CN101736058A

CN101736058A - 一种以菊芋为原料生物转化生产甘露醇的方法

Info

Publication number: CN101736058A
Application number: CN200810229066A
Authority: CN
Inventors: 杜昱光; 朱豫; 曹海龙; 周正; 李曙光; 白雪芳
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2010-06-16

Abstract

本发明涉及利用一种优质果糖基生物质原料——菊芋的糖化处理工艺及以菊芋为碳源发酵生产甘露醇的菌种选择和工艺优化，1)将菊芋块茎粉碎成粗颗粒，水浸酶解6小时后过滤，上清42℃旋转蒸发浓缩，得高果糖浓度的糖化菊芋汁；2)建立高效液相色谱分析检测条件，能够同步分析发酵液底物(葡萄糖和果糖)及产物(甘露醇)的含量；3)利用不同总糖浓度的糖化菊芋汁考察了7种乳酸菌发酵产乳酸及甘露醇的生产能力，确定了一种果糖转化率高、生产强度高的乳酸菌并优化了其生产发酵条件和耐受底物的最高浓度。通过补料发酵可提高生产效率并连续化大量生产甘露醇。该方法不仅没有副产物山梨醇产生，而且生产成本低，原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟，可产业化实施。

Description

一种以菊芋为原料生物转化生产甘露醇的方法

技术领域

本发明涉及甘露醇的生产，具体地说是一种以菊芋为原料，通过粉碎、酶解、浓缩等手段加工成微生物可以利用的发酵原料，再利用微生物转化法生产甘露醇的方法。

背景技术

甘露醇(D-mannitol)又名甘露糖醇、己六醇。易溶于水，微溶于乙醇和甘油，对稀酸、稀碱稳定，是多元醇中唯一一种不吸湿的晶体。医药上，甘露醇主要作为脱水药、利尿药，用于治疗脑积水、降低颅内压、肾功能衰竭的输液和针剂的配料中，也可与氨基酸等配制成复合输液，同时可作为防治早期肾功能不全的药物中间体和脑血管舒张剂。由于其具有不吸湿性，还可用作抗癌药、抗菌药以及维生素等片剂的赋型剂；在化学工业上，它可以作为合成树脂和涂料的原料、聚氯乙烯的增塑剂、合成洗涤剂的助洗剂及织物柔软剂等；在食品工业上，由于甘露醇不吸湿，甜度适宜，热量低，无毒、副作用，在人体内代谢与胰岛素无关，不提高血糖值，不致龋齿等特点，可用作糖尿病、肥胖病人的甜味剂和功能性食品添加剂。

目前世界上广泛应用的生产方法为提取法、化学合成法和电解还原法。但以上方法不同程度地存在副产物山梨醇的产生，而且收率低。由于微生物发酵法生产甘露醇具有其它生产方法所不具备的优越性，能够有效避免副产物山梨醇的产生，因此有着广阔的应用前景。

许多微生物可通过其自身的细胞代谢工厂，将葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖等糖源发酵产生甘露醇。1966年Foda就利用产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)发酵葡萄糖溶液(50g/L)并成功地合成出24g/L甘露醇。Kyung-Hwa Song等(2002)分离出一株属于假丝酵母菌属的甘露醇高产酵母菌株C.magnoliaeHH-01。该菌株在葡萄糖和果糖为碳源的培养基中可以生产甘露醇。尽管酵母菌和丝状真菌具有以葡萄糖等碳水化合物合成甘露醇的能力，但其生产甘露醇的容积产率比较低，目前难以应用于工业化生产。而且，产甘露醇真菌中的大多数可利用已经生成的甘露醇，这使得应用酵母菌或丝状真菌发酵的过程难以控制。纯化所生产的甘露醇，尤其是以酵母菌生产的甘露醇，因其培养基内含有高浓度的甘油而使纯化过程比较复杂。而乳酸菌，尤其是异型发酵乳酸菌在厌氧条件下，将乙酰基磷酸转化成乙酸而不是乙醇，这样就额外产生一个ATP。如此要完成NAD+的再生就需要一个电子受体，而果糖恰好可以作为这样一个受体，于是果糖在NAD(P)H依赖性甘露醇脱氢酶的作用下被还原生成甘露醇。2006年，BadalC.Saha利用筛选到的乳酸菌Lactobacillus intermedius NRRL B-3693以酶解精制菊粉为底物，通过同步糖化发酵，在110小时内可得到0.57g/g底物的收率。但工业化应用，精制菊粉成本较高。

发酵用生物质能源主要有以下几种：糖质原料，淀粉质原料，菊粉质原料和木质纤维素类原料。糖质原料来自于富含蔗糖的一类植物中，包括甜菜、甘蔗以及甜高粱等；淀粉质原料来自于富含淀粉的植物中，主要有玉米、小麦、木薯、甜薯；木质纤维素原料存在于稻草、木材等农业残余物，主要由纤维素(半纤维素和木质素所组成，其中纤维素和半纤维素是碳水化合物组分)。菊粉质原料的不同之处在于，分解后主要产生果糖基，所以对于那些经由果糖转化得到目的产物的生产工艺来说，是质优价廉的原料。尤其是富含菊粉的菊科植物——菊芋，其单位面积生物量产量高，耐受生物及非生物胁迫能力强，而且管理及种植成本低。最重要的是，虽然淀粉是简单易得的葡萄糖基原料，而且容易被多种微生物利用。但一方面，国内玉米淀粉远远满足不了大规模发酵工业的发展，另一方面，工业用玉米涉及与粮食的竞争，我国耕地面积有限，玉米人均占有量低，因此开发利用果糖基能源进行生物质转化势在必行。而有效利用菊芋中的聚合果糖和乳酸菌的细胞工厂生物转化生产甘露醇，无疑是比较可行的路线之一。

发明内容

本发明的目的是开发利用一种果糖基发酵原料——菊芋发酵生产甘露醇。菊芋，通过粉碎、酶解糖化、浓缩等工艺加工，形成可供乳酸菌利用的发酵底物。经过菌种的筛选和发酵糖化菊芋汁条件的优化，从而将菊芋中的聚合果糖有效地转化为甘露醇。

所述糖化菊芋汁通过如下步骤获得，

1)菊芋原料的预处理：将菊芋块茎晒干，经粉碎机粉碎成粗颗粒5-10目，烘箱内60℃烘干，得菊芋粗粉；

2)菊芋粗粉的酶解浓缩条件：将菊芋粗粉以水溶解制成质量浓度10～20％溶液，加入1000U～100000U单位/升的菊粉酶，50～70℃水浴搅拌4～9小时充分糖化，纱布过滤，上清42℃旋转蒸发浓缩，获得糖化菊芋汁。

本发明具有如下优点：

1)传统的甘露醇生产方法，依赖于以葡萄糖出发的化学催化或生物转化法。随着对产物纯度和工业流程洁净无污染要求的提高，生物转化法生产甘露醇逐渐显现出优势。然而，对工业化应用来说，廉价的初级生物质原料是降低发酵成本的有效途径之一。玉米淀粉是最简单易得的葡萄糖基原料，微生物利用起来也十分的容易。但用于工业的玉米占玉米总产量的10％左右，每年仅1000多万吨，因此国内的玉米淀粉远远满足不了大规模的生物基产业的发展，并涉及到与粮食和耕地的竞争。通过核算每公顷碳水化合物的产量，我们发现菊芋和甜薯等作物的产量相当(7～15吨/公顷)，甚至高于玉米(3.45～5吨/公顷)；通过改良品种，其种植成本呈下降趋势；菊芋的种植周期也和玉米相当(150～180天)；而且耐寒(-40℃)、耐旱(适合青海、陕西等荒漠化地区种植)、耐盐碱。所以，糖化菊芋汁可替代玉米淀粉进行发酵生产，无需添加其他碳源，其丰富的果糖含量更可被乳酸菌直接利用，通过其甘露醇脱氢酶系转化为甘露醇。

2)乳酸菌同样可发酵糖化菊芋汁产乳酸，而甘露醇可作为食品添加剂。因此乳酸生产过程中伴随少量甘露醇产生，既可改善乳酸口味，还避免提高血糖值，有利健康。

3)发酵以及后续的分离提纯过程简单、技术成熟，便于大规模生产，无毒无害，成分简单。加之菊芋本身很多成分已被食品工业开发应用，因此发酵原料更是安全有益。

总之，该方法不仅没有副产物山梨醇产生，而且生产成本低，原料来源广泛，工艺简单，技术路线成熟，可产业化实施。此外，乳酸菌培养容易，生长速率高，工业生产中通过短期培养即可积累大量目标产物-甘露醇；发酵过程无需通气，无需高速搅拌(满足混合均匀的基本搅拌即可)，节省了能耗；发酵液中甘露醇提取简单，利用其低溶解度可迅速结晶，便于分离。

附图说明

图1应用例1中各乳酸菌的甘露醇产量(总糖浓度20g/L)；

图2应用例2中各乳酸菌生物量(总糖浓度40g/L，Control＝对照，SJAJ＝糖化菊芋汁)；

图3应用例3中各乳酸菌生物量(总糖浓度169g/L，SJAJ＝糖化菊芋汁)；

图4应用例3中总糖转化率(总糖浓度169g/L，SJAJ＝糖化菊芋汁)。

具体实施方式

实施例1糖化菊芋汁的制备

1)菊芋块茎的处理工艺：将菊芋块茎晒干，经粉碎机粉碎成粗粉(5-10目)，烘箱内60℃烘干，密封待用。

2)将制成的菊芋粗粉浸入50℃水中制成质量浓度10％的溶液，通过1MNaOH，1M HCl调节其pH值至6.5，按每升加入50000U单位的菊粉酶的比例配制菊芋粗粉酶解反应液(菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量)，以50℃水浴搅拌6小时糖化。

3)将酶解后的反应液纱布过滤，上清离心。之后42℃旋转蒸发浓缩至原上清液体积的1/3，制成浓缩的糖化菊芋汁，稀释后经HPLC检测，确定其总糖浓度为100g/L(葡萄糖/果糖＝3∶1)。

实施例2

与实施例1不同之处在于

2)将制成的菊芋粗粉浸入60℃水中制成质量浓度20％的溶液，通过1MNaOH，1M HCl调节其pH值至6.5，按每升加入100000U单位的菊粉酶的比例配制菊芋粗粉酶解反应液(菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量)，以60℃水浴搅拌6小时糖化。

3)将酶解后的反应液纱布过滤，上清离心。之后42℃旋转蒸发浓缩至原上清液体积的1/4，制成浓缩的糖化菊芋汁，稀释后经HPLC检测，确定其总糖浓度为150g/L(葡萄糖/果糖＝4∶1)。

应用例1

将七种乳酸菌(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，菌种号为：Lactobacillus brevis AS1.7，Lactobacillus buchneri AS1.13，Lactobacillus buchneri AS1.40，Lactobacillus fermentium AS1.1880，Lactobacillus fermentium AS1.2029，Leuconostoc mesenteroides AS1.20，Leuconostoc mesenteroides AS1.544)分别接入20g/L果糖标准品作碳源的MRS培养基(酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween801g，K₂HPO₄2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O0.05g，蒸馏水定容至1.0L)中发酵，厌氧条件通过厌氧塞实现。培养条件为：培养液初始pH值通过1M NaOH，1M HCl调节至6.5～6.8，50ml装载容积(100ml锥形瓶)，5％接种量，30℃，100rpm轻摇，发酵时间72小时。

使用分光光度计比色法确定乳酸菌不同生长时间的生物量。使用HPLC系统(阴离子交换柱DIONEX CarboPac ^TMPA1)和脉冲安培检测器检测底物果糖、产物甘露醇，以及可能出现的副产物——山梨醇。甘露醇产量见图1。结果表明，以上乳酸菌除Lactobacillus fermentium AS1.2029外，均能利用果糖生长并代谢生产甘露醇。并且，经HPLC显示，这七种乳酸菌发酵过程中均不产生副产物山梨醇。本实例也证明了这六种乳酸菌有利用糖化菊芋汁的潜力。

应用例2将应用例1中选择出的六种乳酸菌(Lactobacillusbrevis AS1.7，Lactobacillus buchneri AS1.13，Lactobacillus buchneri AS1.40Lactobacillus fermentium AS1.1880，Leuconostoc mesenteroides AS1.20，Leuconostoc mesenteroides AS1.544)分别接入40g/L总糖浓度的糖化菊芋汁(由实施例2中浓缩糖化菊芋汁配制而成)和以果糖、葡萄糖标准品按4∶1比例配制的总糖浓度40g/L对照溶液中。培养条件同应用例1。

使用分光光度计比色法确定乳酸菌不同生长时间的生物量。使用HPLC系统(阴离子交换柱DIONEX CarboPac^TMPA1)和脉冲安培检测器检测发酵液中底物葡萄糖和果糖、产物甘露醇的含量。

结果显示，在糖化菊芋汁所配培养基上生长的乳酸菌的最高生物量高于标准品配制的培养基上生长的乳酸菌(如图2)，说明在乳酸菌发酵生产中，果糖化的菊芋粉是完全可以代替玉米淀粉作为发酵原料供乳酸菌生长的。甘露醇产量除Leuconostoc mesenteroides AS1.544以外，果糖转化率均超过50％。而且生物量结果显示，AS1.544生长状况不够理想，不适宜发酵生产。

应用例3选择应用例2中利用菊芋生长代谢状况良好的五种乳酸菌(Lactobacillus brevis AS1.7，Lactobacillus buchnerii AS1.13，Lactobacillusbuchneri AS1.40 Lactobacillus fermentium AS1.1880，Leuconostocmesenteroides AS1.20)以接入169g/L总糖浓度的糖化菊芋汁((由实施例2的浓缩糖化菊芋汁配制而成)中，培养条件同应用例1。生物量及底物、产物浓度的测定方法同上两实例。结果证明，五种乳酸菌能够在高浓度糖化菊芋汁做碳源的培养基中生长(如图3)，最高的能达到80％总糖转化率的甘露醇产量。尤其是Lactobacillus brevis AS1.7，利用菊芋转化甘露醇的容积生产率可达到0.94(g/(L·h))(如图4)。可见高浓度菊芋对乳酸菌抑制效应并不明显，乳酸菌仍能利用其葡萄糖成分生长并利用其果糖成分进行代谢。而AS 1.7和AS 1.2是选择出的具备放大生产潜力的甘露醇生产菌株，有进一步优化、改造的潜力。

应用例4优化乳酸菌Lactobacillus brevis AS1.7以糖化菊芋汁为碳源生物转化为甘露醇的发酵条件。

将以2％葡萄糖为碳源的MRS种子培养基中培养24h的Lactobacillusbrevis AS1.7接入糖化菊芋汁中批式厌氧发酵(装载容积：100ml/500ml锥形瓶)，确定总糖初始浓度、pH值、温度、通气、搅拌等对乳酸菌发酵糖化菊芋汁生产甘露醇的影响(底物、产物测定方法同前)。该菌利用糖化菊芋汁发酵的最佳条件为：批式发酵起始总糖浓度150g/L(另加入蛋白胨3％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，柠檬酸二铵0.2％，乙酸钠0.5％，MnSO₄·H₂O 0.08％)；pH5.5～6.0；温度35～37℃；接种量5％～10％；100rpm搅拌；无通气。此条件下批式发酵可得到最大细胞比生长速率(0.5L/h)和甘露醇转化率(81.5％，对总糖)。对Lactobacillus brevis AS1.7进一步在含1升糖化菊芋汁培养基(总糖浓度100g/L，果糖/葡萄糖＝4∶1，另加入蛋白胨3％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，柠檬酸二铵0.2％，乙酸钠0.5％，MnSO₄·H₂O 0.08％)的5升发酵中培养，采用补料方式在发酵24h后以30ml/h速率加入浓度为100g/L的糖化菊芋汁48h。发酵终止，可得到160g甘露醇。乳酸菌AS 1.7不仅能利用糖化菊芋汁批式发酵生产甘露醇，获得较高的转化率和生产速率，而且可以应用于连续生产，以糖化菊芋汁中单糖成分有效维持生长并高产甘露醇。

Claims

1.一种以菊芋为原料生物转化生产甘露醇的方法，其特征在于：以总糖浓度40～300g/L，果糖/葡萄糖比例范围为3∶1～4∶1的糖化菊芋汁为底物碳源配制发酵培养基，经微生物转化生产甘露醇；

所述微生物为短乳杆菌Lactobacillus brevis，布氏乳杆菌Lactobacillusbuchneri，发酵乳杆菌Lactobacillus fermentium或肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述糖化菊芋汁是通过如下过程获取的，

将菊芋块茎粉碎为5～10目的粗粉，配制成质量浓度2～20％的水溶液，加入1000U～100000U单位比例的菊粉酶、配制成酶解反应液，菊粉酶酶活定义为每分钟水解底物产生1微摩尔果糖所需要的酶量，调pH至4～6，50～70℃反应4～9h，酶反应进行完全后，纱布过滤后将上清液于30-50℃浓缩至原上清液体积的1/5～1/2；得到总糖浓度100～300g/L的浓缩糖化菊芋汁，其果糖/葡萄糖比例为3∶1～4∶1；

以浓缩糖化菊芋汁加水配制总糖浓度范围是40～300g/L糖化菊芋汁，其为微生物可以利用的富含单糖的反应液原料，将反应液调至pH＝6.2-6.8，灭菌。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述短乳杆菌Lactobacillusbrevis，布氏乳杆菌Lactobacillus buchneri，发酵乳杆菌Lactobacillusfermentium或肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides是指野生型微生物，或通过遗传工程与基因改造的微生物，能够利用权利要求2中的糖化菊芋汁生长，并代谢产生乳酸及甘露醇。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基成分中碳源仅由糖化菊芋汁提供，发酵培养基中还添加有其它成分，发酵培养基中其它成分的质量体积g/ml含量为：蛋白胨或玉米浆3～5％，MgSO₄·7H₂O0.01％～0.05％，柠檬酸二铵0.1-0.3％，乙酸钠0.2-0.5％，MnSO₄·H₂O0.02-0.08％。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微生物转化生产甘露醇过程的发酵条件为，发酵培养基中酶解后的糖化菊芋汁为唯一碳源；进行批式发酵生产，以权利要求4中所述发酵培养基为起始发酵培养基，起始发酵培养基中糖化菊芋汁浓度40～300g/L，培养温度30-35℃，pH＝6.2-6.8，搅拌80-100rpm，不通气，发酵周期30～150h。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微生物转化生产甘露醇过程的发酵条件为，发酵培养基中酶解后的糖化菊芋汁为唯一碳源，补料发酵也是补加所需浓度的糖化菊芋汁；进行补料发酵生产，以权利要求4中所述发酵培养基为起始发酵培养基，且起始发酵培养基中糖化菊芋汁浓度40～200g/L；培养温度30-35℃，pH＝6.2-6.8，搅拌80-100rpm，不通气；补入浓度为40～200g/L糖化菊芋汁，补料速率20～50ml/h；发酵周期30～150h。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微生物转化生产甘露醇过程中，甘露醇处于微生物发酵后的发酵液中，发酵液中甘露醇的分离纯化过程为，发酵液经离心或过滤除去菌体，再蒸发浓缩上清液，出现结晶，离心后得甘露醇晶体。