CN102071224A

CN102071224A - 一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法

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Publication number: CN102071224A
Application number: CN 200910199317
Authority: CN
Inventors: 鲍杰; 胡凤仙; 刘长俊
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2029-11-25
Also published as: CN102071224B

Abstract

本发明涉及一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，以菊芋块茎为原料，将其制备成菊芋汁或菊芋浆，向菊芋汁、浆中添加菊糖酶或稀酸，可得到富含果糖、葡萄糖单糖的菊芋水解液；以菊芋水解液为碳源，补入适量的葡萄糖使葡萄糖和果糖的质量或摩尔含量相同；以野生或转基因的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)细胞为生物催化剂，调节生物反应系统的pH、温度、反应时间、混合方式与强度、细胞浓度、细胞催化方式(游离或固定化)，将菊芋水解液转化为山梨醇和葡萄糖酸；方法还可用于菊苣水解糖浆、甘蔗糖蜜、甜高粱汁等碳水化合物原料发酵或细胞催化制备山梨醇和葡萄糖酸盐中应用。本发明的优点：原料种植范围广泛，降低生物法生产山梨醇的成本，同时得到葡萄糖酸。

Description

一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法

【技术领域】

本发明涉及一种以菊芋为原料经过微生物催化反应生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法。

【背景技术】

山梨醇作为一种重要的化工产品，被广泛应用在医药、食品、轻化、表面活性剂、合成树脂等方面，是能满足多方应用的绿色产品(Vogel，2002)。山梨醇是美国再生能源国家实验室(NREL)和太平洋西北国家实验室(PNNL)评出的12个最具开发潜力的关键中间体之一。以山梨醇作为生物炼油中间体，可以生产多种重要的取代石油化学品的材料和化学品，主要衍生物包括异山梨醇(isosorbide)，丙烯醇(propylene glycol)，聚山梨醇脂肪酸酯(sorbitan fattyacid esters，SFAE)，乳酸，甘油，多聚糖类(branched polysaccharides)等，它们都具有重要的工业价值。目前，山梨醇主要通过化学法生产，国内外普遍采用葡萄糖催化加氢法生产山梨醇。然而化学催化法有许多不可避免的缺点：催化过程在高温高压下进行，能耗高、安全性比较差；对设备的要求高、自动化成本也高；葡萄糖的转化率不够高；使用贵重金属作为催化剂，成本高且后处理困难；以易燃易爆的氢气为原料，存在氢气回收的问题；若以淀粉或者蔗糖为原料，产品中往往伴随着甘露醇，分离比较困难。

Barrow和Viikari在1984年，发现产乙醇细菌Zymomonas mobilis能够利用葡萄糖和果糖的混合物生成山梨醇，从而开启了生物催化法生产山梨醇的研究。生物催化法对比于化学催化法具有反应条件温和，产品转化率高、纯度高，工艺过程简单、设备投资少等优点。在随后的十几年直至现在，研究人员致力于在温和条件下用生物催化法生产山梨醇，并取得了不错的成果。

用生物法工业化生产山梨醇基质成本高是一个重要的限制因素，特别是高价格的果糖。在这种情况下，RO和Kim(Enzyme Microb Technol1991，13：920～924)在1991年研究了利用蔗糖为基质，用甲苯处理的ZM来生产山梨醇和葡萄糖酸，他们将菌株和转化酵素一起固定在角素和海藻酸钙中。该共同固定化酶的最佳基质浓度为200g/L。Silveria在2001年开发了一种两步法来产生山梨醇、葡萄糖酸和乙醇的工艺，使用玉米浆作为第一步骤中的维生素源和氮源(Appl Microbiol Biotechnol，2001，55：442～445)。在这种情况下，生物转化过程以批式模式进行。利用质量浓度为25g/L和40g/L的玉米浆，可以达到最大的GFOR/GL酶活(13.2～13.5U/g干细胞)，这和利用5g/L的酵母粉培养液所达到的结果是一样的，说明玉米浆是一种有效且廉价的培养基质添加物，大大增加了利用运动发酵单胞菌大规模生物法生产山梨醇和葡萄糖酸的经济潜力。

菊芋是一种多年生草本植物，俗称洋姜，鬼子姜，属菊科向日葵属。由于其具有耐寒、耐旱、耐盐碱、抗风沙、适应性广、繁殖性强等优点，使其在全国各地均有分布。菊芋的主要成分是多聚果糖，占菊芋块茎干重的70％，果聚糖经菊糖酶或酸水解得到以果糖为主并含有部分葡萄糖的水解液，用其来生产2，3-丁二醇、乙醇、乳酸和微生物油脂(中国专利公开号：CN10128968A；Food Technol Biotechnol 2005，43(3)：241-246；中国专利申请公开号：CN10110899A；中国专利申请公开号：CN1952163A)，都取得了较好的结果。因此，利用非粮可再生资源菊芋为原料，生产山梨醇，同时生产葡萄糖酸，可以在一定程度上降低生产成本，提高生产效率。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种使用非粮的廉价原料菊芋来代替果糖和葡萄糖生产山梨醇的技术方法，解决目前主要利用糖为底物生产山梨醇成本较高的问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，具体步骤为：

(1)原料制备和处理

以鲜菊芋的块茎为原料，将其制成菊芋汁或菊芋浆，向菊芋汁或菊芋浆中加入稀酸；或者将菊粉直接加入稀酸中，再进行水解，制成菊芋水解液，条件为稀酸浓度为0.005～1mol/L，温度为10～150℃，所述的稀酸选自硫酸、盐酸、磷酸、酸性离子交换树脂、固体超强酸、固体金属化合物等固体酸中的一种；水解原料为菊芋、富含低聚果糖或蔗糖的如甘蔗、甜高粱、菊苣、糖蜜中的一种；

另一种是酶水解方法，所述酶水解所用酶源是菊粉酶，包括外切酶与内切酶，可以是外购商品，如诺维信公司的菊糖水解酶Fructozyme，也可以是经过微生物发酵所得到，发酵所使用的菌种可以是黑曲酶、酵母、细菌以及其他能产菊粉酶的微生物种属；以新鲜菊芋块根或者干燥的菊芋块根为原料，水溶解制成重量浓度10～40％溶液后，按每升加入1000U～100000U单位的菊粉酶的比例配制菊芋粉酶解反应液，调节其pH值至4.2～6.5，在反应器中45～70℃反应3～9h，酶解反应完全后，形成果糖化的菊芋粉液体；

(2)菌种：采用的菌种为运动发酵单胞菌属，但运动发酵单胞菌只是最优选的菌株，还包含Zymomonas mobilis ZM1、Zymomonas mobilis ZM2、Zymomonas mobilis ZM4、Zymomonas mobilis ZM6等，还包含通过诱变、基因工程等操作改造上述菌株，以及包含能够产山梨醇的其它菌株；

菌种培养：经活化后的步骤(2)中的菌种接种到一级种子培养基中，培养后，再将上述种子接种到二级种子培养基中继续培养，收集细胞用于催化反应生产山梨醇；

所述的菌种培养的具体过程为：经活化后的步骤(2)中的菌种接种到一级种子培养基中，在25～35℃培养，培养12～24小时，将上述种子按2～10％的接种量接种到二级种子培养基中，在pH 5～6、25～35℃、150～200rpm、0.02～0.5vvm的条件下进行培养，收集细胞用于催化反应生产山梨醇；

一级种子培养基成份是0.1～20g/L酵母浸膏(Yeast Extract)，0.1～20g/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，0.1～10g/L七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，2～8g/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，5～200g/L葡萄糖；或者用其它包括菊芋在内的生物质水解液作为碳源；

二级种子培养基成份与一级种子培养基成分相同，只是糖的浓度相同或高于一级种子培养基；

此外，菊糖水解液也可与灭菌后的无机盐营养成分混合，接入运动发酵单胞菌，通过直接发酵得到山梨醇和葡萄糖酸盐；

细胞催化反应：收集培养后的细胞种子直接用于催化生产山梨醇，或把细胞经过渗透化处理以及经过固定化后生产山梨醇；

在以葡萄糖和果糖为底物利用运动发酵单胞菌葡萄糖果糖氧化还原酶体系，葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时果糖还原为山梨醇，反应时先加入菊芋水解液，催化反应温度为10～150℃，最优温度为38～40℃；搅拌转速10～400rpm，搅拌最佳转速140～160rpm；pH控制在2.0～9.0，最优pH控制范围为5.0～7.0；整个反应体系为开放操作，无需灭菌；

操作过程：将菊芋水解液加入容器中，并补入20～300g/L的葡萄糖使葡萄糖和果糖达到质量平衡，使其溶解，加入细胞，开始催化反应，使用碱溶液调节反应容器中的溶液的pH为2.0～9.0，最优pH控制范围为5.0～7.0，催化反应生产山梨醇，同时得到葡萄糖酸盐；采用高效液相色谱法测定葡萄糖，果糖消耗量，山梨醇和葡萄糖酸的生成量，采用本发明的工艺生产山梨醇，得到山梨醇的浓度20～300g/L；

在这个工程中可以加入金属离子如Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等除了得到对应的葡萄糖酸盐外，还可以减少反应过程中乙醇的生成；

在以葡萄糖和果糖为底物利用运动发酵单胞菌生产山梨醇体系中，葡萄糖氧化为葡萄糖酸，果糖还原为山梨醇，这里的运动发酵单胞菌的葡萄糖果糖氧化还原酶还可用以甘蔗、甜高粱、菊苣、糖蜜等为原料得到山梨醇和葡萄糖酸盐。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

本发明所用的原料种植范围广泛，且不与粮争地，价格低廉，可显著降低生物法生产山梨醇的成本；同时本发明在生产山梨醇的同时产生另外一种重要的化工产品葡萄糖酸，采用添加金属离子的方法提高山梨醇和葡萄糖酸的生产效率，大大减少副产物的生成，这些成效为降低生物法生产山梨醇的成本奠定了一定的基础。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法的具体实施方式。

本发明所举的实施例中所用的菌种为运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，美国ATCC保藏，保藏号ATCC 29191，具体实施例如下。

实施例1

以菊粉为原料，在70℃加入H₂SO₄，使H₂SO₄的最终浓度为1％，水解5h，得到还原糖葡萄糖和果糖的浓度为分别为26g/L与132g/L菊糖水解液，离心水解液，取出固体部分，得到的菊糖水解液无需灭菌直接用于细胞催化反应。

催化反应在发酵罐中进行，反应总体积为200mL，其中175mL的菊粉水解液和25mL的葡萄糖溶液，这样在反应体系中葡萄糖和果糖的浓度大约是91.1g/L，再加入60g/L培养离心的湿细胞种子，将反应器的中温度升至40℃，转速150rpm，最终山梨醇的量为86.37g/L，产率为0.937(g/g)，转化率为0.937。

实施例2

紫色皮的鲜菊芋600g洗净后，加入H₂SO₄溶液，使其固体含量达到15％H₂SO₄的浓度是0.1M，70℃在反应器中进行水解反应，得到的水解液离心收集上清液，以其上清液为原料催化反应催化反应生成山梨醇和葡萄糖酸。在反应器中加入葡萄糖使葡萄糖与果糖达到等质量，反应体系的总体积为200ml，将反应器的温度升至40℃，转速150rpm，随后加入种子细胞将12g(湿重)细胞悬浮起来，最终反应体系含有等质量的葡萄糖和果糖是68g/L，最终山梨醇的量为40g/L，产率为0.59(g/g)，转化率为100％，乙醇的浓度为43g/L。

实施例3

菊芋水解液通过浓缩过柱子得到菊芋高果糖浆，以菊芋高果糖浆为原料，催化反应在发酵罐中进行，反应总体积为200mL，将发酵罐中温度升至40℃，转速150rpm，随后加入种子细胞将12g(湿重)细胞悬浮起来，加入发酵罐中，最终反应体系含有等质量的葡萄糖和果糖是500g/L，最终山梨醇的量为194.7g/L，产率为0.80(g/g)，转化率为0.947，乙醇的浓度为16.3g/L。

实施例4

菊芋水解液通过浓缩过柱子得到菊芋高果糖浆，以菊芋高果糖浆为原料，催化反应在发酵罐中进行，反应总体积为200mL，将发酵罐中温度升至40℃，转速150rpm，随后加入种子细胞将12g(湿重)细胞悬浮起来，加入发酵罐中，以菊芋高果糖浆为原料，稀释一定的比例，最终反应体系含有等质量的葡萄糖和果糖是150g/L，OD₆₀₀：65.0，加入2g/L七水硫酸锌。最终山梨醇的量为73.1g/L，产率为0.837(g/g)，转化率为0.985，乙醇浓度5.63g/L。与实施例3相比，副产物乙醇的浓度大大降低，山梨醇的产率和转化率都得到了提高。

本实施例所采用的运动发酵单胞菌只是最优选的菌株，还包含Zymomonas mobilis ZM1、Zymomonas mobilis ZM2、Zymomonas mobilis ZM4、Zymomonas mobilis ZM6等，还包含通过诱变、基因工程等操作改造上述菌株，以及包含能够产山梨醇的其它菌株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims

1.一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)原料制备和处理：以鲜菊芋的块茎为原料，将其制成菊芋汁或菊芋浆，向菊芋汁或菊芋浆中加入稀酸；或者将菊粉直接加入稀酸中，再进行水解，制成菊芋水解液，条件为稀酸浓度为0.005～1mol/L，温度为10～150℃，所述的稀酸选自硫酸、盐酸、磷酸、酸性离子交换树脂、固体超强酸、固体金属化合物固体酸中的一种；或以新鲜菊芋块根或者干燥的菊芋块根为原料，用酶进行水解；

(2)以(1)中得到的菊芋水解液为原料制成培养基，用运动发酵单胞菌野生菌，通过发酵生法产山梨醇和葡萄糖酸；或用(1)得到的水解液补入适量的葡萄糖使葡萄糖和果糖的质量或摩尔含量相同，通过细胞催化法生产山梨醇和葡萄糖酸。

2.如权利要求1所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的酶水解所用酶是菊粉酶，包括外切酶与内切酶，或者是外购商品，如诺维信公司的菊糖水解酶Fructozyme，是经过微生物发酵所得到，发酵所使用的菌种为黑曲酶、酵母、细菌以及其他能产菊粉酶的微生物种属。

3.如权利要求1所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的水解原料为菊芋、富含低聚果糖或蔗糖的甘蔗、甜高粱、菊苣、糖蜜中的一种。

4.如权利要求1所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述的菌种为运动发酵单胞菌属，利用运动发酵单胞菌生产山梨醇，但运动发酵单胞菌只是最优选的菌株，还包含Zymomonas mobilis ZM1、Zymomonasmobilis ZM2、Zymomonas mobilis ZM4、Zymomonas mobilis ZM6等，包含通过诱变、基因工程等操作改造上述菌株，以及包含能够产山梨醇的其它菌株。

5.如权利要求1所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述的运动发酵单胞菌培养基成份是0.1～20g/L酵母浸膏(Yeast Extract)，0.1～20g/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，0.1～10g/L七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，0.1～20g/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，5～500g/L葡萄糖；或者用其它包括菊芋在内的生物质水解液作为碳源。

6.如权利要求1所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述的运动发酵单胞菌为分批发酵或补料分批发酵生产山梨醇和葡萄糖酸盐。

7.如权利要求1所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，收集培养后的细胞种子直接用于催化生产山梨醇，或把细胞经过渗透化处理以及经过固定化后生产山梨醇。

8.如权利要求1所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，细胞催化反应，催化反应温度为10～150℃；pH控制在2.0～9.0。

9.如权利要求8所述一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，使用氨水、碳酸盐或碱溶液调节pH，控制pH最佳范围为5.0～7.0。

10.如权利要求1所述的一种生产山梨醇和葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，细胞催化反应，所述的整个反应体系为开放操作，无需灭菌。