CN102250983B - 一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，包括：(1)将清洗干净的菊芋直接加水匀浆或于80‑120℃蒸煮15‑60min再加水匀浆，匀浆后浸提；浸提结束后过滤得滤渣和滤液，将滤液离心得菊芋汁；(2)将滤渣和滤液分别水解得水解液；(3)将上述水解液作为培养基碳源，加氮源配制成发酵培养基，将细菌纤维素生产菌株的种子液接入发酵培养基，经过3～23天制得细菌纤维素。本发明的生产工艺具有原料来源广泛，成本低，可操作性强等优点；且经处理的菊芋汁生产的细菌纤维素产量高于其他碳源生产的细菌纤维素，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。

Description

一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法

技术领域

本发明属于细菌纤维素的制备领域，特别涉及一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法。

背景技术

细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)作为一种天然高分子材料，具有较好的生物相容性、生物可降解性、较强的持水能力和较高的力学性能等特性。

鉴于细菌纤维素的优良特性，细菌纤维素具有广泛而特殊的用途。在医用材料领域，细菌纤维素可以用于合成人造皮肤、人造血管、外科敷料、缓释药物的载体等；在食品工业领域，细菌纤维素本身就可以作为一种食品食用，如俗称椰果或者椰纤果，另外，BC还可以作为食品工业中的增稠剂、成型剂、添加剂等；在造纸工业方面，细菌纤维素的添加可以提高纸张抗张强度和耐破度，降低透气度，提高撕裂度等；在音响领域可以用作生产超性能的声音振动膜；在材料领域，BC纳米纤维与其他高分子、有机或无机分子的复合掺杂，可获得各种新的功能复合材料。

目前大规模利用细菌纤维素的主要障碍是其产量低、成本高、价格不敌普通纤维素，因此研究的重点集中在找寻新碳源上，寻找廉价合适的原料，既降低生产成本又能提高纤维素的产量。

菊芋(Jerusalem artichoke)，俗名洋姜，菊科(Helianthus tuberosus)，向日葵属，多年生草本植物。具有耐贫瘠、耐寒、耐旱、种植简易、产量极高等特点，在我国分布广泛且价格低廉。菊糖(Inulin)又称菊粉是菊芋的主要成份，是一种由呋喃构型的D-果糖经β(2-1)糖苷键脱水聚合而成果聚糖的混合物，聚合度为2-60，一般平均为10，其终端以α(1-2)糖苷键连接一个葡萄糖单位，呈线型结构。鲜菊芋块茎中含碳水化合物16.6％，其中78％的碳水化合物为菊糖。菊糖微溶于冷水，在热水中易溶，通过热水浸提菊芋汁可以生成含菊糖的多糖混合溶液。果糖是生产细菌纤维素的优质碳源，因此直接以价廉的富含果糖聚合物的菊芋为原料，在降低原料成本上具有非常大的优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，该方法具有原料来源广泛，成本低，可操作性强等优点；且使用经过浸提除杂的菊芋汁生产的细菌纤维素产量高于其他碳源生产的细菌纤维素，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。

本发明的一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，包括：

(1)将清洗干净的菊芋直接加水匀浆或于80-120℃蒸煮15-60min再加水匀浆，菊芋与水的质量体积比为1g∶1～10ml，匀浆后于60-100℃水浴浸提0.5-2.5h；浸提结束后过滤得滤渣和滤液，将滤液离心得菊芋汁；

(2)在上述滤渣中加入酸至浓度0.5-3wt％(混合后酸浓度为0.5-3wt％)，或者每g滤渣中加入1-500U酶，于20-110℃水解10-180min得水解液；

在上述菊芋汁中加入酸至浓度0.5-3wt％(混合后酸浓度为0.5-3wt％)，或者每ml菊芋汁中加入1-50U酶，于20-110℃水解10-180min得水解液；

当水解温度为100～110℃时将水解液进行脱毒；

(3)将步骤(1)中的菊芋汁或步骤(2)中的水解液作为培养基碳源，加氮源配制成发酵培养基，pH调至4.0～6.0，将细菌纤维素生产菌株的种子液接入发酵培养基，在20～30℃下静止培养或者以5～500rpm转速下动态培养，经过3～23天制得细菌纤维素。

所述步骤(1)中的蒸煮温度为80-110℃，蒸煮时间为20-40min，菊芋与水的质量体积比为1g∶1～8ml，浸提温度为80-100℃，浸提时间为1.0-2.0h。

所述步骤(1)中的蒸煮温度为105℃，蒸煮时间为30min，菊芋与水的质量体积比为1g∶8～10ml。

所述步骤(2)中的酸为硫酸、磷酸、盐酸或硝酸。

所述步骤(2)中的酶为菊粉酶、果聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、糊精酶或淀粉酶中的一种或几种。

所述步骤(3)中的氮源为0.1～1wt％的酵母浸膏和0.1～0.5wt％的胰蛋白胨；或者为0.1-2wt％的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。

所述步骤(3)中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenessp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)。

所述细菌纤维素生产菌株为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)。

所述细菌纤维素生产菌株中除红茶菌以外的菌种按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按体积百分比3-15％的接种量转接到发酵培养基；细菌纤维素生产菌株为红茶菌时按接入1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基，然后按1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量转接到发酵培养基。

所述细菌纤维素生产菌株为红茶菌时液体种子培养基和发酵培养基的组成均为：每1L水中，绿茶或者红茶1～10g，含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白胨或者胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液、绿茶或红茶以及水，其中糖、茶、水的质量比为5∶0.1～0.4∶100～200，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或每1L水中，含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，121℃灭菌20min。

所述步骤(2)中的水解温度为100～110℃时获得的水解液脱毒具体方法有：

(1)采用NaOH将水解液pH值调到4.5-5.5，过滤沉淀，并重新微调pH到4.5-5.5；

(2)采用NaOH将水解液pH值调到4.5-5.5，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(3)采用NaOH将水解液pH值调到9.5-11，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新调节pH值到4.5-5.5；

(4)采用NaOH将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5；

(5)采用NaOH将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(6)采用NaOH将水解液pH值调到4.5-5.5，加10wt％的酶活为2.75U/mL的漆酶于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤掉沉淀物并重新微调pH值到4.5-5.5；

(7)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到4.5-5.5，过滤沉淀，并微调到pH4.5-5.5；

(8)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到4.5-5.5，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(9)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到9.5-11，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新调节pH值到4.5-5.5；

(10)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5；

(11)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(12)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到4.5-5.5，加10wt％的酶活为2.75U/mL的漆酶于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤掉沉淀物并重新微调pH值到4.5-5.5；

(13)采用25％-30％氨水将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(14)采用25％-30％氨水将水解液pH值调到4.5-5.5，加10％的酶活为2.75U/mL的漆酶于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤掉沉淀物并重新微调pH值到4.5-5.5。

本发明利用菊芋这一在我国资源丰富，种植广泛，存储方便且价格低廉的原料进行。实验数据表明，在同等条件下，使用菊芋汁、汁水解液生产的细菌纤维素产量高于其他碳源生产的细菌纤维素，如蔗糖，葡萄糖，果糖。甘露醇等碳源。因此证实本发明所生产的廉价碳源是一种培养细菌纤维素的优质碳源。

有益效果

本发明以菊芋为原料，不需精加工成精粉，可以大大降低BC的生产原料成本；菊芋中还含有少量的蛋白质，维生素，矿物质等元素，可以促进BC的合成；该生产工艺具有原料来源广泛，成本低，可操作性强等优点；且经处理的菊芋汁生产的细菌纤维素产量高于其他碳源生产的细菌纤维素，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为固液比为1∶1和80℃浸提条件下不同浸提时间对还原糖得率的影响；

图2为不同浸提温度对还原糖得率的影响；

图3为不同固液比对总糖得率的影响；

图4为不同稀释度的菊芋汁和不同碳源生产的细菌纤维素的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

菊芋先用水清洗干净，称重分装，在120℃温度下蒸煮20min，用打汁机匀浆，菊芋与水的比例(g/ml)是1∶1，将菊芋浆在80℃的水浴中浸提1h。用两层纱布过滤除去滤渣，得到较为澄清的菊芋汁，于6000r/min离心20min，4℃冰箱冷藏备用。实验结果见图1，以苯酚硫酸法测总糖，以总糖浓度乘以浸提液体积再除以鲜菊芋质量记为得率。

在过滤渣中加入硫酸至浓度0.5wt％，在110℃水解30min，采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到9.5，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新调节pH值到4.5；或者在过滤渣中加入纤维素酶和菊粉酶至1U/m L，采用NaOH将水解液pH值调到4.5，于50℃水解180min，过滤沉淀，并重新微调pH到4.5，收集水解液备用。

在菊芋汁中加入硫酸至浓度0.5wt％，在110℃水解10min，采用NaOH将水解液pH值调到11，于25℃温水浴条件下反应12h，过滤并重新调pH值到5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到5.5；或者在菊芋汁中加入菊粉酶至1U/mL，采用NaOH将水解液pH值调到6.0，于50℃水解60min，过滤沉淀，并重新微调pH到4.5，收集水解液备用。

澄清的菊芋汁或者其水解液经测糖，作为培养基碳源，碳源浓度99.8wt％，再在其中补加0.1wt％的酵母浸膏和0.1wt％的胰蛋白胨配成菊芋汁培养基用于微生物的培养。

实施例2

菊芋先用水清洗干净，称重分装，在80℃温度下蒸煮30min，用打汁机匀浆，菊芋与水的比例(g/mi)是1∶1，将菊芋浆在80℃的水浴中浸提2.5h。用两层纱布过滤除去滤渣，得到较为澄清的菊芋汁，于8000r/min离心20min，4℃冰箱冷藏备用。实验结果见图2。

在过滤渣中加入盐酸至浓度3wt％或者加入果聚糖酶、果胶酶、淀粉酶和纤维素酶至500U/mL，在20℃水解60min，收集水解液备用。

在菊芋汁中加入盐酸至浓度3wt％或者加入淀粉酶至50U/mL，在20℃水解60min，收集水解液备用。

澄清的菊芋汁或者水解液经测糖，作为培养基碳源，碳源浓度98wt％，再在其中补加1wt％的酵母浸膏和1wt％的胰蛋白胨配成菊芋汁培养基用于微生物的培养。

实施例3

将新鲜菊芋清洗干净，直接加水匀浆，菊芋与水的料液比(g/ml)为1∶8，匀浆后于100℃下水浴浸提2.0h。用两层纱布过滤除去滤渣，得到较为澄清的菊芋汁，于8000r/min离心20min，4℃冰箱冷藏备用。实验结果见.3，以苯酚硫酸法测总糖，以总糖浓度乘以浸提液体积再除以鲜菊芋质量记为得率。

在过滤渣中加入硫酸至浓度1wt％，在100℃水解40min，采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到11，过滤并重新调pH值到5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到5.5；或者在过滤渣中加入糖化酶至500U/mL，于60℃温水浴条件下反应120min，收集水解液备用。

在菊芋汁中加入硫酸至浓度1wt％或者加入糊精酶至25U/mL(pH6.0)，于60℃温水浴条件下反应12h，反应后重新微调pH值到5.0，收集水解液备用。

澄清的菊芋汁或者水解液经测糖，作为培养基碳源，碳源浓度98wt％，再在其中补加2wt％的硫酸铵配成菊芋汁培养基用于微生物的培养。

实施例4

使用上述方法处理菊芋，浸提得到菊芋汁糖浓度为76g/L。将1L水煮沸，加入绿茶或者红茶1-10g(茶叶5g时最优)，浸泡20min后滤去茶叶渣得到茶汤，然后加入菊芋原汁或水解液配成38g/L、19g/L和12.7g/L的菊芋汁培养基，补加蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH5.0，巴氏灭菌30min。

红茶菌(kombucha)按片直径0.5cm圆片菌膜的接种量接入菊芋汁培养基，于30℃、160r/min条件下摇床培养或者静置培养12h后；再按1片直径0.5cm圆片含菌BC膜的接种量转接至新的菊芋汁培养基，于30℃、160r/min条件下动态培养或者静置培养2天。含糖38g/L的菊芋汁培养基获得的细菌纤维素产量达27g/L，是25g/L甘露醇培养基产量的6倍。

实施例5

使用上述方法处理菊芋，浸提得到菊芋汁糖浓度为76g/L，以去离子水进行稀释，稀释四倍菊芋汁的糖浓约为19g/L，略低于作为对照的甘露醇(25g/L)培养基。在菊芋原汁，稀释2、4、6倍的菊芋汁以及甘露醇溶液中再补加0.1wt％的酵母浸膏和0.1wt％的胰蛋白胨分别配成100mL的不同浓度菊芋汁培养基和甘露醇培养基。将醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌等细菌以15vol％的接种量接入，于26℃培养箱内静止培养14天(8-23天都可)，可得到比较理想的细菌纤维产品或者比较丰厚的细菌纤维素膜，于105℃烘干并测量其绝干重，实验结果见图4，并将以甘露醇和菊芋汁为碳源的BC膜拉力进行比较，结果见表1。

图4显示菊芋原汁配置的培养基生产的细菌纤维素产量是最高(32.6g/L)，稀释四倍的菊芋汁的产量(10.7g/L)略高于甘露醇(6.5g/L)。表1显示以菊芋汁培养的BC膜具有较高的抗张强度。

表1以菊芋汁和甘露醇为碳源的BC膜的拉力

Claims (5)

1.一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，包括：

(1)将清洗干净的菊芋直接加水匀浆或于80-120℃蒸煮15-60min再加水匀浆，菊芋与水的质量体积比为1g:1～10ml，匀浆后于60-100℃水浴浸提0.5-2.5h；浸提结束后过滤得滤渣和滤液，将滤液离心得菊芋汁；

(2)在每g滤渣中加入1-500U酶，于20-110℃水解10-180min得水解液；

在每ml菊芋汁中加入1-50U酶，于20-110℃水解10-180min得水解液；

当水解温度为100～110℃时将水解液进行脱毒；其中，酶为果聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、糊精酶或淀粉酶中的一种或几种；

(3)将步骤(1)中的菊芋汁或步骤(2)中的水解液作为培养基碳源，加氮源配制成发酵培养基，pH调至4.0～6.0，将细菌纤维素生产菌株的种子液接入发酵培养基，在20～30℃下静止培养或者以5～500rpm转速下动态培养，经过3～23天制得细菌纤维素；其中，细菌纤维素生产菌株为红茶菌。

2.根据权利要求1所述的一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的蒸煮温度为80-110℃，蒸煮时间为20-40min，菊芋与水的质量体积比为1g:1～8ml，浸提温度为80-100℃，浸提时间为1.0-2.0h。

3.根据权利要求2所述的一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的蒸煮温度为105℃，蒸煮时间为30min。

4.根据权利要求1所述的一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的氮源为0.1～1wt％的酵母浸膏和0.1～0.5wt％的胰蛋白胨；或者为0.1-2wt％的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。

5.根据权利要求1所述的一种以菊芋为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述细菌纤维素生产菌株为红茶菌时液体种子培养基和发酵培养基的组成均为：

每1L水中，绿茶或者红茶1～10g，含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白胨或者胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液、绿茶或红茶以及水，其中糖、茶、水的质量比为5：0.1～0.4：100～200，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或每1L水中，含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，121℃灭菌20min。