CN101289677B - 采用含纤维素原料制备乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

一种采用含纤维素原料制备乙醇的方法，该方法包括将含纤维素原料与酶混合，将含纤维素原料酶解，得到酶解产物，并发酵该酶解产物，其中，所述将含纤维素原料与酶混合的方法包括将含纤维素原料分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的含纤维素原料的量至多为全部含纤维素原料重量的60％。本发明的方法制备得到的乙醇的产率较高。

Description

采用含纤维素原料制备乙醇的方法
技术领域
本发明是关于乙醇的制备方法，更具体地是关于采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
背景技术
现有技术的由含纤维素原料，如秸秆制备乙醇的方法主要包括三个步骤：1、含纤维素原料的预处理，2、纤维素的酶解；3、糖的发酵制乙醇。
含纤维素原料一般为植物的根、茎和叶，包括秸秆。所述秸秆即农作物(一般为草本植物)收获果实后留下的根、茎和叶，主要为茎和叶，如玉米秸秆、高粱秸秆、谷类植物的秸秆、麦秸。秸秆的主要成分是木质纤维素。所述木质纤维素是纤维素、半纤维素和木质素的混合物。秸秆中纤维素、半纤维素和木质素通过共价键或非共价键紧密结合而成的木质纤维，约占秸秆总重量的70-90％。秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的含量会随不同来源的农作物或农作物的不同部分而有所区别。
纤维素被纤维素酶水解的反应通常称为酶解反应，又可以称为糖化反应，酶解的主要产物是单糖。纤维素在纤维素酶的作用下能够转化成葡萄糖，半纤维素在半纤维素酶的作用下能够转化成木糖等单糖，葡萄糖和木糖都可以用于发酵生产乙醇，比如酿酒酵母可以发酵葡萄糖制备乙醇，树干毕赤酵母可以发酵木糖制备乙醇。纤维素的非结晶结构是很容易被打破的，它可以完全降解成葡萄糖，然后由葡萄糖发酵成乙醇。但是，纤维素的结晶结构难以被破坏。另外，木质素是由苯基丙烷聚合而成的一种非多糖物质，由芳香烃的衍生物以-C-C-键、-O-键纵横交联在一起，其侧链又与半纤维素以共价键结合，形成一个十分致密的网络结构，将纤维素紧紧包裹在里面，不利于纤维素酶对纤维素的进攻，使得纤维素酶和半纤维素酶无法接触底物，因此，需要先对秸秆进行预处理，如对秸秆进行蒸汽爆破或者酸处理后再与纤维素酶和/或半纤维素酶接触，对纤维素进行水解。
CN1117835C公开了一种乙醇溶解汽爆秸秆木质素制备液体燃料的方法，该方法以汽爆秸秆为原料，在高压反应釜中，用乙醇萃取汽爆秸秆中的木质素；再用真空抽滤得到滤液，并将汽爆秸秆萃取渣进行同步糖化固态发酵乙醇，乙醇萃取液及真空抽滤所得滤液即为该方法制备的液体燃料。
所述汽爆秸秆原料的制备方法包括将切碎的麦草、稻草或玉米秆等植物原料装入汽爆罐，在1.2-1.7兆帕压力下，维持压力5-10分钟，之后，瞬间减压释放。
所述的乙醇萃取汽爆秸秆中的木质素的方法为在高压反应釜中，加入汽爆秸秆和乙醇，汽爆秸秆和乙醇的体积比为1：10-1：50，在1.5-2.0兆帕的压力范围内保持1-2小时。
所述的将汽爆秸秆萃取渣进行同步糖化固态发酵乙醇是指：在33-35℃范围内(发酵)，维持14-16小时，在38-40℃范围内(酶解)，维持68小时，并交替进行发酵2-3天。
CN1193099C公开了一种使用耐热型酵母从木素纤维素生物质中生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
将木素纤维素生物质粉碎成颗粒大小为15-30毫米；对粉碎的木素纤维素生物质进行蒸汽爆炸预处理，根据所用材料的类型保持1-3兆帕的压力和190-230℃的温度1-10分钟的时间，之后引发迅速减压；收集预处理过的物料并且通过过滤分离液体和固体部分，将固体部分引入发酵贮器中；向发酵贮器添加浓度为15FPU/克纤维素的纤维素酶和12.6国际单位/克纤维素的β-葡萄糖苷酶；给发酵贮器接种马克斯克鲁维氏酵母CECT10875耐热型酵母培养物的悬浮液；将混合物在42℃下摇动72小时。
采用上述方法均可实现由含纤维素原料制备乙醇的目的，但乙醇的产率较低，一般不超过20％。
发明内容
本发明的目的是克服现有的采用含纤维素原料制备乙醇的方法制备得到的乙醇产率较低的缺陷，提供一种乙醇产率较高的采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
本发明的发明人发现，现有技术的采用含纤维素原料制备燃料乙醇的方法中，含纤维素原料，如秸秆原料通常是以液浆的形式存在，在将浆液状的全部秸秆原料直接与酶混合时，会使酶浓度降低，使酶活力下降。再者，将经过预处理的秸秆与酶混合酶解的方法通常为将破碎的秸秆颗粒一次全部加入到酶与水的混合液中与酶液混合，进行酶解糖化反应，或者，先将所用反应物料——经预处理的秸秆颗粒于反应罐中与水混合，然后在酶解温度下，将酶直接加入到反应罐中反应。尽管上述混合是在搅拌条件下进行的，但是秸秆颗粒仍然不容易与酶混合均匀。因为，经过预处理后的秸秆粒度变小，颗粒以及碎屑状的秸秆颗粒很容易互相粘连和团聚，因此一次将全部秸秆完全与酶混合，仅有部分秸秆能与酶充分接触，但是由于秸秆之间的粘连和团聚也会有部分秸秆不能充分与酶接触，即使在搅拌下，也不能完全将秸秆打散。因此，酶解后纤维素转化为糖的转化率低，导致糖发酵得到的乙醇的产率较低。
本发明提供了一种采用含纤维素原料制备乙醇的方法，该方法包括将含纤维素原料与酶混合，将含纤维素原料酶解，得到酶解产物，并发酵该酶解产物，其中，所述将含纤维素原料与酶混合的方法包括将含纤维素原料分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的含纤维素原料的量至多为全部含纤维素原料重量的60％。
本发明的方法通过将含纤维素原料分批与酶混合，使每批加入的含纤维素原料都能与酶混合均匀并充分接触，并且在反应过程中，酶的浓度一直保持在较高的水平，因此，含纤维素原料能与酶充分反应，从而有效地提高了原料的糖转化率，因此大大提高了乙醇的产率。例如，在其它的蒸汽爆破条件都相同的情况下，实施例1的乙醇产率达25.0％，而对比例1的乙醇产率仅为18.9％，提高幅度高达32％。
具体实施方式
按照本发明，该方法包括将含纤维素原料与酶混合，将含纤维素原料酶解，得到酶解产物，并发酵该酶解产物，其中，所述将含纤维素原料与酶混合的方法包括将含纤维素原料分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的含纤维素原料的量至多为全部含纤维素原料重量的60％。
优选情况下，为了提高生产效率又同时能够保证含纤维素原料与酶的充分混合、得到较高的含纤维素原料浓度以及较高水平的酶作用速度，第一批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-60％，更优选为20-40％；第一批以后与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的40-80％，更优选为60-80％。
更优选情况下，所述分批次数为3次，第一批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-60％，更优选为20-40％；第二批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-50％，更优选为20-40％；第三批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-40％，更优选为20-30％。
为了保证酶具有最佳的反应活性，在将第一批含纤维素原料与酶混合前，调节含纤维素原料的pH值为大于3小于7，优选为4-5.5，以使得含纤维素原料与酶混合后，酶具有最佳的反应活性。所述调节反应物料pH值的方法可以采用本领域技术人员公知的各种方法。如根据所得含纤维素原料的pH值，在该含纤维素原料中加入酸性物质或碱性物质。例如，所述酸性物质可以是硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种；所述碱性物质可以是氢氧化钠和/或氢氧化钾。
优选情况下，所述相邻的两个分批混合步骤之间还包括时间间隔。为了使酶能充分水解含纤维素原料，提高糖的转化率，所述时间间隔优选为10-120分钟，更优选为30-60分钟。
为了使酶与反应原料混合的更均匀，所述含纤维素原料的酶解优选在水存在条件下进行，更优选在含有水与含纤维素原料的悬浮液中进行。也就是说，本发明优选先将第一批含纤维素原料与水混合制备悬浮液后，再将酶解所需全部酶与悬浮液混合，然后再按照本发明的方法继续分批加入含纤维素原料。对所加入的水的量没有特别限定，优选情况下，所述水的加入量与全部含纤维素原料的重量比为1-4：1。
更优选情况下，以第一批含纤维素原料与酶混合后得到的混合物为基准，以纤维素原料的干重计，含纤维素原料的含量至少为1重量％，优选为1-20重量％，更优选为1.2-10重量％。在现有的由含纤维素原料制备乙醇的方法中，在酶解时，由于含纤维素原料的浓度太稀，因此，导致生产周期长，生产效率低。而本发明的发明人发现，在酶解时控制第一批含纤维素原料与酶混合后得到的混合物中含纤维素原料的浓度，以第一批含纤维素原料与酶混合后得到的混合物为基准，以纤维素原料的干重计，使含纤维素原料的含量至少为1重量％，优选为1-20重量％，更优选为1.2-10重量％，既能够保证酶解的周期短，同时保证具有高的生产效率，即单糖的产率高。
由于本发明仅涉及对含纤维素原料加料方式的改进，因此对用含纤维素的原料制备乙醇的方法的其它步骤没有特别的限制。
所述酶解使用的酶包括纤维素酶。所述纤维素酶可以通过各种方式获得，例如商购得到，或者通过使用产酶微生物分泌得到。
由于使用产酶微生物分泌得到的酶会含有各种副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克含纤维素原料的干重计，所述纤维素酶的用量为8-20酶活力单位，更优选为10-15酶活力单位。本发明所述纤维素酶的酶活力按照美国国家可再生能源实验室(NationalRenewable Energy Laboratory，NREL)提供的标准方法——纤维素酶活力测定NREL LAP-006测定，所述纤维素酶的酶活力单位为在该标准方法规定的测定条件下，1分钟内将1克Whatman No.1滤纸转化为葡萄糖所需酶的微克数。
所述酶解的温度可以为纤维素酶的任何最适作用温度，一般为45-55℃，更优选为48-52℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为25-48小时，更优选为30-40小时。所述酶解时间从将酶与含纤维素原料混合时开始计算，因此，按照本发明，所述相邻的两个分批混合步骤之间的时间间隔也包括在所述酶解时间之内。
按照本发明的一个优选的实施方式，所述将含纤维素原料酶解的方法包括先将第一批含纤维素原料与水混合后加入酶解罐中，调节含纤维素原料的pH值为大于3至小于7，并升温至48-52℃以达到酶的最佳反应活性条件，然后，在搅拌下，向酶解罐中加入酶，搅拌30-60分钟后，再加入第二批含纤维素原料，搅拌反应30-60分钟后，加入第三批含纤维素原料。所述水的量与全部含纤维素原料的重量比为1-4：1；所述第一批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-60％；第二批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-50％；第三批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-40％。
所述纤维素酶为复合酶，至少包括C1型纤维素酶、Cx型纤维素酶和纤维二糖酶三种酶。
C1酶可以使结晶的纤维素转变为非结晶的纤维素。
Cx型纤维素酶又分为Cx1型纤维素酶和Cx2型纤维素酶两种。Cx1型纤维素酶为内切型纤维素酶，可以从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1，4-糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖。Cx2型纤维素酶是一种外切型纤维素酶，可以从水合非纤维素分子的非还原端作用于β-1，4-糖苷键，逐一切断β-1，4-糖苷键生成葡萄糖。
纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。
优选所述酶解使用的酶还包括半纤维素酶。因为半纤维素酶可以降解半纤维素成为溶于水的木糖，所以酶解使用的酶包括半纤维素酶，一方面可以更充分地暴露纤维素，增加纤维素与纤维素酶的接触几率，另一方面半纤维素降解产物木糖能够被树干毕赤酵母发酵生成乙醇，两方面作用都可以增加乙醇产率。以每克含纤维素的原料的干重计，所述半纤维素酶的用量为4.4-8.8酶活力单位。
本发明所述半纤维素酶的酶活力单位(U)为在50℃、pH＝4.8条件下，每分钟分解浓度为1重量％木聚糖溶液产生1微克还原糖(以木糖计)所需的酶量。
本发明所述半纤维素酶的活力指每克半纤维素酶所具有的活力单位。所述半纤维素酶的活力利用半纤维素酶在50℃、pH为4.8的条件下水解1重量％木聚糖产生还原糖(以木糖计)，所得还原糖与过量3，5—二硝基水杨酸(DNS)发生颜色反应，用分光光度计测得反应液550纳米的光吸收值与还原性糖(以木糖计)的生成量成正比关系测定。具体测定方法如下：
准确称取1.000克木聚糖，用0.5毫升pH＝4.8的0.1摩尔/升乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，然后用去离子水定容到100毫升，得到1重量％木聚糖溶液；
称取30克四水合酒石酸钾钠放入500毫升锥形瓶内，加16克NaOH后，加50毫升去离子水，以5℃/分钟的速度水浴加热至固体物质溶解，加入1克3，5-二硝基水杨酸，至溶解，冷却至室温，用去离子水定容至100毫升，可得3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液；
将木糖80℃烘干至恒重，准确称取1.000克溶于1000毫升水中，加10毫克叠氮化钠防腐，得到1毫克/毫升的标准木糖溶液；
准确称取1.000克固体半纤维素酶或移取1毫升液体半纤维素酶原液，用0.5毫升pH＝4.8的0.1摩尔乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，然后用去离子水定容到100毫升，得到稀释100倍的待测酶液；
分别将在50℃水浴加热60分钟的2毫升木糖梯度标准溶液(0.1毫克/毫升、0.2毫克/毫升、0.3毫克/毫升、0.4毫克/毫升和0..5毫克/毫升，所述木糖梯度标准溶液用去离子水与1毫克/毫升的标准木糖溶液混合制备)或去离子水(木糖空白对照)，与2毫升DNS混合沸水浴5分钟，冷却，去离子水定容15毫升后，用分光光度计在550纳米下分别测定反应后木糖梯度标准溶液的光吸收值，以光吸收值为横坐标，木糖浓度为纵坐标绘制标准曲线。由该标准曲线可得回归方程y＝bx+a，其中，x为光吸收值，y为木糖浓度，a为所得直线方程的截距，b为所得直线方程的斜率；
取0.2毫升待测酶液与1.8毫升所述1重量％木聚糖溶液或pH＝4.8的0.1摩尔/升乙酸—乙酸钠缓冲溶液(木聚糖空白对照)，按照与上述木糖梯度标准溶液相同的步骤测试光吸收值。并按照下式计算半纤维素酶的活力：
式中x为待测酶液的光吸收值，b和a与木糖浓度对光吸收值的回归方程中的b和a一致，n为酶的稀释倍数，60表示为酶促反应的时间为60分钟，5为取样倍数(这里从1毫升待测酶液中取出了0.2毫升进行测试)。
根据上述方法可以测定出具体的半纤维素酶的活力，进而计算出半纤维素酶的用量。
所述含纤维素原料可以是各种农作物的秸秆、草本植物的茎杆等，如玉米秸秆、稻草、小麦秸秆、高粱秆等。由于秸秆的主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，为了在酶解时能使纤维素酶和半纤维素酶充分与秸秆中的纤维素和半纤维素接触进行充分酶解，在酶解之前优选还对含纤维素原料进行预处理以将纤维素、半纤维素和木质素分离开。
所述含纤维素原料的预处理方法可以是本领域技术人员公知的方法，例如，酸处理方法和/或蒸汽爆破方法。所述酸处理方法包括将含纤维素原料与酸混合以溶解木质素而使之与纤维素和半纤维素分离。所述用于溶解含纤维素原料中的木质素的酸的种类为本领域技术人员所公知，如：所述酸可以是本领域常规的各种酸，如，选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种；所述酸的用量和浓度没有特别限定，可以根据需要溶解的含纤维素原料中木质素的量控制酸的用量和浓度。
所述蒸汽爆破方法包括将含纤维素原料与水混合后进行蒸汽爆破或者直接将含纤维素原料置于蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破。由于蒸汽爆破方法更有利于破坏含纤维素原料中纤维素、半纤维素和木质素之间的网状结构，使纤维素能够被充分分离出来，有利于纤维素酶在纤维素表面的作用，提高纤维素的水解率及糖的产率。因此，本发明优选所述含纤维素原料的预处理方法为蒸汽爆破方法，所述含纤维素原料优选为蒸汽爆破的含纤维素原料和/或酸处理的含纤维素原料。
采用现有技术常规的蒸汽爆破条件进行的蒸汽爆破都能达到本发明的发明目的，例如，所述蒸汽爆破的温度为180-200℃，所述蒸汽爆破的压力为1.4-1.8兆帕，所述蒸汽爆破压力的维持时间为3-7分钟。更优选所述蒸汽爆破的温度为185-195℃，所述蒸汽爆破的压力为1.4-1.6兆帕，所述蒸汽爆破压力的维持时间为4-5分钟。
能够发酵戊糖和/或己糖的微生物都可以用于本发明的发酵过程，由于酿酒酵母是酿酒工业上普遍应用的耐酒精、副产物少、乙醇产率高的发酵己糖的微生物；树干毕赤酵母为既可以发酵戊糖也可以发酵己糖的微生物(参见“树干毕赤酵母连续发酵戊糖己糖生成酒精”，季更生等，南京林业大学学报自然科学版，第28卷第3期，第9-13页，2004年)，因此优选所述发酵所使用的酵母为树干毕赤酵母和/或酿酒酵母。以每克酶解产物计，所述发酵所使用的酵母的接种量为103-108菌落形成单位，更优选104-106菌落形成单位。本发明发酵所使用的酵母可以为商购酵母固体制剂(比如干酵母粉)或酵母菌种(比如ATCC编号2601的啤酒酵母)。所述酵母的菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，比如亚甲基蓝染色活菌计数法。亚甲基蓝染色活菌计数法的具体方法如下：
将1克干酵母粉溶于10毫升无菌水中，或将1毫升菌种活化液用无菌水稀释至10毫升，加入0.5毫升0.1重量％亚甲基蓝，在35℃下保温30分钟。在10倍光学显微镜下，用血球计数板计数保温后的溶液中活菌的数目(死菌染色，活菌不染色)，可得1克干酵母或1毫升菌种活化液中活菌的数目，即菌落形成单位数。
所述酵母可以采用常规的方法接种，例如向酶解产物中加入5-15体积％的种子液。所述种子液可以为干酵母的水溶液或培养基溶液，也可以为干酵母或商购菌种的活化种子液。所述发酵的温度可以为任何适于酵母生长的温度，优选为30-36℃，更优选为32-35℃。所述发酵的时间可以为从接种开始至酵母生长的衰亡期出现(即发酵时间为迟滞期、对数期加上稳定期)的时间，优选发酵的时间为32-48小时，更优选32-40小时。发酵产物乙醇可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求(比如燃料酒精要求乙醇的纯度达99％以上)分离并精制，比如蒸馏、浓缩、除水。
另外，蒸汽爆破的压力和温度可以灭菌，酸处理也能够起到杀菌的作用。为防止在酶解过程中杂菌(主要是细菌)污染产生影响酶活力的毒素，并防止在发酵过程中杂菌污染影响酵母的生长，优选在酶解之前加入诸如工业青霉素的细菌抗生素，所述抗生素对酵母没有作用但可以抑制杂菌的生长。以每毫升酶解液或发酵液为基准，所述抗生素的加入量为1-10单位。所述酶解液包括蒸汽爆破产物、酶以及水，所述发酵液包括酶解产物和接种的酵母。
由于在蒸汽爆破的高温高压条件下，含纤维素原料中的半纤维素会产生诸如糠醛、呋喃之类的抑制物，所述抑制物会降低酶的活力和发酵菌的活性，因此所述方法还包括在蒸汽爆破含纤维素原料之后，酶解得到的蒸汽爆破产物之前，水洗所述蒸汽爆破产物。所述水洗是将蒸汽爆破产物与水混合，搅拌，使上述抑制物溶解在水中，然后离心分离蒸汽爆破产物，从而从蒸汽爆破产物中除去抑制物。理论上所述水洗的温度越高，能够溶解的抑制物越多，考虑到能耗，优选所述水洗的温度至少为60℃，更优选为60-80℃。由于水洗所加入的水越多，则溶解抑制物的溶剂越多，但是考虑到离心分离的能耗，优选以每克含纤维素原料的干重计，所述水洗的加水量为2-10克，更优选为2-3克。
由于含纤维素原料中可能会含有沙石杂质以及铁杂质，对蒸汽爆破设备会造成损害，因此本发明的制备乙醇的方法，可以包括在蒸汽爆破之前对含纤维素原料进行除石除铁常规操作，比如以“风送”含纤维素原料并磁铁吸引的方法进行除石除铁。沙石由于质量大，不能被风送到蒸汽爆破设备中，铁杂质由于磁铁的吸引也不会随原料进入蒸汽爆破设备中，从而可以完成除石除铁。此外，由于含纤维素原料本身容易缠结而堵塞设备管路，因此，在进入蒸汽爆破设备前，优选使所述含纤维素原料的大小为0.5-3厘米×0.2-1厘米×0.2-1厘米，更优选使所述含纤维素原料的大小为1-2厘米×0.4-0.6厘米×0.5-1厘米。
下面结合实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例1
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
(1)含纤维素原料的预处理
将1000克没有杂质的玉米秸秆(含水量10％)切成不超过1.2厘米×0.5厘米×1.0厘米的小段，在195℃下维持1.6兆帕的压力5分钟，然后泄压，完成蒸汽爆破。将所得蒸汽爆破产物与70℃水按照质量比1：3搅拌混合30分钟，然后用LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟的转速下进行固液分离，共得到3000克水洗蒸汽爆破产物(含水量为70重量％)。
所得固体蒸汽爆破产物中纤维素总重量和半纤维素总重量的测定：
取10克上述水洗蒸汽爆破产物在45℃下烘干至恒重3克，称量300.0毫克该干燥后的蒸汽爆破产物，放置于重80克的100毫升干燥三角烧瓶内。向所述三角烧瓶内加入3.00毫升浓度为72重量％的硫酸溶液，搅拌1分钟。然后将三角烧瓶在30℃的水浴中放置60分钟，每隔5分钟搅拌一次以确保均匀水解。水解结束后，用去离子水使硫酸的浓度稀释到4重量％，然后用布氏漏斗过滤，共得到滤液84毫升。将20毫升滤液转移至干燥的50毫升的三角瓶中。使用2.5克碳酸钙调节该滤液的pH值至5.5，静置5小时，收集上层清液。用0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，所得滤液用Biorad Aminex HPX-87P高效液相色谱(HPLC)分析。HPLC条件：进样量20微升；流动相为0.2微米滤膜过滤并且超声振荡脱气的HPLC超纯水；流速为0.6毫升/分钟；柱温80-85℃；检测器温度80-85℃；检测器为折光率检测器；运行时间为35分钟。以0.1-4.0毫克/毫升浓度范围的D-(+)葡萄糖和0.1-4.0毫克/毫升浓度范围D-(+)木糖作为标准样品。HPLC分析得到蒸汽爆破产物酸水解液中葡萄糖浓度为1.6毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.134克的葡萄糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的纤维素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽爆破产物中纤维素重量的1.11倍，即1克所述水洗后的蒸汽爆破产物中含纤维素0.121克，则3000克蒸汽爆破产物中共含纤维素363克。HPLC分析得到蒸汽爆破产物酸水解液中木糖浓度为0.4毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.034克的木糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的半纤维素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽爆破产物中半纤维素重量的1.14倍，即1克所述水洗后的蒸汽爆破产物中含半纤维素0.029克，则3000克蒸汽爆破产物中共含半纤维素87克。
(2)酶解
向酶解罐中加入水，并在搅拌下，加入第一批步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽爆破产物，第一批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的35％，然后调节pH值为4，加热至52℃后，以全部秸秆的干重计(900克)，加入18000酶活力单位的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司)，并在52℃下保温混合30分钟；然后加入第二批水洗蒸汽爆破产物，第二批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的35％，并在52℃下保温混合50分钟；然后再加入第三批水洗蒸汽爆破产物，第三批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的30％，并在52℃下保温酶解40小时后得到酶解产物。所述水的加入量与全部水洗蒸汽爆破产物的重量比为2：1。将酶解产物用布氏漏斗过滤，将20毫升滤液转移至干燥50毫升的三角瓶中，静置5小时，收集上层清液。0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，按照上述步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共372.71克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共335.78克，按照下式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。每小时酶解的纤维素的量为8.1克。(以纤维素原料的
Figure S07198402X20070426D00013085224QIETU
重计，第一批含纤维素原料的含量为4.5重量％。)
纤维素转化率＝100％×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量
单糖产率＝100％×酶解得到的葡萄糖重量/秸秆干重
(3)发酵
使酶解产物的温度降至35℃，以每克酶解产物的重量计，接种105菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)，所得混合物在32℃下于发酵罐中搅拌培养40小时。在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇225克，按照下式计算乙醇产率，计算结果见表1。
乙醇产率＝100％×乙醇重量/秸秆干重
对比例1
本对比例说明采用含纤维素原料制备乙醇的参比方法。
按照实施例1的方法制备乙醇，不同的是，在酶解步骤(2)中将步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽爆破产物一次全部加入到含水的酶解罐中，然后与酶混合均匀(全部水洗蒸汽爆破产物与水的重量比为2：1)，酶解时间为41小时20分钟；二次蒸馏得到乙醇170.1克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。
实施例2
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇，不同的是，在含纤维素原料的预处理步骤中，所述蒸汽爆破产物不经过水洗；在酶解步骤中，将蒸汽爆破产物分三批与酶混合，第一批加入的蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽爆破产物重量的60％，在50℃下保温混合100分钟；然后加入第二批蒸汽爆破产物，第二批加入的蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽爆破产物重量的20％，在50℃下保温混合50分钟；然后再加入第三批蒸汽爆破产物，第三批加入的蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽爆破产物重量的20％，在50℃下保温酶解42小时后得到酶解产物。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共366.75克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共330.41克，每小时酶解的纤维素的量为7.4克；发酵步骤同实施例1，二次蒸馏得到乙醇208.8克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。(以纤维素原料的干重计，第一批含纤维素原料的含量为6.9重量％。)
实施例3
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇，不同的是，在酶解步骤中，将水洗蒸汽爆破产物分三批与酶混合，第一批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的20％，在52℃下保温混合20分钟；然后加入第二批水洗蒸汽爆破产物，第二批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的40％，在52℃下保温混合40分钟；然后再加入第三批水洗蒸汽爆破产物，第三批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的40％，在52℃下保温酶解42小时后得到酶解产物。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共367.47克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共331.06克，每小时酶解的纤维素的量为7.7克；在发酵步骤中，不同的是，使酶解产物的温度降至32℃，以每克酶解产物的重量计，接种106菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)，所得混合物在32℃下于发酵罐中搅拌培养36小时；在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇221.4克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。(以纤维素原料的干重计，第一批含纤维素原料的含量为2.7重量％。)
实施例4
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇，不同的是，在酶解步骤中，将水洗蒸汽爆破产物分三批与酶混合，第一批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的10％，在52℃下保温混合10分钟；然后加入第二批水洗蒸汽爆破产物，第二批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的40％，在52℃下保温混合50分钟；然后再加入第三批水洗蒸汽爆破产物，第三批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的50％，在52℃下保温酶解42小时后得到酶解产物。所述水的加入量与全部水洗蒸汽爆破产物的重量比为3.5：1。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共349.92克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共315.24克，每小时酶解的纤维素的量为7.3克；发酵步骤同实施例1，二次蒸馏得到乙醇219.6克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。(以纤维素原料的干重计，第一批含纤维素原料的含量为0.8重量％。)
实施例5
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
(1)含纤维素原料的预处理
将1000克没有杂质的玉米秸秆(含水量10％)切成不超过1.5厘米×0.4厘米×1.0厘米的小段，将秸秆段水浸5分钟后(秸秆与水的重量比为2.5：1)在190℃下维持1.5兆帕的压力5分钟，然后泄压，完成蒸汽爆破。将所得蒸汽爆破产物与65℃水按照质量比1：3搅拌混合30分钟，然后用LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟的转速下进行固液分离。共得到3250克蒸汽爆破产物(含水量为72.3重量％)。
按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解蒸汽爆破产物的方法，得到蒸汽爆破产物酸水解液中葡萄糖浓度为1.62毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.136克的葡萄糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的纤维素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽爆破产物中纤维素重量的1.11倍，即1克所述水洗后的蒸汽爆破产物中含纤维素0.123克，则3250克蒸汽爆破产物中共含纤维素399.75克。HPLC分析得到蒸汽爆破产物酸水解液中木糖浓度为0.41毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的蒸汽爆破产物酸水解能得到重量为0.034克的木糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽爆破的产物的半纤维素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽爆破产物中半纤维素重量的1.14倍，即1克所述水洗后的蒸汽爆破产物中含半纤维素0.030克，则3250克蒸汽爆破产物中共含半纤维素97.5克。
(2)酶解向酶解罐中加入水，并在搅拌下，加入第一批步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽爆破产物，第一批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的60％，然后调节反应物料的pH值为5，并加热至50℃后，以全部秸秆的干重计(900克)，加入16000酶活力单位的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司)和4500酶活力单位的半纤维素酶(北京化学试剂公司)，并保温混合80分钟；然后加入第二批水洗蒸汽爆破产物，第二批加入的水洗蒸汽爆破产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽爆破产物重量的40％，保温酶解42小时后得到酶解产物。并按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共369克，所述酶解得到的葡萄糖的重量除以1.11，即蒸汽爆破产物中被酶解的纤维素的重量共332.43克，测定并计算出酶解产物中的木糖共78.14克，所述酶解得到的木糖的重量除以1.14，即蒸汽爆破产物中被酶解的半纤维素的重量共68.54克，每小时酶解的纤维素和半纤维素的总重量为9.26克；并按照下述公式计算纤维素、半纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。(以纤维素原料的干重计，第一批含纤维素原料的含量为6.4重量％。)
纤维素转化率＝100％×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量
半纤维素转化率＝100％×被酶解的半纤维素的重量/半纤维素的总重量
单糖产率＝100％×(酶解得到的葡萄糖重量+酶解得到的木糖重量)/秸秆干重
(3)发酵
使酶解产物的温度降至34℃，以每克酶解产物的重量计，接种为104菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)和104菌落形成单位的树干毕赤酵母，所得混合物在33℃下于发酵罐中搅拌培养37小时。在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇331.2克，并按照实施例1的公式计算乙醇产率，计算结果见表1。
实施例6
本实施例用于说明本发明的采用含纤维素原料制备乙醇的方法。
按照实施例1的方法制备乙醇，不同的是，在含纤维素原料的预处理步骤中，采用酸处理含纤维素原料，该方法包括，在140℃，0.06兆帕压力下，将1000克玉米秸秆(含水量为10％)，与250毫升浓度为2重量％的稀硫酸保温混合40分钟，得到酸处理产物。将所得酸处理产物过滤，并与水按照质量比1：3搅拌混合30分钟，然后用LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟的转速下进行固液分离。共得到3600克酸处理含纤维素原料产物(含水量为75重量％)。
按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解蒸汽爆破产物的方法，得到酸处理产物酸水解液中葡萄糖浓度为1.8毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的酸处理产物酸水解能得到重量为0.126克的葡萄糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将酸处理产物中的纤维素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是酸处理产物中纤维素重量的1.11倍，即1克所述水洗后酸处理产物中含纤维素0.114克，则3600克酸处理产物中共含纤维素408.65克。HPLC分析得到酸处理产物酸水解液中木糖浓度为0.8毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后酸处理产物酸水解能得到重量为0.057克的木糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将酸处理产物的半纤维素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是酸处理产物中半纤维素重量的1.14倍，即1克所述水洗后酸处理产物中含半纤维素0.050克，则3600克酸处理产物中共含半纤维素181.62克。
在酶解步骤中，不同的是，在向含有水的酶解罐中加入第一批步骤(1)取样测试后剩余的酸处理产物后，加入NaOH调节物料的pH值为5，加热至52℃后，以全部秸秆的干重计(900克)，加入18000酶活力单位的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司)，并在49℃下保温混合30分钟；然后再按照实施例1的酶解步骤中的方法分批加入随后的物料，其它的步骤和条件与实施例1的方法相同。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共362.88克，所述酶解得到的葡萄糖的重量除以1.11，即酸处理产物中被酶解的纤维素的重量共326.92克；每小时酶解的纤维素和半纤维素的总重量为7.9克。(以纤维素原料的干重计，第一批含纤维素原料的含量为3.7重量％。)
在发酵步骤中，不同的是，使酶解产物的温度降至33℃，以每克酶解产物的重量计，接种106菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)，所得混合物在33℃下于发酵罐中搅拌培养36小时。在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇218.7克。按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。
表1
 
实施例或对比例 实施例1 对比例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
纤维素转化率(％)         92.5 72.5 91.0 91.2 86.8 83.2 80
半纤维素转化率(％)           - - - - - 70.3 -
单糖产率(％) 41.41 33.72 40.75 40.83 38.88 49.6 40.32
乙醇产率(％) 25.0 18.9 23.2 24.6 24.4 36.8 24.3
从上表1中的数据可以看出，采用本发明的采用含纤维素原料制备乙醇的方法得到的乙醇的产率以及单糖的产率均明显高于由参比方法得到的乙醇的产率以及单糖的产率。

Claims (6)

1.一种采用含纤维素原料制备乙醇的方法，该方法包括将含纤维素原料与酶混合，将含纤维素原料酶解，得到酶解产物，并发酵该酶解产物，其特征在于，所述将含纤维素原料与酶混合的方法包括将含纤维素原料分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的含纤维素原料的量至多为全部含纤维素原料重量的60％；第一批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-60％，第一批以后与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的40-80％；所述含纤维素原料为秸秆；以第一批含纤维素原料与酶混合后得到的混合物为基准，以纤维素原料的干重计，含纤维素原料的含量至少为1重量％；相邻的两个分批混合步骤之间还包括时间间隔；所述酶解使用的酶包括纤维素酶，以每克含纤维素原料的干重计，所述纤维素酶的用量为8-20酶活力单位；所述含纤维素原料为蒸汽爆破的含纤维素原料和/或酸处理的含纤维素原料；所述酶解的温度为45-55℃，所述酶解的时间为25-48小时，所述酶解的pH值为3.0-7.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分批次数为3次，第一批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-60％；第二批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-50％；第三批与酶混合的含纤维素原料的量为全部含纤维素原料重量的20-40％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，以第一批含纤维素原料与酶混合后得到的混合物为基准，以纤维素原料的干重计，含纤维素原料的含量为1.2-10重量％。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述时间间隔为10-120分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶解使用的酶还包括半纤维素酶，以每克含纤维素原料的干重计，所述半纤维素酶的用量为4.4-8.8酶活力单位。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵所使用的酵母为树干毕赤酵母和/或酿酒酵母；以每克酶解产物计，所述发酵所使用的酵母的接种量为103-108菌落形成单位，所述发酵的温度为30-36℃，发酵的时间为32-48小时。
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