CN102174602A - 一种利用生物质发酵生产l-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，生物质经碱液热处理后，固液分离得到液体I和残渣II；将含有残渣II的培养基加入到糖化发酵罐中，加入纤维素降解酶，在50～55℃下，水解反应0.5～6小时；维持糖化发酵罐温度为50～55℃，利用液体I调节培养基pH值至6.0～6.5，向糖化发酵罐内接入凝结芽孢杆菌，厌氧条件下进行残渣II同步糖化发酵48～96h生产L-乳酸，同时流加液体I维持发酵液pH值为5.2～5.8。本发明与现有技术相比，不但可以提高纤维素和半纤维素转化为乳酸的综合效率，而且在发酵过程中和采用碱废液中和乳酸，可以降低乳酸生产工业中的碱耗和废水排放。
Description
技术领域
本发明属于生物质利用开发领域，具体涉及一种无需额外添加酸碱调控pH，直接利用碱性生物质残渣一罐式发酵生产纤维素L-乳酸的方法。
背景技术
乳酸(lactic acid)又称2-羟基丙酸，是一种重要的多用途有机酸，可广泛应用于食品、医药、农业和化工等行业。由于乳酸含有一个不对称的碳原子，可分为L型和D型两种。其中尤以L-乳酸应用范围广泛，生产研究受到普遍重视。
工业上乳酸的生产有发酵法和化学法。化学法是以乙醛和氢氰酸为原料合成的，生产成本高、环境污染严重，且难于合成单一构型的L-乳酸，目前已逐渐被绿色环保的微生物发酵法所取代。微生物发酵生产L-乳酸的优势明显，原料廉价，生产工艺更加清洁，生产效率更高，但传统的乳酸发酵生产主要以淀粉质和糖蜜为原料，原料成本在生产总成本中占有很大的比例，这在一定程度上限制了整个乳酸工业及聚乳酸行业的发展。我国虽然是世界主要粮食生产国，但由于饮食结构以淀粉类为主，粮食问题依然紧张，利用淀粉类原料发酵生产乳酸从长久看存在“与民争粮”的局面。因此，我国乳酸生产必须具备本国特色，利用木质纤维素为主的生物质资源生产乳酸具有重要的经济与社会意义。
发酵法生产L-乳酸常用的微生物有乳酸菌和根霉。使用乳酸菌发酵为同型厌氧发酵，能耗很低，糖酸转化率理论值为100％，因而生产成本较低。近来，欧美各国的普拉克公司、ADM公司、卡吉尔公司为了降低生产成本，均采用了细菌发酵。细菌发酵的缺点是营养需求复杂，需多种营养因子，如氨基酸、维生素和矿物质；此外，细菌发酵L-乳酸时因易混入产生消旋酶的其他菌，使所产的L-乳酸易发生消旋，光学纯度不高。根霉发酵法生产乳酸特点为发酵营养要求简单，产物为高光学纯度的L-乳酸，菌体大，容易分离，且能产生高活性的淀粉酶、果胶酶甚至是少量纤维素酶，因此在木质纤维素生产L-乳酸研究中被广泛使用。但是米根霉菌的乳酸产率和转化率低于乳酸细菌，并且产物中含有大量副产物，给乳酸的提取和精制带来很大困难；根霉菌在发酵过程中需要通气搅拌，使得动力消耗增加，生产成本上升。
基于上述原因，近年来芽孢杆菌以其发酵温度高、不易染菌和营养要求低的优势逐渐吸引更多研究者的关注。对现有技术的检索发现，部分凝结芽孢杆菌具有己糖、戊糖全糖发酵生产高纯度L-乳酸的能力，美国专利文献号US2005/0250192A1中记载了能够利用葡萄糖和木糖生产乳酸的多株凝结芽孢杆菌，如Strain 36D1可以耐热、耐酸，其利用纯葡萄糖发酵产L-乳酸报道产量为25.2g/L；纯木糖发酵产L-乳酸报道产量23.4g/L；利用甘蔗渣还原糖(主要为葡萄糖和木糖)为底物报道产量为55.5g/L。中国专利文献号20100176868.9中记载了凝结芽孢杆菌DSM 23183和DSM 23184可以直接利用五碳糖和六碳糖发酵生产高浓度L-乳酸。因此，利用凝结芽孢杆菌同步糖化发酵生产L-乳酸既可以通过酶解和发酵同步解除糖对酶解的抑制，又可以充分利用生物质原料中的纤维素和半纤维素，实现己糖和戊糖的同步发酵，目前鲜见报道。
另外，乳酸发酵生产中一个重要障碍是发酵过程中乳酸的积累不仅会引起终产物抑制，还会导致pH下降进一步抑制乳酸发酵和细胞生长。为了克服这一问题，工业乳酸或乳酸盐发酵过程通常需要添加碱性中和剂维持发酵pH，并及时将游离乳酸从发酵液中移除。因此，乳酸发酵生产中碱性中和剂的用量是导致乳酸生产成本较高的重要因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种低成本、高得率的利用生物质发酵生产L-乳酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的理论基础如下：
生物质碱处理是生物质酶解糖化前一种常见的预处理方法。碱处理后获得的废液为富含木质素的碱性溶液，通常需要酸中和后也能达到废水排放要求，但由于富含碱性物质可以直接用于乳酸发酵过程的pH调控，这样不仅发酵工段无需额外流加乳酸中和剂，减少乳酸发酵过程中的碱耗，还可以减少碱预处理工段的废水排放，降低污水处理费用；碱处理残渣为富含纤维素和半纤维素的植物纤维渣，由于去除了一部分木质素，易于为纤维降解酶水解。利用凝结芽孢杆菌在厌氧条件下可以同步利用木糖和葡萄糖发酵生产乳酸，而且发酵温度和pH与通常纤维酶水解反应条件基本吻合的特性，通过简单的直接添加纤维降解酶就可以实现同步糖化发酵解除糖类物质积累，从而达到提高纤维素转化率和乳酸得率的目的，同时较高的发酵温度和厌氧条件具备了生料发酵的条件，使得操作过程更加简单，易于管理。
具体的技术方案如下：
一种利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，包括如下步骤：
(1)生物质经碱液热处理后，固液分离得到液体I和残渣II；
(2)将含有残渣II的培养基加入到糖化发酵罐中，向糖化发酵罐内加入纤维降解酶，在50～55℃下，水解反应0.5～6小时；
(3)维持糖化发酵罐温度为50～55℃，利用液体I调节经步骤(2)处理后的培养基pH值至6.0～6.5，向糖化发酵罐内接入凝结芽孢杆菌，厌氧条件下进行残渣II同步糖化发酵48～96h生产L-乳酸，同时流加液体I维持发酵液pH值为5.2～5.8。
步骤(1)中，所述的生物质为玉米芯、玉米秸秆、麦秆、稻秆和甘蔗渣中的任意一种或多种。
步骤(1)中，所述的碱液为碱的水溶液，所述的碱为NaOH、CaO、Ca(OH)2和NH4OH中的任意一种或多种。
步骤(2)中，含有残渣II的培养基，其中残渣II在培养基中的质量百分比为100～300g/L。该培养基中不含有包括CaO，Ca(OH)2，或CaCO3的钙类乳酸中和剂。该培养基的配方需适合凝结芽孢杆菌发酵生产L-乳酸，一般包含碳源100～300g/L，氮源1～10g/L，无机盐0.15～1g/L。其中，碳源即为残渣II，氮源为酵母膏、氯化铵、蛋白胨或玉米浆干粉，无机盐为MnSO4或MgSO4。
步骤(2)中，所述的纤维素降解酶来源于里氏木霉、绿色木霉、黑曲霉和康宁木霉中的任意一种或多种，一般具有含有纤维素酶、木聚糖酶和葡萄糖苷酶活。
步骤(2)中，纤维素降解酶的用量控制为4～10FPU/g残渣II。
步骤(3)中，凝结芽孢杆菌接种量为体积比5～15％。
D-乳酸和L-乳酸产量的测定方法采用HPLC色谱仪为Agilent 1200，配备手性分析柱Sumichiral OA 5000(4.6mm-150mm)。具体操作条件为流动相为1.0mM的CuSO4溶液，流速1.0mL/min；检测波长254nm(UV)；柱温：35℃和进样量20ul。
本发明的有益效果：
本发明与目前利用生物质制备L-乳酸的方法相比，不但可以提高纤维素和半纤维素转化为乳酸的综合效率，使其在酶用量10FPU/g的情况下乳酸得率(包括纤维素和半纤维素)达到90％，而且在发酵过程中后采用碱废液中和乳酸，可以降低乳酸生产工业中的碱耗和废水排放。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
称取lkg的玉米芯，粉碎成1～2cm左右的颗粒，加入氢氧化钠0.5kg、水7.5kg，于100℃左右蒸煮60min后，压滤分离蒸煮液和残渣，获得碱处理废液I和碱处理玉米芯残渣II。
在3L糖化发酵罐中配制2L同步糖化发酵培养基：绝干碱处理玉米芯残渣II 150g/L，酵母膏5g/L，氯化铵1g/L，MgSO40.5g/L，pH自然。加入20mL酶活为150FPIU/mL的纤维素降解酶(纤维素降解酶Celluclast为Novozymes商品酶，里氏木霉ATCC 26921生产)，升温至50℃，搅拌速度200rpm，水解反应6小时。
凝结芽孢杆菌预培养：将凝结芽孢杆菌(DSM 23183)加入200mL种子培养基中，在180rpm、50℃不通气条件下培养18h。种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50，酵母膏5，氯化铵1，CaCO3 10，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。
维持糖化发酵罐温度50～55℃，利用碱处理废液I调节pH至6.5；将200mL种子预培养液倒入糖化发酵罐中，不通气厌氧条件下进行残渣II同步糖化发酵72h，流加废液I维持反应过程pH至5.4。
发酵结束后取上清液检测L-乳酸和D-乳酸浓度，计算乳酸得率和L-乳酸光学纯度。
实验共设3次重复，测定L-乳酸浓度达到117.1g/L，光学纯度为97.3％；乳酸综合得率为93.2％。
实施例2：
称取3kg的玉米秸秆，切成1～2cm左右的碎段，按固液重量比1∶10加入浓度为5％(w/w)的NaOH溶液，于90℃左右蒸煮120min后，离心3500rpm15min固液分离，获得碱处理废液I和碱处理玉米秸秆残渣II。
在5L糖化发酵罐中配制3L同步糖化发酵培养基：碱处理玉米秸秆残渣II 200g/L，酵母膏7g/L，氯化铵1.2g/L，MgSO4 0.5g/L，pH自然。加入20mL酶活为150FPIU/mL纤维素降解酶(来源于康宁木霉)，升温至50℃，搅拌速度200rpm，水解反应6小时。
凝结芽孢杆菌预培养：将凝结芽孢杆菌(DSM 23183)接入300mL新鲜种子培养基中，在180rpm、50℃不通气条件下培养18h。种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50，酵母膏5，氯化铵1，CaCO3 10，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。
维持糖化发酵罐温度50～55℃，利用碱处理废液I调节pH至5.5；将300mL预培养液倒入糖化发酵罐中，不通气厌氧条件下进行残渣II同步糖化发酵72h，流加废液I维持反应过程pH至5.2。
发酵结束后取上清液检测L-乳酸和D-乳酸浓度，计算乳酸得率和L-乳酸光学纯度。
实验共设3次重复，测定L-乳酸浓度达到140g/L，光学纯度为97.2％；乳酸综合得率为90.2％。
实施例3：
称取1kg制糖工业压榨后的甘蔗渣，按固液重量比1∶10加入浓度为3％(w/w)的NaOH，于100℃左右蒸煮60min后，离心3500rpm15min固液分离，获得碱处理废液I和碱处理甘蔗残渣II。
在3L糖化发酵罐中配制2L同步糖化发酵培养基：碱处理甘蔗渣100g/L，玉米浆干粉5g/L，氯化铵1g/L，MgSO4 0.5g/L，pH自然。加入13mL酶活为150FPIU/mL纤维素降解酶(纤维素降解酶Celluclast为Novozymes商品酶，里氏木霉ATCC 26921生产)；升温至50℃，搅拌速度200rpm，水解反应3小时。
凝结芽孢杆菌预培养：将凝结芽孢杆菌(DSM 23183)接入200mL种子培养基中，在180rpm、50℃不通气条件下培养18h。种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50，玉米浆干粉5，氯化铵1，CaCO3 10，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。
维持糖化发酵罐温度50～55℃，将200mL预培养液倒入糖化发酵罐中，不通气厌氧条件下进行残渣II同步糖化发酵72h，流加溶液I维持反应过程pH至5.4。
发酵结束后取上清液检测L-乳酸和D-乳酸浓度，计算乳酸得率和L-乳酸光学纯度。
实验共设3次重复，测定L-乳酸浓度达到92.2g/L，光学纯度为97.5％；乳酸综合得率为96.1％。
Claims (7)
1.一种利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)生物质经碱液热处理后，固液分离得到液体I和残渣II；
(2)将含有残渣II的培养基加入到糖化发酵罐中，向糖化发酵罐内加入纤维素降解酶，在50～55℃下，水解反应0.5～6小时；
(3)维持糖化发酵罐温度为50～55℃，利用液体I调节经步骤(2)处理后的培养基pH值至6.0～6.5，向糖化发酵罐内接入凝结芽孢杆菌，厌氧条件下进行残渣II同步糖化发酵48～96h生产L-乳酸，同时流加液体I维持发酵液pH值为5.2～5.8。
2.根据权利要求1所述的利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的生物质为玉米芯、玉米秸秆、麦秆、稻秆和甘蔗渣中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的碱液为碱的水溶液，所述的碱为NaOH、CaO、Ca(OH)2和NH4OH中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述的利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于步骤(2)中，含有残渣II的培养基，其中残渣II在培养基中的浓度为100～300g/L。
5.根据权利要求1所述的利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的纤维素降解酶来源于里氏木霉、绿色木霉、黑曲霉和康宁木霉中的任意一种或多种。
6.根据权利要求1所述的利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于步骤(2)中，纤维素降解酶的用量控制为4～10FPU/g残渣II。
7.根据权利要求1所述的利用生物质发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于步骤(3)中，凝结芽孢杆菌接种量为体积比5～15％。
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