CN116891878A - 一种木质纤维素原料经有机溶剂法预处理后直接发酵制备l-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木质纤维素原料经有机溶剂法预处理后直接发酵制备L‑乳酸的方法。该方法不包括纤维素和半纤维素的酶解或酸解工艺，仅由木质纤维素洗涤、有机溶剂处理和发酵步骤组成，具体步骤如下：将木质纤维素原料浸泡在热水中搅拌，洗去泥沙和杂物，然后固液分离得到湿固体；将上述湿固体与有机溶剂混合后，高温下搅拌，固液分离，再经多次水洗后获得纤维素浆；将纤维素浆作为发酵碳源，在发酵培养基中接种微生物培养物发酵产L‑乳酸。本发明提高了木质纤维素原料的利用率，缩短了方法技术路线，节约了工艺成本和生产建设投资成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种木质纤维素原料经有机溶剂法预处理后直接发酵制备L-乳酸的方法。
背景技术
目前，工业上普遍以微生物发酵法生产乳酸，发酵流程以玉米、薯类等淀粉类物质为原料，通过淀粉调浆、液化糖化过程，将淀粉转化为糖类供微生物发酵转化为乳酸。
然而，保证粮食安全是基本国策，使用粮食作为制造的原料会遇到粮食基原料的用量安全与价格不断上涨的制约，因此，生产发酵产物L-乳酸的工业正面临着将生产过程从相对容易转化但昂贵的粮食基原料发酵转变为来源储量广泛又价格低廉的纤维素废料或木质纤维素生物质的技术革命。
可大量获得的生物质原料主要是农作物秸秆中的木质纤维素，木质纤维素通常由纤维素(葡萄糖的均聚物)、半纤维素(葡萄糖的一种共聚物，主要由戊糖和己糖组成)和木质素组成，其中约含70％(干基)的可发酵糖类。
目前，以木质纤维素为原料应用于发酵法生产生物化工产品的方法，主要还是“预处理—酶解糖化—发酵”，即将木质纤维素物质经物理或化学方法，破环木质纤维素的缠绕结构，后添加纤维素酶与半纤维素酶，使纤维素与半纤维素酶解或酸水解为戊糖与己糖为主要成分的秸秆糖浆，然后加入氮源和无机盐，并接入微生物培养物发酵制备L-乳酸，来实现木质纤维素的工业化利用。这类方法存在步骤和周期较长，可发酵糖损耗大，设备成本较高的缺陷。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种木质纤维素原料经有机溶剂法预处理后直接发酵制备L-乳酸的方法。本发明的方法仅涉及有机溶剂预处理和发酵步骤，并不涉及专门针对纤维素和半纤维素的酶解或酸解等水解制糖工艺，具有木质纤维素原料的利用率高，方法技术路线短，工艺成本和生产建设投资成本低等优点。
本发明的技术方案如下：
一种木质纤维素原料经有机溶剂法预处理后直接发酵制备L-乳酸的方法，该方法不包括纤维素和半纤维素的酶解或酸解工艺，仅由木质纤维素洗涤、有机溶剂处理和发酵步骤组成，具体步骤如下：
(1)木质纤维素洗涤
将木质纤维素原料浸泡在热水中搅拌，洗去泥沙和杂物，然后固液分离得到湿固体；
(2)有机溶剂处理
将上述湿固体与有机溶剂混合后，高温下搅拌，固液分离，再经多次水洗后获得纤维素浆；
(3)发酵
将纤维素浆作为发酵碳源，在发酵培养基中接种微生物培养物发酵产L-乳酸。
进一步的，所述木质纤维素原料选自麦秆、玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣、果渣、谷物秸秆、棉秆、竹子、芦苇、桉木、软硬木片、废纸浆中一种或多种的组合。
进一步的，所述热水的温度为50-90℃。
进一步的，所述有机溶剂为醇类溶剂或酮类溶剂中的一种或两种；更进一步的，所述醇类溶剂为甲醇、乙醇、丁醇中的一种或多种；所述酮类溶剂为丙酮、甲基丁酮中的一种或两种。
进一步的，所述湿固体干重与有机溶剂的固液质量比为1:4-30，优选为1:6-20。
进一步的，所述步骤(2)混合后的液体中有机溶剂的浓度为10-100％，优选为20-90％。
进一步的，所述有机溶剂处理的温度为120-200℃，搅拌速度为300-700rpm。
进一步的，所述微生物培养物包含属于纤维素分解菌(Thermoanaerobacter)属的第一微生物和属于嗜热厌氧杆菌(Caldicellulosiruptor)属的第二微生物中的一种或多种混合培养物。
进一步的，所述第一微生物和第二微生物包含该微生物保藏的菌株，以及由其衍生的微生物、基因改造工程菌或同源突变体。
进一步的，所述发酵的初始温度为50-82℃，优选的，初始温度为55-78℃。
进一步的，所述发酵的pH值为5-9，优选的，发酵的pH值为6-8。
进一步的，所述发酵的方式包括分批发酵、分批补料发酵或连续发酵。
进一步的，所述发酵方式为间歇通氮气或二氧化碳的一种或两种进行厌氧发酵、连续通氮气或二氧化碳的一种或两种进行厌氧发酵等。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下实施例中生物质的化学成分分析的检测方法采用NREL法。
以下实施例中种子液的制备如下：将-20℃下保藏的亨盖特管菌种培养物按10％的比例接种到灭菌(灭菌要求：115℃、20min)后的液体种子培养基中，在52-78℃、转速200rpm下培养16-28h，即得到种子液。
种子培养基配方：微晶纤维素10％、蛋白胨0.4％、(NH4)2SO4 0.6％、MgSO40.03％、CaCl2 0.005％、尿素0.05％、K2HPO4 0.15％、KH2PO4 0.3％；
二级种子液的接种比例、培养条件以及培养基配方同上。
一级种子液在250ml的摇瓶中培养，二级种子液在2L的发酵罐中培养。
以下实施例中发酵培养基中补充的氮源和无机盐配方如下：纤维素浆按实际发酵量添加蛋白胨0.4％、(NH4)2HPO4 0.1％、KH2PO4 0.035％、(NH4)2SO4 0.6％、MgSO4 0.07％、NaCl0.01％、pH 7.0。
发酵在20L的发酵罐中进行。
以下实施例中纤维素、半纤维素的保留率以及木质素的去除率计算如下：
纤维素保留率＝MC2*100％/MC1
半纤维素保留率＝MH2*100％/MH1
木质素去除率＝ML2*100％/ML1
其中，MC1、MC2-----木质纤维素原料、纤维素浆中的纤维素质量，g
MH1、MH2-----木质纤维素原料、纤维素浆中的半纤维素质量，g；
ML1、ML2-----木质纤维素原料、纤维素浆中的木质素质量，g；
以下实施例中乳酸的转化率计算如下：
YLA＝MLA*100％/(MC6+MC5)
其中，MLA-----发酵过程的乳酸产量，g
MC6------初始纤维素浆中的纤维素质量*1.111，g
MC5------初始纤维素浆中的半纤维素质量*1.136，g。
实施例1
将小麦秸秆粉碎至60-80目，随后浸泡在自来水中，均匀混合，保温75℃、90min，洗去泥沙和杂物，随后固液分离。将固液分离后的小麦秸秆按小麦秸秆干重：液体总量＝1：19(w/w)的比例反应溶液混合后，丁醇在液体中浓度控制在80％，移入高温反应釜中，升温至195℃后保温，持续搅拌60min，转速为300rpm，反应结束后，使用压榨机固液分离获得湿固体；随后使用自来水对纤维素浆洗涤3次，每次洗涤后固液分离获得纤维素浆。经检测计算，纤维素的保留率为81.5％，半纤维素的保留率为3.2％，木质素的去除率达到了90.3％。
取纤维素浆直接作为碳源参与培养基配制，含量为纤维素浆干物质含量占12％，补充氮源和无机盐，配制成发酵培养基，在115℃的条件下灭菌20min，灭菌后按8％(w/w)的比例将纤维素分解菌(Thermoanaerobacter)种子液接种至发酵培养基中，培养过程中全程通入氮气，罐压维持在0.03Mpa，温度维持在60℃，pH控制在7.0，发酵100小时后得到含有L-乳酸的发酵液，乳酸的转化率达到了86％。
实施例2
将小麦秸秆粉碎至60-80目，随后浸泡在自来水中，均匀混合，保温60℃、120min，洗去泥沙和杂物，随后固液分离。将固液分离后的小麦秸秆按小麦秸秆干重：液体总量＝1：15(w/w)的比例反应溶液混合后，丙酮在液体中浓度控制在50％(w/w),移入高温反应釜中，升温至135℃后保温，持续搅拌70min，转速为300rpm，反应结束后，使用压榨机固液分离获得湿固体；随后使用自来水对纤维素浆洗涤3次，每次洗涤后固液分离获得纤维素浆。经检测计算，纤维素的保留率为90.5％，半纤维素的保留率为36.6％，木质素的去除率达到了81.5％。
取纤维素浆直接作为碳源参与培养基配制，含量为纤维素浆干物质含量占10％，补充氮源和无机盐，配制成发酵培养基，在115℃的条件下灭菌20min,灭菌后按11％(w/w)的比例将纤维素分解菌(Thermoanaerobacter)种子液接种至发酵培养基中，培养过程中全程通入二氧化碳，罐压维持在0.03Mpa，温度维持在55℃，pH控制在7.0，发酵95小时后得到含有L-乳酸的发酵液，乳酸的转化率达到了83％。
实施例3
将甘蔗渣粉碎至60-80目，随后浸泡在自来水中，均匀混合，保温75℃、90min,洗去泥沙和杂物，随后固液分离。将固液分离后的甘蔗渣按甘蔗渣干重：液体总量＝1：5(w/w)的比例反应溶液混合后，丙酮与乙醇在液体中的总浓度控制在90％(w/w)，移入高温反应釜中，升温至200℃后保温，持续搅拌60min，转速为300rpm，反应结束后，使用压榨机固液分离获得湿固体；随后使用自来水对纤维素浆洗涤3次，每次洗涤后固液分离获得纤维素浆。经检测计算，纤维素的保留率为88.5％，半纤维素的保留率为50.2％，木质素的去除率达到了81.3％。
取纤维素浆直接作为碳源参与培养基配制，含量为纤维素浆干物质含量占13％，补充氮源和无机盐，配制成发酵培养基，在115℃的条件下灭菌20min，灭菌后按5％(w/w)的比例将嗜热厌氧菌(Caldicellulosiruptor)种子液接种至发酵培养基中，培养过程中全程通入氮气，罐压维持在0.03Mpa，温度维持在80℃，pH控制在7.0，发酵88小时后得到含有L-乳酸的发酵液，乳酸的转化率达到了80.6％。
Claims (10)
1.一种木质纤维素原料经有机溶剂法预处理后直接发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，该方法不包括纤维素和半纤维素的酶解或酸解工艺，仅由木质纤维素洗涤、有机溶剂处理和发酵步骤组成，具体步骤如下：
(1)木质纤维素洗涤
将木质纤维素原料浸泡在热水中搅拌，洗去泥沙和杂物，然后固液分离得到湿固体；
(2)有机溶剂处理
将上述湿固体与有机溶剂混合后，高温下搅拌，固液分离，再经多次水洗后获得纤维素浆；
(3)发酵
将纤维素浆作为发酵碳源，在发酵培养基中接种微生物培养物发酵产L-乳酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料选自麦秆、玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣、果渣、谷物秸秆、棉秆、竹子、芦苇、桉木、软硬木片、废纸浆中一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热水的温度为50-90℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为醇类溶剂或酮类溶剂中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中湿固体干重与有机溶剂的固液质量比为1:4-30，混合后的液体中有机溶剂的浓度为10-100％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂处理的温度为120-200℃，搅拌速度为300-700rpm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物培养物包含属于纤维素分解菌(Thermoanaerobacter)属的第一微生物和属于嗜热厌氧杆菌(Caldicellulosiruptor)属的第二微生物中的一种或多种混合培养物；所述第一微生物和第二微生物包含该微生物保藏的菌株，以及由其衍生的微生物、基因改造工程菌或同源突变体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的初始温度为50-82℃，pH值为5-9。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的方式包括分批发酵、分批补料发酵或连续发酵。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵方式为间歇通氮气或二氧化碳的一种或两种进行厌氧发酵、连续通氮气或二氧化碳的一种或两种进行厌氧发酵。
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