次母液使得发酵体系中阿拉伯糖、甘露糖等杂糖含量始终处于发酵菌株可代谢范围内，便于后续纯化，并能够提升木糖醇纯度。

Description

一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法
技术领域
本发明涉及糖醇制备技术领域，特别涉及一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法。
背景技术
制备木糖的过程中，玉米芯等原料通过酸水解、脱色、离交、浓缩、结晶、离心和干燥等工艺获得晶体木糖；离心过程中，会得到大量木糖母液，该母液可以经过色谱分离再次提取木糖，在色谱分离过程中同时得到了提余液，即为木糖二次母液。木糖二次母液包含葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖及木糖等多种单糖，且因生产条件、批次不同导致含量波动，因此难以合理地利用。目前，木糖二次母液大多当做混合糖浆用于焦糖色素的生产中，附加值低。
现阶段使用生物发酵法制备木糖醇的方法通常是用半纤维素水解液或者葡萄糖等作为发酵原料，使用效率较高的酵母菌或大肠杆菌的基因工程菌进行发酵，比如公开号为CN105671013A、CN110835621A、CN106661540A的专利。其中在现有的发酵技术中，为满足发酵生产效率，往往需要在过程中行补料，其中多数会添加葡萄糖，提供菌株生产和发酵需要的碳源，这就增加了发酵成本以及发酵过程控制的难度，因为往往发酵终点时会有葡萄糖残留，造成发酵液的还原糖偏高，不利于后续的发酵液的精制处理。
公开号为CN101921810A的专利采用不能以L-阿拉伯糖为碳源的假丝酵母对木糖母液进行发酵，消耗母液中的葡萄糖及半乳糖，通过脱色、离交、浓缩、结晶等工艺，获取木糖醇、L-阿拉伯糖的混合晶体。公开号为CN101705253A的专利采用酒精酵母及木糖醇酵母依次发酵木糖母液，分别得到乙醇、木糖醇及阿拉伯糖产品。公开号为CN101857523A的专利采用木糖母液同时生产木糖醇和阿拉伯糖醇。这些研究都是利用木糖母液发酵制备木糖醇，木糖二次母液相较于木糖母液，其木糖含量较低，约10％(木糖母液约50％～60％)，不适合直接进行木糖醇转化；且木糖二次母液中母液固含量较高，需稀释后用于发酵，进一步降低了木糖浓度，使得发酵液中木糖醇浓度过低，不具备提取、纯化价值。
以上研究普遍存在的问题是，由于只是单纯的木糖母液作为碳源和发酵原料，发酵效率低，且均不适用于木糖二次母液的发酵利用。想要利用木糖二次母液制备木糖醇，现有技术有待进一步改进和提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，通过按照一定比例混合木糖二次母液与木糖浓缩液进行发酵，同时提升物料初始葡萄糖含量以减少后续葡萄糖流加量，并以木糖二次母液代替后续葡萄糖流加，解决木糖二次母液中木糖含量偏低、木糖醇转化率低、发酵操作步骤复杂、生产成本高的问题，达到提高木糖二次母液的附加值的目的。
本发明是这样实现的，提供了一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，包括以下步骤：
步骤一、木糖浓缩液制备：在木糖水解液离交前液中添加碱液，然后使用活性炭脱色，脱色结束后，过滤得精制木糖液，再进行低温真空浓缩，直至浓缩液折光约60％～65％，得到木糖浓缩液；
步骤二、菌株活化及种子液制备：选取重组大肠杆菌菌株IS5-M，以LB平板及LB液体培养基活化菌株，接种于种子培养基中，培养至OD600＝5～6，得到种子液；
步骤三、发酵罐扩培：向发酵罐添加灭菌后的发酵培养基，加入种子液进行培养，培养至OD600＞20；
步骤四、第一批补料发酵：向发酵罐中加入木糖浓缩液与木糖二次母液按比例混合的混合液，进行补料发酵，使发酵体系中木糖浓度维持在85g/L～90g/L，待体系中葡萄糖浓度小于10g/L时，流加木糖二次母液，控制葡萄糖浓度维持在10g/L，总葡萄糖添加量为木糖质量的35％～40％；发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度的溶液0.2L～0.5L；
步骤五、第二批补料发酵：第一批发酵中木糖浓度＜30g/L时，采用步骤四的方法进行第二批补料发酵，最终发酵液的木糖醇浓度无变化时发酵结束。
进一步地，在步骤一中具体做法包括：向木糖水解液离交前液中添加0.4％～0.5％的Ca(OH)2，30rpm～50rpm下搅拌15min～30min，控制pH3.0～3.5，然后添加质量比0.3％～0.5％的活性炭进行脱色，控制温度60℃～70℃，30rpm～60rpm下搅拌60min～90min。进一步地，在步骤一中，低温真空浓缩的条件为真空泵压力-0.085MPa～-0.095MPa、水浴温度60℃～70℃、转速50rpm～60rpm、冷凝水流速150mL/min～200mL/min。
进一步地，在步骤二中，所述菌株为重组大肠杆菌IS5-M。该菌株记载在公开号CN105671013A的专利中。
进一步地，在步骤二中，LB液体培养基的组成成分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，固体添加1.5％～2％琼脂，种子培养基的组成成分为：蛋白胨7.5g/L，酵母粉7.5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖20g/L。
进一步地，在步骤三中，所述发酵培养基的组成成分为：葡萄糖10g/L，玉米浆干粉24g/L，氯化钠0.5g/L，KH2PO4 3g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，NH4Cl 1g/L；所述发酵罐的培养条件为：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％。
进一步地，在步骤三中，培养9.5h～11h。
进一步地，在步骤四中，所述木糖浓缩液与木糖二次母液的混合比例为7～9:1～3。
进一步地，在步骤四中，所述第一批补料发酵的发酵条件为30℃、pH7、溶氧20％～25％。
进一步地，整体发酵时间约75h～85h。
与现有技术相比，本发明的一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法具有以下特点：
(1)木糖二次母液与木糖浓缩液比例混合，能够提升发酵前期可利用碳源的含量，有利于菌株初期生长繁殖，从而提升木糖醇转化率。
(2)通过木糖二次母液代替葡萄糖流加，满足发酵体系中葡萄糖含量稳定，同时能够提供部分木糖，既能节省葡萄糖用量，缩减成本，也能维持体系木糖相对稳定，提升整体转化率。
(3)木糖二次母液中抑制物较少，不影响菌株生长发育，且无需灭菌即可使用。
(4)两批补料发酵能够维持发酵体系中木糖含量相对稳定，有利于菌株转化，提升发酵液中木糖醇浓度，并且避免发酵初期木糖等糖浓度过高导致菌株高渗条件下的生长抑制进而导致转化率偏低的情况。
(5)通过混合发酵及流加等方式添加的木糖二次母液使得发酵体系中阿拉伯糖、甘露糖等杂糖含量始终处于发酵菌株可代谢范围内，便于后续纯化，提升木糖醇纯度。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法的较佳实施例，包括以下步骤：
步骤一、木糖浓缩液制备：在木糖水解液离交前液中添加碱液，然后使用活性炭脱色，脱色结束后，过滤得精制木糖液，再进行低温真空浓缩，直至浓缩液折光约60％～65％，得到木糖浓缩液。
步骤二、菌株活化及种子液制备：选取重组大肠杆菌菌株IS5-M，以LB平板及LB液体培养基活化菌株，接种于种子培养基中，培养至OD600＝5～6，得到种子液。
步骤三、发酵罐扩培：向发酵罐添加灭菌后的发酵培养基，加入步骤二中得到的种子液进行培养，培养至OD600＞20。
步骤四、第一批补料发酵：向发酵罐中加入步骤一制备的木糖浓缩液与木糖二次母液按比例混合的混合液，进行补料发酵，使发酵体系中木糖浓度维持在85g/L～90g/L，待体系中葡萄糖浓度小于10g/L时，流加木糖二次母液，控制葡萄糖浓度维持在10g/L，总葡萄糖添加量为木糖质量的35％～40％；发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度的溶液0.2L～0.5L。
步骤五、第二批补料发酵：第一批发酵中木糖浓度＜30g/L时，采用步骤四的方法进行第二批补料发酵，最终发酵液的木糖醇浓度无变化时发酵结束。
将木糖母液及木糖二次母液成分含量检测，结果如下表1所示。
表1、木糖母液及木糖二次母液成分含量对比表
Figure BDA0002865780840000041
由上表可知，木糖母液木糖浓度较高，其他糖含量较少；木糖二次母液木糖浓度较低，但葡萄糖含量高，且乙酸、糠醛、HMF等抑制物较少，相较于木糖母液适合用于木糖醇发酵中，是替代葡萄糖的优质发酵原料。
将木糖浓缩液与木糖二次母液按一定比例混合，得到一系列可用于发酵的原料液。对混合原料液进行检测，得到混合原料液中各糖醇成分的含量，具体见下表2所示。
表2、
Figure BDA0002865780840000042
其他比例也可用于本体系发酵，但因木糖浓度偏低，发酵占用空间较大，经济效益不高，因此未进行赘述，但也属于本发明保护的范畴。
本发明中所使用的木糖浓缩液可以为玉米芯水解液，还可为富含半纤维素的其他生物质原料，例如甘蔗渣、造纸废料等。本发明中木糖二次母液可替换为其他富含葡萄糖的糖膏液。
下面结合具体实施例来进一步说明本发明的方法。
实施例1
本发明的一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法的第一种实施例，包括如下步骤：
步骤11、木糖浓缩液制备：在木糖水解液离交前液中添加0.4％的Ca(OH)2，50rpm下搅拌15min，控制pH3.2，然后添加质量比0.4％的活性炭进行脱色，控制温度60℃，60rpm下搅拌90min。脱色结束后，过滤得精制木糖液进行低温真空浓缩，设置真空泵压力-0.095MPa、水浴温度60℃、转速60rpm、冷凝水流速约200mL/min，直至浓缩液折光约65％，最终制得可适用于发酵的木糖浓缩液。
步骤12、菌株活化及种子液制备：选取重组大肠杆菌菌株IS5-M，以LB平板及LB液体培养基活化菌株，接种于种子培养基中，培养得到OD600＝5的种子液。
步骤13、发酵罐扩培：于15L发酵罐中添加3.5L灭菌后的发酵培养基，加入0.5L步骤12制备的种子液，在以下条件下进行培养：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％，工作体积4.5L，培养时间约10h，培养至OD600＝21。
步骤14、第一批补料发酵：向发酵罐中加入步骤11制备的木糖浓缩液与木糖二次母液按9:1比例混合的混合液1L，进行补料发酵，使发酵体系中木糖浓度为90g/L。发酵条件：30℃、pH7、溶氧20％～25％。据此计算，理论需要添加葡萄糖200g，以提供充足的辅酶NADPH。混合液中已存在部分葡萄糖，因此需木糖二次母液流加补充剩余葡萄糖，共需补充木糖二次母液1.1L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液约0.4L，发酵结束后工作体积约7L。
步骤15、第二批补料发酵：第一批发酵中木糖浓度＜30g/L时，采用步骤14的方法进行第二批补料发酵，添加木糖浓缩液与木糖二次母液的混合液(木糖浓缩液与木糖二次母液混合比例为9:1)1.5L到发酵罐中，此时体系木糖浓度约为88g/L。据此计算，理论需要添加葡萄糖300g，以提供充足的辅酶NADPH。提供木糖二次母液替代葡萄糖，流加补充木糖二次母液1.6L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液0.4L，最终木糖醇浓度无变化时发酵结束。发酵结束后工作体积约10.5L。
发酵体系中共添加木糖1465g，合计节省葡萄糖500g。
对该实施例发酵结束后的发酵液进行HPLC检测，得到发酵液中木糖醇浓度为121.4g/L，转化率为87％；阿拉伯糖残留5.5g/L，未检测到葡萄糖及甘露糖等杂糖。
实施例2
本发明的一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法的第二种实施例，包括如下步骤：
步骤21、木糖浓缩液制备：在木糖水解液离交前液中添加0.5％的Ca(OH)2，30rpm下搅拌30min，控制pH3.0，然后添加质量比0.5％的活性炭进行脱色，控制温度70℃，30rpm下搅拌60min。脱色结束后，过滤得精制木糖液进行低温真空浓缩，设置真空泵压力-0.085MPa、水浴温度70℃、转速50rpm、冷凝水流速约150mL/min，直至浓缩液折光约60％，最终制得可适用于发酵的木糖浓缩液。
步骤22、菌株活化及种子液制备：选取重组大肠杆菌菌株IS5-M，以LB平板及LB液体培养基活化菌株，接种于种子培养基中，培养得到OD600＝5.5的种子液。
步骤23、发酵罐扩培：于15L发酵罐中添加4.0L灭菌后的发酵培养基，加入0.5L步骤22制备的种子液，在以下条件下进行培养：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％，工作体积5.0L，培养时间约10h，培养至OD600＝23。
步骤24、第一批补料发酵：向发酵罐中加入步骤21制备的木糖浓缩液与木糖二次母液按7:3比例混合的混合液1.4L，进行补料发酵，使发酵体系中木糖浓度为89g/L。发酵条件：30℃、pH7、溶氧20％～25％。据此计算，理论需要添加葡萄糖230g，以提供充足的辅酶NADPH。混合液中已存在部分葡萄糖，因此需木糖二次母液流加补充剩余葡萄糖，共需补充木糖二次母液0.95L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液约0.5L，发酵结束后工作体积约8L。
步骤25、第二批补料发酵：第一批发酵中木糖浓度＜30g/L时，采用步骤24的方法进行第二批补料发酵，添加木糖浓缩液与木糖二次母液的混合液(木糖浓缩液与木糖二次母液混合比例为7:3)2.2L到发酵罐中，此时体系木糖浓度约为88g/L。据此计算，理论需要添加葡萄糖360g，以提供充足的辅酶NADPH。提供木糖二次母液替代葡萄糖，流加补充木糖二次母液1.5L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液0.5L，最终木糖醇浓度无变化时发酵结束，发酵结束后工作体积约12.5L。
发酵体系中共添加木糖1657g，合计节省葡萄糖590g。
对该实施例发酵结束后的发酵液进行HPLC检测，得到发酵液中木糖醇浓度为114.1g/L，转化率为86％；阿拉伯糖残留5.4g/L，未检测到葡萄糖及甘露糖等杂糖。
实施例3
本发明的一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法的第三种实施例，包括如下步骤：
步骤31、木糖浓缩液制备：在木糖水解液离交前液中添加0.4％的Ca(OH)2，50rpm下搅拌15min，控制pH3.5，然后添加质量比0.3％的活性炭进行脱色，控制温度60℃，60rpm下搅拌90min。脱色结束后，过滤得精制木糖液进行低温真空浓缩，设置真空泵压力-0.095MPa、水浴温度60℃、转速60rpm、冷凝水流速约200mL/min，直至浓缩液折光约65％，最终制得可适用于发酵的木糖浓缩液。
步骤32、菌株活化及种子液制备：选取重组大肠杆菌菌株IS5-M，以LB平板及LB液体培养基活化菌株，接种于种子培养基中，培养得到OD600＝6的种子液。
步骤33、发酵罐扩培：于15L发酵罐中添加3.5L灭菌后的发酵培养基，加入0.5L步骤32制备的种子液，在以下条件下进行培养：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％，工作体积4.5L，培养时间约9.5h，培养至OD600＝21。
步骤34、第一批补料发酵：向发酵罐中加入步骤31制备的木糖浓缩液与木糖二次母液按9:1比例混合的混合液1L，进行补料发酵，使发酵体系中木糖浓度为90g/L。发酵条件：30℃、pH7、溶氧20％～25％。据此计算，理论需要添加葡萄糖200g，以提供充足的辅酶NADPH。混合液中已存在部分葡萄糖，因此需木糖二次母液流加补充剩余葡萄糖，共需补充木糖二次母液1.1L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液约0.4L，发酵结束后工作体积约7L。
步骤35、第二批补料发酵：第一批发酵中木糖浓度＜30g/L时，采用步骤34的方法进行第二批补料发酵，添加木糖浓缩液与木糖二次母液的混合液(木糖浓缩液与木糖二次母液混合比例为7:3)2.0L到发酵罐中，此时体系木糖浓度约为90g/L。据此计算，理论需要添加葡萄糖330g，以提供充足的辅酶NADPH。提供木糖二次母液替代葡萄糖，流加补充木糖二次母液1.4L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液0.5L，最终木糖醇浓度无变化时发酵结束，发酵结束后工作体积约11L。
发酵体系中共添加木糖1511g，合计节省葡萄糖530g。
对该实施例发酵结束后的发酵液进行HPLC检测，得到发酵液中木糖醇浓度为122.4g/L，转化率为89％；阿拉伯糖残留5.6g/L，未检测到葡萄糖及甘露糖等杂糖。
实施例4
本发明的一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法的第四种实施例，包括如下步骤：
步骤41、木糖浓缩液制备：在木糖水解液离交前液中添加0.4％的Ca(OH)2，50rpm下搅拌15min，控制pH3.3，然后添加质量比0.3％的活性炭进行脱色，控制温度60℃，60rpm下搅拌90min。脱色结束后，过滤得精制木糖液进行低温真空浓缩，设置真空泵压力-0.095MPa、水浴温度60℃、转速60rpm、冷凝水流速约180mL/min，直至浓缩液折光约65％，最终制得可适用于发酵的木糖浓缩液。
步骤42、菌株活化及种子液制备：选取重组大肠杆菌菌株IS5-M，以LB平板及LB液体培养基活化菌株，接种于种子培养基中，培养得到OD600＝5的种子液。
步骤43、发酵罐扩培：于15L发酵罐中添加4.0L灭菌后的发酵培养基，加入0.5L步骤42制备的种子液，在以下条件下进行培养：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％，工作体积4.5L，培养时间约11h，培养至OD600＝24。
步骤44、第一批补料发酵：向发酵罐中加入步骤31制备的木糖浓缩液与木糖二次母液按9:1比例混合的混合液1.1L，进行补料发酵，使发酵体系中木糖浓度为90g/L。发酵条件：30℃、pH7、溶氧20％～25％。据此计算，理论需要添加葡萄糖220g，以提供充足的辅酶NADPH。混合液中已存在部分葡萄糖，因此需木糖二次母液流加补充剩余葡萄糖，共需补充木糖二次母液1.2L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液0.2L，发酵结束后工作体积约7.5L。
步骤45、第二批补料发酵：第一批发酵中木糖浓度＜30g/L时，采用步骤44的方法进行第二批补料发酵，添加木糖浓缩液与木糖二次母液的混合液(木糖浓缩液与木糖二次母液混合比例为8:2)1.8L到发酵罐中，此时体系木糖浓度约为88g/L。据此计算，理论需要添加葡萄糖330g，以提供充足的辅酶NADPH。提供木糖二次母液替代葡萄糖，流加补充木糖二次母液1.6L。木糖二次母液流加补料，并控制葡萄糖含量10g/L左右。发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液0.4L，最终木糖醇浓度无变化时发酵结束，发酵结束后工作体积约11L。
发酵体系中共添加木糖1588g，节省葡萄糖550g。
对该实施例发酵结束后的发酵液进行HPLC检测，得到发酵液中木糖醇浓度为125.6g/L，转化率为87％；阿拉伯糖残留5.8g/L，未检测到葡萄糖及甘露糖等杂糖。
上述实例表明，该不同比例的木糖浓缩液与木糖二次母液可适用于发酵体系中，且木糖二次母液的流加能够进一步缩减葡萄糖的用量。
对比例1
该对比例包括如下步骤：
步骤(D11)、木糖浓缩液制备：与实施例1中步骤11的制备方法相同，不再赘述。
步骤(D12)、菌株活化及种子液制备：与实施例1中步骤12的制备方法相同，不再赘述。
步骤(D13)、发酵罐扩培：于15L发酵罐中添加5.5L灭菌后的发酵培养基，加入0.6L步骤(D12)制备的种子液，在以下条件下进行培养：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％，工作体积6.5L，培养时间约9.5h，培养至OD600＝21。
步骤(D14)、第一批补料发酵：取步骤(D11)制备的木糖浓缩液直接进行补料发酵。向发酵罐中加入木糖浓缩液1.2L，使发酵体系中木糖浓度为85g/L，添加葡萄糖260g以提供充足的辅酶NADPH，发酵过程中同时流加玉米浆干粉液0.5L，发酵结束后工作体积约8.4L。
步骤(D15)、第二批补料发酵：采用步骤(D14)的方法向发酵罐中加入木糖浓缩液1.7L，使发酵体系中木糖浓度为88g/L，添加葡萄糖380g以提供充足的辅酶NADPH，发酵过程中同时流加玉米浆干粉液0.4L，发酵结束后工作体积约10.5L。
发酵体系中共添加木糖1600g，没有节省葡萄糖，反而消耗葡萄糖640g。
对该对比例发酵结束后的发酵液进行HPLC检测，得到发酵液中木糖醇浓度为124.9g/L，转化率为82％；阿拉伯糖残留3.8g/L，未检测到葡萄糖及甘露糖等杂糖。
对比例2
该对比例包括如下步骤：
步骤(D21)、木糖浓缩液制备：与实施例2中步骤21的制备方法相同，不再赘述。
步骤(D22)、菌株活化及种子液制备：与实施例2中步骤22的制备方法相同，不再赘述。
步骤(D23)、发酵罐扩培：于15L发酵罐中添加4.5L灭菌后的发酵培养基，加入0.6L步骤(D22)制备的种子液，在以下条件下进行培养：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％，工作体积5.5L，培养时间约10h，培养至OD600＝22。
步骤(D24)、第一批补料发酵：向发酵罐中加入步骤(D21)制备的木糖浓缩液与木糖二次母液按9:1比例混合的混合液1.2L，使发酵体系中木糖浓度为90g/L。后续不补充任何葡萄糖及含葡萄糖物料。发酵过程中同时流加玉米浆干粉液0.5L，体系体积约7.2L。体系中仅含葡萄糖7.7g/L，此时缺少充足的葡萄糖转化NADPH，木糖醇转化率较低，木糖浓度无法下降。
步骤(D25)、第二批补料发酵：约35h后(正常状态下第一批补料发酵结束时间)，采用步骤(D24)的方法进行第二批补料发酵，添加木糖浓缩液与木糖二次母液的混合液(木糖浓缩液与木糖二次母液混合比例为9:1)1.5L到发酵罐中，此时发酵体系中木糖浓度为86g/L，发酵过程中同时流加玉米浆干粉液0.5L，体系体积约9.5L。体系中仅含葡萄糖7.2g/L，后续不补充任何葡萄糖及含葡萄糖物料。发酵约40h后，手动停止发酵。
发酵体系中共添加木糖1358g，未补充葡萄糖导致木糖醇转化率降低较大。
对该对比例发酵结束后的发酵液进行HPLC检测，得到发酵液中木糖醇浓度为58.6g/L，转化率为41％；阿拉伯糖残留2.2g/L，未检测到葡萄糖及甘露糖等杂糖。
对比例3
该对比例，包括如下步骤：
步骤(D31)、木糖浓缩液制备：与实施例4中步骤41的制备方法相同，不再赘述。
步骤(D32)、菌株活化及种子液制备：与实施例4中步骤42的制备方法相同，不再赘述。
步骤(D33)、发酵罐扩培：于15L发酵罐中添加3.5L灭菌后的发酵培养基，加入0.5L步骤(D32)制备的种子液，在以下条件下进行培养：37℃、400rpm、氨水调节后的pH6.5～7，溶氧30％～35％，工作体积4.5L，培养时间约10.5h，培养至OD600＝22。
步骤(D34)、全补料发酵：取木糖浓缩液与木糖二次母液为9:1比例混合的混合液，进行发酵。直接添加2.5L混合液于发酵罐中，此时木糖浓度约为180g/L。据此计算，理论需要添加葡萄糖500g，以提供充足的辅酶NADPH。混合液中已存在部分葡萄糖，因此需木糖二次母液流加补充剩余葡萄糖，共需补充木糖二次母液2.7L。流加玉米浆干粉液约0.8L，发酵结束后工作体积约10.5L。
发酵体系中共添加木糖1465g，节省葡萄糖500g。
对该对比例发酵结束后的发酵液进行HPLC检测，得到发酵液中木糖醇浓度为108.2g/L，转化率为78％；阿拉伯糖残留5.3g/L，木糖残留6.4g/L，未检测到葡萄糖及甘露糖等杂糖。
将上述各实施例和各对比例的实验数据进行归纳列表，对比结果如下表3所示。
表3、各实施例和各对比例木糖发酵液的实验结果对比表
Figure BDA0002865780840000101
由对比例1与实施例1比较可知，在发酵罐中进行木糖醇发酵，需消耗大量葡萄糖，通过木糖二次母液流加，无需添加葡萄糖即可满足木糖醇的转化；且木糖二次母液无需灭菌处理，操作简便，易于实现。
对比例2与实施例2比较表明，在木糖醇发酵过程中，葡萄糖流加必不可少，缺少葡萄糖会降低木糖醇转化率。木糖二次母液的流加作用类似于添加葡萄糖，一方面节省了葡萄糖的消耗，缩减成本；另一方面补充的木糖能够提升体系中木糖浓度，进一步提升转化率。
对比例3与实施例3比较表明，木糖醇发酵过程中，一次补料使得初期木糖等含量过高，导致菌株生长抑制，影响转化率，且发酵液中检测到木糖残留，影响后续纯化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、木糖浓缩液制备：在木糖水解液离交前液中添加碱液，然后使用活性炭脱色，脱色结束后，过滤得精制木糖液，再进行低温真空浓缩，直至浓缩液折光约60％～65％，得到木糖浓缩液；
步骤二、菌株活化及种子液制备：选取重组大肠杆菌菌株IS5-M，以LB平板及LB液体培养基活化菌株，接种于种子培养基中，培养至OD600＝5～6，得到种子液；
步骤三、发酵罐扩培：向发酵罐添加灭菌后的发酵培养基，加入种子液进行培养，培养至OD600＞20；
步骤四、第一批补料发酵：向发酵罐中加入木糖浓缩液与木糖二次母液按比例混合的混合液，进行补料发酵，使发酵体系中木糖浓度维持在85g/L～90g/L，待体系中葡萄糖浓度小于10g/L时，流加木糖二次母液，控制葡萄糖浓度维持在10g/L，总葡萄糖添加量为木糖质量的35％～40％；发酵过程中同时流加用120g～130g玉米浆干粉液配制的高浓度溶液0.2L～0.5L。
步骤五、第二批补料发酵：第一批发酵中木糖浓度＜30g/L时，采用步骤四的方法进行第二批补料发酵，最终发酵液的木糖醇浓度无变化时发酵结束。
2.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤一中具体做法包括：向木糖水解液离交前液中添加0.4％～0.5％的Ca(OH)2，30rpm～50rpm下搅拌15min～30min，控制pH3.0～3.5，然后添加质量比0.3％～0.5％的活性炭进行脱色，控制温度60℃～70℃，30rpm～60rpm下搅拌60min～90min。
3.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤一中，低温真空浓缩的条件为真空泵压力-0.085MPa～-0.095MPa、水浴温度60℃～70℃、转速50rpm～60rpm、冷凝水流速150mL/min～200mL/min。
4.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤二中，所述菌株为重组大肠杆菌IS5-M。
5.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤二中，LB液体培养基的组成成分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，固体添加1.5％～2％琼脂，种子培养基的组成成分为：蛋白胨7.5g/L，酵母粉7.5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖20g/L。
6.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤三中，所述发酵培养基的组成成分为：葡萄糖10g/L，玉米浆干粉24g/L，氯化钠0.5g/L，KH2PO43g/L，Na2HPO4·12H2O 9g/L，NH4Cl 1g/L；所述发酵罐的培养条件为：37℃、400rpm、pH6.5～7，溶氧30％～35％。
7.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤三中，培养9.5h～11h。
8.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤四中，所述木糖浓缩液与木糖二次母液的混合比例为7～9:1～3。
9.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，在步骤四中，所述第一批补料发酵的发酵条件为30℃、pH7、溶氧20％～25％。
10.如权利要求1所述的利用木糖二次母液发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，整体发酵时间约75h～85h。
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