CN112662710B - 一种利用木质纤维素连续发酵生产l-乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用木质纤维素连续发酵生产L‑乳酸的方法，包括以下步骤：在发酵罐中加入蒸汽爆破处理后的生物质材料和纤维素酶进行酶解12‑15h，酶解结束后，将嗜热凝结芽孢杆菌种种子液接种于含有基础料的发酵罐中，在45‑50℃进行发酵20‑30h，之后每隔1‑2h分离少量发酵罐中的料液，同时补充含有生物质材料和纤维素酶的连续发酵补料液，补充的补料液体积略小于分离料液，使开始分离40‑60h后发酵体系总的料液体积减少2‑5％，一次性补加凝结芽孢杆菌种种子液，条件是每次补加凝结芽孢杆菌种种子液后体系中总的料液体积恢复至初始水平，完成一次分离‑补料过程，反复进行发酵罐内料液分离‑补料，直到产出的乳酸含量降低到80g/L以下。

Description

一种利用木质纤维素连续发酵生产L-乳酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵制备乳酸工程技术领域，具体涉及一种利用木质纤维素连续发酵生产L- 乳酸的方法。

背景技术

地球上储存着数量巨大的生物质，每天在植物光合作用下都有新的生物质大量产生，生物质被分为两类，一类是能被人类充分利用的，例如粮食，木材等，另一类是目前尚未被人类完全利用的生物质，例如废弃的秸秆，稻草等。废弃的生物质是伴随着农业生产而产生的，主要成分为纤维素、半纤维素、木质素等。纤维素是葡萄糖通过β葡萄糖苷键聚合而成，半纤维素则由木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖聚合而成，纤维素和半纤维素在纤维素酶的作用下酶解为单糖和二糖，可作为微生物发酵生产的原料。

乳酸是α羟基丙酸，作为世界公认的三大有机酸之一，在食品、药品、轻工、化工等领域运用广泛。经预处理的生物质，通过纤维素酶酶解得到含单糖和二糖的糖化酶解液，微生物利用这种酶解液可生产乳酸，从而得到具备多种用途的有机原料。

连续发酵是指以一定的速率向发酵罐内添加新鲜的培养基，同时以相同的速率流出发酵液，从而使得发酵体系维持稳定的发酵过程。连续发酵具有以下特点：1.相较于分批发酵，菌种生长的凝滞期短，菌种适应性更强，缩短了发酵周期。2.容易实现全自动化，连续化，工业化生产。3.产物稳定能人力物力成本，不用反复清洗设备。4.对设备精度要求高，培养基利用率还有待提高。

CN201010624057.0公开了一种连续发酵生产L-乳酸的方法。该方法以农作物废弃糖化液为碳源，通过乳酸菌连续发酵生产L-乳酸，只经过一次接种，发酵完成后分离80-85％的发酵液，剩下的发酵液作为种子传代培养，可连续发酵20代，单批发酵周期为24-30h。该方法相对于分批发酵提高了发酵效率，节省了时间成本，但是生物质酶解糖化液制备时间较长，约60-70h，且每次分离乳酸发酵液时间不连续，不适合于工业化生产。

CN01134135.1公开了一种膜耦合清液单罐细菌连续发酵的左旋-乳酸生产工艺。该方法分离了玉米的胚芽和胚乳，利用胚芽榨取玉米油，胚乳经过液化、糖化、分离分别得到糖化液和纤维蛋白饲料，再利用糖化液连续发酵，通过纳滤膜透过制得L-乳酸。该方法污染小，排放少，原料利用率高，但是用粮食作为原料，过于浪费资源。

上述所有方法中均未能利用废弃秸秆，连续发酵生产乳酸，但是发酵的效率和菌的利用率还不能满足工业化生产需求。本发明在此基础上，开发出一种乳酸连续同步糖化发酵的方法，发酵周期短，乳酸产量高，纯度高，对于发酵所用菌的利用率高，极具大规模工业化生产的前景。

发明内容

本发明的目的在于提出一种利用木质纤维素发酵生产L-乳酸的方法，该方法工艺简洁、发酵周期短、乳酸光学纯度高、乳酸产量高、易于提纯、整个生产过程无污染，便于产业化。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种利用木质纤维素连续发酵生产L-乳酸的方法，包括以下步骤：在发酵罐中加入蒸汽爆破处理后的生物质材料和纤维素酶进行酶解12-15h，酶解结束后，将嗜热凝结芽孢杆菌种种子液接种于含有基础料的发酵罐中，在45-50℃进行发酵20-30h，之后每隔1-2h分离少量发酵罐中的料液，同时补充含有生物质材料和纤维素酶的连续发酵补料液，补充的补料液体积略小于分离料液，使开始分离40-60h后发酵体系总的料液体积减少2-5％，一次性补加凝结芽孢杆菌种种子液，条件是每次补加凝结芽孢杆菌种种子液后体系中总的料液体积恢复至初始水平，完成一次分离-补料的步骤，反复进行发酵罐内料液分离-补料，直到产出的乳酸含量降低到80g/L以下。

随着分离-补料的不断进行，一方面凝结芽孢杆菌逐渐失去活性，另一方面有效生物量也在下降，因此当分离出的料液中乳酸含量降低到80g/L以下，即可以出罐。

本发明通过连续法进行发酵，一直补充种子液，使凝结芽孢杆菌保持一定的生物量，考虑生产周期和成本，一般分离-补料的循环可以进行3-6次，每次的时间为40-60h，或者总的生产周期为150-360h。

进一步地，接种后发酵罐内嗜热凝结芽孢杆菌的密度为5-8×10⁶/mL，在发酵罐中的环境 (100-120rpm，50℃)培养24h后，嗜热凝结芽孢杆菌密度为6-10×10⁸/mL。

所述嗜热凝结芽孢杆菌的种子液培养的方法是本领域所熟知的，产乳酸菌株：嗜热凝结芽胞杆菌(B.coagulans)。种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，氯化钠2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，固体添加琼脂粉20g/L，氢氧化钠调pH值到6.0。种子培养皿培养：吸取嗜热凝结芽胞杆菌甘油管中的菌液50-100μL，接种于灭菌后的固体种子培养基中，用无菌涂布棒均匀涂抹开甘油菌液，50℃培养24h。种子罐培养：配置液体种子培养基并灭菌，向培养24h后的培养皿中加入4-6mL无菌水，用涂布棒刮洗菌体，得到嗜热芽孢杆菌悬液作为种子液。将种子液接种于灭菌后的种子罐内，接种后罐内嗜热凝结芽孢杆菌的密度为5-8×10⁶/mL，100-120rpm， 50℃培养24h，培养后的嗜热凝结芽孢杆菌密度为6-10×10⁸/mL，即得到连续发酵所需的种子液。嗜热脂肪芽孢杆菌种子罐培养基相同，培养转速为110-130rpm，温度为55℃，培养 24h。

所述基础料成分：生物质材料酶解液中加入玉米浆粉7.5-8.5g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，硫酸铵1.4-1.8g/L，硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.05g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L。

本领域技术人员所清楚的是，在微生物发酵时，所加入物质的量是以加入该物质后，体系内该物质的浓度g/L来表示。

所述生物质材料是收割废弃植物秸秆(玉米秸秆、芒草秸秆、芦苇秸秆等)，所述蒸汽爆破处理是生物质材料经过粗粉碎机粉碎粗颗粒(1-3cm)投入气爆罐内，通饱和蒸汽加热到 180℃-210℃，维持20min-30min，泄压，收集蒸汽爆破后的物料，烘干备用，蒸汽爆破后通过烘干机烘干至含水质量分数≤10％。木质纤维素材料的添加量为总体系15-20％(kg/L)

所述纤维素酶是来源于里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)，该纤维素酶液滤纸酶活能达到40FPU/mL，酶液呈淡黄色。气爆后的生物质材料，按照材料质量向其中加入10-14FPU/g 的纤维素酶液，得到的固液混合物投入发酵罐内，按照材料量加入水，使得生物质材料占总体系的15-20％(w/v,kg/L)。酶解过程中温度维持45-50℃，搅拌转速为120-150rpm。

进一步地，所述补充凝结芽胞杆菌的种子液是嗜热凝结芽胞杆菌(B.coagulans)培养24 h的种子液，嗜热凝结芽孢杆菌密度为6-10×10⁸/mL。

所述连续发酵补料液的成分是：生物质材料质量比为15-20％，里氏木霉产纤维素酶液(40 FPU/mL)，添加量为8-20FPU/g，优选10-16FPU/g，更优选12-14FPU/g。

所述每隔1-2h分离少量发酵罐中的料液，是每次分离料液总体积的3-5％的料液，同时补连续发酵补料液，条件是每次分离料液的体积比补充的料液体积多料液总体积的0.05-0.1％。

在第一次分离发酵罐料液后，每隔40-60h补加凝结芽孢杆菌种种子液，补加的量是使料液总体积恢复至初始水平。

由于每次补充的料液体积少于分离的料液，因此体系中总的料液体积是减少的。在每隔 40-60h补充种子液，使料液总体积恢复至初始水平。比如，每隔1h分离料液总体积的3.05％的料液，同时补充料液总体积的3％的连续发酵补料液，相当于每小时料液的总体积减少 0.05％，这样在60h后，料液的总体积减少3％，此时补充种子液，补充的种子液体积为初始料液总体积的3％，这样就相当于将不断分离料液产生的料液总体积减少的量恢复至初始水平。再比如，每隔2h分离料液总体积的3.5％的料液，同时补充料液总体积的3.4％的连续发酵补料液，相当于每2小时料液的总体积减少0.1％，这样在60h后，料液的总体积减少也是 3％，此时补充嗜热凝结芽胞杆菌种子液，补充的种子液体积为初始料液总体积的3％，使不断分离料液产生的料液总体积减少的量恢复至初始水平

优选地，除了补加凝结芽孢杆菌种种子液，还可以补加嗜热脂肪芽孢杆菌种种子液。补加的种子液中凝结芽孢杆菌种种子液的密度为6-10×10⁸/mL，嗜热脂肪芽孢杆菌密度为 3-4×10⁸/mL。

发明人预料不到地发现，再补加种子液时，种子液种除了嗜热凝结芽孢杆菌，加入一定量的嗜热脂肪芽孢杆菌，两种菌一起发挥了协同作用，可以更有效地促进发酵，提高了发酵菌的总的利用效率，使发酵后乳酸的浓度提高，并且纯度更高。

在本发明的一个优选技术方案中，在酶解阶段，即在0-15h内转速为120-150rpm，在菌体生长稳定阶段，即从酶解结束后的20-30h，转速为150-180rpm；在连续发酵阶段转速为 70-110rpm。

进一步地，在连续发酵过程中需要补加加氢氧化钙调节发酵体系pH值为5-6，优选5.5-5.8。可以用氢氧化钙悬浊液，也可以直接投入氢氧化钙粉末。

本发明具有如下有益效果：

一、本发明中采用了连续化同步糖化发酵生产L-乳酸，每隔1-2h分离料液并且补充一定量的连续发酵补料液，每隔40-60h补充种子液，更够充分利用发酵菌，使发酵体系内菌的活性始终保持一个最佳值，进而提高L-乳酸的生产效率以及产品的质量更加稳定。

二、发明人预料不到地发现，在补充种子液时，加入嗜热凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的复合菌种子液，两种菌一起发挥了协同作用，可以更有效地进行发酵，提高了发酵菌的总的利用效率，使发酵后乳酸的浓度提高，并且纯度更高。

三、本发明采用的连续化发酵，采用了阶梯式的转速，在酶解阶段，即在0-15h内转速为120-150rpm，在菌体生长稳定阶段，即转速为150-180rpm；在连续发酵阶段转速为 70-110rpm。本发明通过在生产的不同阶段设立不同的转速，能够提高菌的利用率，促进乳酸生产。

四、整个连续化发酵生产过程简单，整个过程只需要分离料液，补加种子液即可，连续性；所得产品L-乳酸光学纯度高、有效控制了生产成本，便于产业化。

附图说明

图1是酶解阶段转速的影响。

图2是菌体生长稳定阶段转速的影响。

图3是连续发酵阶段转速的影响。

图4是实施例4发酵全过程中生物量变化量。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，乳酸的浓度测试按照如下方法进行：乳酸样品处理：发酵上清液10000rpm 离心10min，用超纯水稀释合适倍数后，用0.22μm滤头过滤。

乳酸浓度测定方法：高效液相色谱法(HPLC)检测乳酸浓度，色谱仪为LC-20A，色谱柱为Aminex HPX-87H，流动相为5mmol/L硫酸水溶液，流速为0.6mL/min，柱温箱温度为 50℃，进样量为5μL，检测器为RID-10A型示差折光检测器。

酶解糖测定方法按照如下方法进行：高效液相色谱法(HPLC)检测葡萄糖、木糖和纤维二糖，色谱柱为Benson Carbohydrate Column 8200-0BP-800，流动相超纯水，流速为0.6 mL/min，柱温箱温度为80℃，进样量为5μL，检测器为RID-10A型示差检测器。

实施例1生物质材料所需纤维素酶液用量

生物质材料预处理后主要成分为纤维素和木质素，利用纤维素酶可将纤维素酶解为单糖和二糖。纤维素酶液体为里氏木霉发酵产的发酵上清液，添加合适的纤维素酶液，能节省生物质材料酶解成本，按照预处理后生物质材料质量来添加纤维素酶液，添加量分别为8、10、 12、14、16、18、20FPU/g，预处理后的生物质材料占酶解总体系质量比为15％，剩余部分为水。酶解温度为50℃，酶解时长为24h，搅拌转速为120-150rpm。测定酶解后的上清液中纤维二糖、木糖、葡萄糖的含量，其结果如表1所示。

表1添加不同纤维素酶酶解生物质材料含糖量

由表1可知，里氏木霉产纤维素酶液添加量在12FPU/g以上，继续多添加纤维素酶无法酶解获得更多的可发酵糖，而纤维素酶添加量小于12FPU/g时，添加的纤维素酶不足以在24 h内酶解完生物质材料中所有的纤维素。由此可判断最佳的纤维素酶添加量为12-14FPU/g。

实施例2转速的影响

本发明的连续发酵可以分为三个阶段，分别是生产初期的酶解阶段，为初始至12-15h；生产中期为菌体生长稳定阶段，是酶解阶段结束后开始，持续20-30h；最后是生产的后期，即连续发酵阶段。本发明在不同阶段采用了不同的阶梯的转速，能够最大限度提高生产效率，提高产能。

在同一个发酵罐内，先进行废弃秸秆酶解12-15h，再接种嗜热凝结芽胞杆菌(B.coagulans)的种子培养液培养21h，开始连续补料和分离发酵液。这一过程中，生产前期是酶解阶段，转速为120-150rpm；在生产的中期，菌体生长稳定过程需要较高转速，使微生物和体系内的糖充分接触，提高生产效率，为150-180rpm；在生产的后期，即开始分离，补加料液的连续发酵过程，需要较慢的转速，这样菌体厌氧开始大量产生L-乳酸，因此在连续发酵过程中转速为70-110rpm。

酶解过程中搅拌作用是为了使纤维素酶与生物质材料充分混匀，过高的转速不会增加酶解效果，造成能耗浪费；过低的转速却达不到酶解充分的目的，由此设置梯度转速，探究最适的酶解转速。在菌体生长阶段过程中不分离发酵液也不补加料液，此过程中嗜热凝结芽孢杆菌迅速生长，需要转速较快，而以后发酵进入连续生产乳酸阶段，菌体在无氧条件下能产生更多的乳酸，适当降低转速可以促进乳酸生成。在不同的阶段以不同的转速进行测试，分别是酶解阶段、菌体生长稳定阶段、连续发酵阶段，结果分别如图1-图3所示。

由图1可知酶解转速达到130rpm以后，增加转速酶解效果也没有得到提升，而转速未达到130rpm前，增加转速能提高酶解效果，由此可知最适合的酶解转速为130-140rpm。由图2可知，菌体生长稳定阶段阶段当转速达到170rpm后嗜热凝结芽孢杆菌的生物量能接近1×10⁹/mL，最适的培养转速为170-180rpm。由图3可知产乳酸连续发酵阶段，较低转速可以促进乳酸的生产，转速在80-100rpm情况下，分离的发酵液中乳酸含量能达到90g/L以上。

实施例3乳酸连续发酵补加料液与分离发酵液的速率

乳酸连续发酵经过最初的21小时后，开始进行补料和分离发酵液，不同的分离速率决定了分离出的产品质量，选择最适合的分离速率能使得生物质材料被充分的利用。嗜热凝结芽孢杆菌在发酵罐内生长繁殖同时利用酶解液中的可发酵糖生产乳酸，发酵补料液从发酵罐顶部补入，发酵液从底部分离，发酵体系维持动态平衡。补料和分离的速率过快会导致补料液中的生物质材料没有被充分利用，产出的乳酸浓度不够，固体产物中混合了纤维素；分离速率过慢会导致生产效率不足，能耗过大增加成本。由此，设计不同的分离和补料速率，测定其分离的发酵液中乳酸的含量，发酵固体烘干后的质量和发酵固体物质中纤维素占比，得到表2。

表2不同补料、分离速率对于连续发酵的影响

由表2可知最适合的连续发酵补料、分离速率为每小时分离发酵总体系的3％，发酵液中乳酸浓度能达到较稳定值95g/L，继续减少速率会使未酶解的纤维素在分离的固体物质中占比明显增加，乳酸产量降低。过缓分离速率会降低生产效率，以3％的速率分离约33h可完成等同于一次分批发酵生产量，而以2.5％的速率则需40h完成，综合考虑，每小时分离发酵总体系的3％可作为最优选择。

实施例4连续发酵过程中的种子液补加

乳酸连续发酵过程中，发酵体系主要以无氧发酵为主，发酵过程中嗜热凝结芽孢杆菌主要代谢途径为乳酸代谢途径，在此情况下菌种繁殖的速率会减缓，连续发酵一段时间后发酵体系内生物量会减低，因此需要补入新培养的嗜热凝结芽孢杆菌种子液。种子补加只能单次全部加入，而连续发酵过程中发酵体系不可大幅度改变，因此每小时分离的发酵液要比补充的补料液多出总发酵体系体积0.05％，累计60h总共多分离3％体积的发酵液，再补加等量的种子液，即总发酵体系体积3％的种子液，使发酵体系恢复原始体积，此方法发酵全过程中生物量变化如图4所示。

由图4可知，乳酸连续发酵过程中随着发酵液的分离，嗜热凝结芽孢杆菌的生物量也随之下降，每隔60h进行一次3％体积比的种子液补料，这一方法可以使得发酵体系内的生物量不低于5×10⁷/mL，连续发酵全过程中都有充足且富有活力的细胞，转化单糖和二糖为乳酸。

实施例5

(1)在1500L的发酵罐内进行乳酸连续发酵，嗜热凝结芽孢杆菌培养皿在培养箱50℃培养24h，利用无菌水刮洗，收集刮洗的种子液50mL加入灭菌完毕的含有100L种子培养基的150L种子发酵罐内，接种完毕后110rpm，通气量为0.3-0.5vvm，温度50℃培养24h，嗜热凝结芽孢杆菌密度达到8.5×10⁸/mL,用氢氧化钠溶液调节pH为5.8-6.2。

(2)在1500L发酵罐中加入木质纤维素材料300kg玉米秸秆和里氏木霉产纤维素酶液 14FPU/g，酶解条件为：转速120-150rpm，温度50℃。种子罐培养完成时直接将种子罐内的种子液转接入1500L发酵罐内，发酵罐内木质纤维素材料酶解时长为12h。接种后将转速提升至160rpm，不通气使得凝结芽孢杆菌充分的与酶解后的木质纤维素材料混匀，进行生化反应，纤维素酶和微生物共同作用，酶解纤维素的同时将可发酵糖类厌氧发酵转化为乳酸，该过程从酶解挤出开始继续21h。

(3)酶解和生物反应稳定后，开始进行分离发酵液，分离速率为每小时分离初始发酵体系的3.05％(v/v)，并向1500L发酵罐内持续补加木质纤维素材料含量为15％(w/v)的含有 14FPU/g里氏木霉纤维素酶的混合料液，补料料液的量为初始发酵体系的3％(v/v)，补料和分离的速率为匀速，此阶段转速降低为90rpm，由变频调速蠕动泵缓慢分离和补料。

(4)每分离发酵液60h，体系减少3％体积量的料，此时补加初始发酵体系3％的种子液，种子液中嗜热凝结芽孢杆菌密度为7×10⁸/mL，嗜热脂肪芽孢杆菌密度为3×10⁸/mL，1500L 大罐补菌种前24h进行种子罐培养，种子罐的培养完成后立刻接种，不得保留存放，以免导致种子活力降低。补加后，继续按照每小时分离初始发酵体系的3.05％(v/v)，和补加木质纤维素材料和里氏木霉纤维素酶的混合料液，每60h补充初始发酵体系3％的种子液。一共进行 5次分离-补料的循环，共收集约13700L含有乳酸的料液，经高效液相色谱测定乳酸含量，约105.2g/L。将分离的粗乳酸产品酸化、絮凝、吸附、超滤、纳滤、反渗透、薄膜蒸发、分子蒸馏纯化得到淡黄色纯净的乳酸精产品，该产品由液相色谱测定其乳酸的含量和光学纯度，乳酸含量达到90％以上，L乳酸光学纯度高于98％。

按照本发明的连续化生产方法，能够在菌种不失活的条件下该发酵体系能连续产能超过 300h以上，可以减少设备的清洗和维护次数。

实施例6

其他操作和条件和实施例5相同，区别在于步骤(4)中不加的种子液中不含嗜热脂肪芽孢杆菌。之后一共分离得到13700L发酵料液，效液相色谱测定乳酸含量，约96.3g/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种利用木质纤维素连续发酵生产L-乳酸的方法，包括以下步骤：在发酵罐中加入蒸汽爆破处理后的生物质材料和纤维素酶进行酶解12-15h，酶解结束后，将嗜热凝结芽孢杆菌种种子液接种于含有基础料的发酵罐中，在45-50℃进行发酵20-30h，之后每隔1-2h分离少量发酵罐中的料液，同时补充含有生物质材料和纤维素酶的连续发酵补料液，补充的补料液体积略小于分离料液，使开始分离40-60h后发酵体系总的料液体积减少2-5%，一次性补加嗜热凝结芽孢杆菌种种子液，条件是每次补加嗜热凝结芽孢杆菌种种子液后体系中总的料液体积恢复至初始水平，完成一次分离-补料过程，反复进行发酵罐内料液分离-补料，直到产出的乳酸含量降低到80g/L以下；

纤维素酶是来源于里氏木霉菌株（Trichoderma reesei），添加量为8-20 FPU/g；

所述每隔1-2h分离少量发酵罐中的料液，是每次分离料液总体积的3-5%的料液，同时补连续发酵补料液，条件是每次分离料液的体积比补充的料液体积多料液总体积的0.05-0.1%；

在酶解阶段，即在0- 15h内转速为120-150rpm，在菌体生长稳定阶段，即从酶解结束后的20-30h，转速为150-180rpm；在连续发酵阶段转速为70-110rpm。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离-补料的循环进行3-6次，每次40-60h，或者总的生产周期为150-360h。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，接种后发酵罐内嗜热凝结芽孢杆菌的密度为5-8×10⁶/mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物质材料是废弃植物秸秆，所述蒸汽爆破后通过烘干机烘干至含水质量分数≤10%；木质纤维素材料的添加量为总体系15-20%（kg/L）。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶添加量为10-16 FPU/g。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶添加量为12-14 FPU/g。

7.一种利用木质纤维素连续发酵生产L-乳酸的方法，包括以下步骤：在发酵罐中加入蒸汽爆破处理后的生物质材料和纤维素酶进行酶解12-15h，酶解结束后，将嗜热凝结芽孢杆菌种种子液接种于含有基础料的发酵罐中，在45-50℃进行发酵20-30h，之后每隔1-2h分离少量发酵罐中的料液，同时补充含有生物质材料和纤维素酶的连续发酵补料液，补充的补料液体积略小于分离料液，使开始分离40-60h后发酵体系总的料液体积减少2-5%，一次性补加嗜热凝结芽孢杆菌种和嗜热脂肪芽孢杆菌种种子液，其中嗜热凝结芽孢杆菌种种子液的密度为6-10×10⁸/mL，嗜热脂肪芽孢杆菌密度为3-4×10⁸/mL，条件是每次补加种子液后体系中总的料液体积恢复至初始水平，完成一次分离-补料过程，反复进行发酵罐内料液分离-补料，直到产出的乳酸含量降低到80g/L以下；

纤维素酶是来源于里氏木霉菌株（Trichoderma reesei），添加量为8-20 FPU/g；

所述每隔1-2h分离少量发酵罐中的料液，是每次分离料液总体积的3-5%的料液，同时补连续发酵补料液，条件是每次分离料液的体积比补充的料液体积多料液总体积的0.05-0.1%；

在酶解阶段，即在0- 15h内转速为120-150rpm，在菌体生长稳定阶段，即从酶解结束后的20-30h，转速为150-180rpm；在连续发酵阶段转速为70-110rpm。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在连续发酵过程中需要补加氢氧化钙调节发酵体系pH值为5-6。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，补加氢氧化钙调节发酵体系pH值为5.5-5.8。

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