CN101748164A - 反馈补料发酵生产乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵生产乳酸的方法，具体地说涉及通过pH反馈控制补加糖发酵生产乳酸的方法。该方法包括使用常规方法制备发酵菌种的种液，然后接入装有底物的发酵罐中进行好氧、厌氧或兼性厌氧乳酸发酵。在乳酸发酵过程中，利用底物的消耗量和酸的产生量之间的比例关系，通过pH反馈控制加入底物和碱性物质的混合流加液来控制体系的pH，从而维持体系中的底物浓度在一适宜乳酸发酵的范围内，使乳酸发酵时既不产生底物抑制，也不构成限制；该发酵过程进行至乳酸的浓度达到所需时停止，得到含有乳酸的发酵液。本发明的方法利用pH值反馈控制补料，简化了生产工艺，在不增加额外设备的情况下可提高乳酸的发酵浓度，使生产更稳定，适合于工业化生产。

Description

反馈补料发酵生产乳酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵生产乳酸的方法，具体地说涉及一种通过pH反馈控制补加底物(糖)发酵生产乳酸的方法。

背景技术

乳酸有D-和L-两种构型，乳酸及其盐和酯用途很广。传统上乳酸及其盐和酯主要用于食品工业中做添加剂使用，化学工业中做清洗剂和溶剂使用；近年，乳酸及其盐和酯在医药(如：体液平衡调节剂、补钙补铁剂)和农业(如：植物促进剂)等行业的用途获得了很大的进步。

近年来，可降解塑料的兴起大大促进了L-乳酸的生产和应用。L-乳酸可用于合成聚L-乳酸。聚L-乳酸塑料具有透明度高、成型度好、安全等优点，成为可降解塑料领域中的主要品种。美、日等国都在努力实现聚L-乳酸的工业化生产。聚L-乳酸塑料生产的日用品、容器、玩具、薄膜、医疗卫生用品等，正逐渐投入市场。随着石油资源的短缺，聚乳酸可以用于替代石油基高分子材料，具有可生物降解的特点。如果10～20年后替代石油基原料聚合物消费量的10％，我国则聚乳酸年需求量每年近500万吨，产值约500亿元/年。用聚乳酸薄膜替代不可降解石油基的高分子材料作为农用地膜，可以增加粮食产量10％，约5000万吨，产值约500亿元/年。乳酸甲酯和乙酯是优良的有机溶剂，可以替代70％的石油基有机溶剂。

乳酸发酵生产工艺目前还比较粗放，发酵生产波动大。有些企业采用了一些自动控制设备或程序控制方法，可以实现pH、温度等常规参数的控制。

乳酸的发酵过程中，如果一次性投料时加入较多的底物(糖)，会产生底物抑制，影响菌体生长。目前生产一般采用的是补料批式发酵模式，即在开始时只加入适量(限制浓度以上)的底物(糖)，然后在发酵过程中以某种方式再继续补加，以维持底物(糖)浓度在适宜的范围内，使之既不产生底物(糖)抑制，也不构成限制(缺乏)。

乳酸发酵生产目前采用了一些流加技术，有连续流加、不连续流加，有恒速流加、指数流加(Bacteriocin production with Lactococcus amylovorusDCE 471 is improved and stabilized by fed-batch fermentation.Appl.Environ.Microbiol.，2000，66：606～613；Fed-batch fermentation of Lactobacillus lactisfor hyper-production of L-lactic acid，Biotech.Letters，2003，25：1833～1835；Ammonium lactate production by Lactobacillus lactis BME5-18M inpH-controlled fed-batch fermentations，Biochem.Eng.，2004，19：47～51)，目的都是为了控制基质浓度。虽然这些补料的方法可以消除限制性底物的抑制或缺乏，控制菌体的比生长速率，提高目的产物的浓度，以及实现细胞的高密度培养。但是这些现有的补料方法都是按照事先设定的程序进行操作，不能真实反映发酵过程中底物(糖)浓度的变化。由于发酵生产的多变性，各批次之间有差异，而底物(糖)又不能在线检测，所以难以确切知道发酵过程中底物的实际变化，其补料具有盲目性，影响生产控制。

要精确控制基质浓度，必须进行反馈控制。由于不能在线测定底物浓度，因此在线监测底物浓度的直接反馈流加目前难以应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有发酵生产乳酸的方法在补料时具有盲目性、影响生产控制、使得发酵浓度低的缺陷，提供一种通过检测发酵液中的pH变化，利用pH值反馈控制补料，从而简化生产工艺，在不增加额外设备的情况下使乳酸的发酵浓度提高的反馈补料发酵生产乳酸的方法。

本发明的反馈补料发酵生产乳酸的方法包括使用常规方法制备发酵菌种的种液，然后接入装有底物的发酵罐中进行好氧、厌氧或兼性厌氧乳酸发酵，其特征是：在乳酸发酵过程中，利用底物的消耗量和酸的产生量之间的比例关系，通过pH反馈控制加入底物和碱性物质的混合流加液来控制体系的pH，从而维持体系中的底物浓度在一适宜乳酸发酵的范围内，使乳酸发酵时既不产生底物抑制，也不构成限制；该发酵过程进行至乳酸的浓度达到所需时停止，得到含有乳酸的发酵液。

该方法的具体步骤如下：

1)发酵菌种的种液制备：配制种子培养基，按常规方法灭菌；将菌种接入种子培养基中进行好氧或厌氧(取决于菌种特性)培养至对数期；

所述的好氧发酵菌种有：根霉属(Rhizopus)的米根霉(RhizopusOryzae)、行走根霉(Rhizopus Stolonifer)、日本根霉(Rhizopus JaponicuS)或少根根霉(Rhiozopus Arrhizus)等；所述的厌氧发酵菌种有：乳杆菌属(Lactobacillus)的德式乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、链球菌属(streptoccoccus)的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)或芽孢杆菌属(Bacillus)的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)等。

所述的种子培养基取决于发酵菌种的特性，为本领域常规的种子培养基。

发酵类型包括D-型乳酸发酵、L-型乳酸发酵或DL-型乳酸发酵。

2)好氧、厌氧或兼性厌氧乳酸发酵：将步骤1)制得的种液接入经常规方法灭菌的初始底物浓度为10～150克/升的发酵培养基中，控制适宜的发酵温度，适度搅拌，不通空气或通入适量空气以保持所需的溶解氧环境；乳酸发酵过程中，随着发酵液中的底物转化为乳酸，发酵液的pH降低；当发酵液的pH(人工监测或用pH传感器监测)降至设定点以下时，(人工或由pH传感器的信号自动反馈控制)加入底物和碱性物质的混合流加液，直至发酵液的pH回升至设定点；该发酵过程进行至乳酸的浓度达到所需时停止，得到含有乳酸的发酵液。

所述的种液的接入量是发酵培养基重量的1～10％。

所述的发酵培养基取决于发酵菌种的特性和产物乳酸的构型。

所述的好氧乳酸发酵的温度为25～35℃；所述的厌氧乳酸发酵的温度为35～60℃。

所述的发酵液的pH设定点一般在3.5～8之间，取决于发酵菌种的特性。

所述底物和碱性物质的混合流加液中的底物浓度为150～600克/升，底物与碱性物质的比例为90～210克底物/摩尔碱。

所述的底物选自蔗糖、葡萄糖、木糖、果糖、麦芽糖、乳糖中一种或大于一种以上的混合物。

所述的碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、氨、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵或碳酸氢铵。

所述的pH值的反馈控制可通过市售的pH电极(传感器)和仪表完成，或由人工完成。

对于乳酸产生菌而言，乳酸合成与底物消耗存在较好的线性关系，这就为pH反馈控制的实施提供了前提条件。

本发明提供的反馈补料发酵生产乳酸的方法，是基于这样的构思：由于乳酸产生菌将底物(如葡萄糖)转化为乳酸，从而导致发酵体系的pH降低，在发酵过程中需要补加碱性物质来维持pH的稳定。本发明根据底物消耗速率和乳酸产生速率的关系，将底物和碱性物质按此关系配在同一溶液中，用该混合液中和发酵产生的乳酸从而调节pH值。在向发酵体系补加该混合溶液以调节pH的过程中，通过将pH控制在很窄的范围内，使得加入的碱性物质量(按当量计)与产酸量相等，所以补加该混合液控制pH的同时，随同加入发酵体系的底物量正好补充了消耗的底物量，从而使底物浓度维持在一定范围。因而，只要将pH控制在很窄的范围内，就可以保证发酵体系中的底物浓度只在很窄的范围内波动。这样的方法可以在不改变生产设备的情况下，仅在补料罐中加入碱性物质和底物，就能够在控制pH的同时实现发酵液中底物浓度的控制，即通过pH信号的反馈来间接控制底物的补加。而pH的控制是很成熟的技术，可以很方便的使用市售的pH电极(传感器)、控制仪表和执行机构来完成，也可由人工完成。用仪表设定拟控制的pH值的范围，由仪表自动控制。该拟设定的pH值的范围取决于菌种发酵的最佳pH值。

与现有技术相比，本发明提供的反馈补料发酵生产乳酸的方法的优益之处在于：通过利用pH信号反馈控制底物的补加，从而间接控制了发酵液中的底物浓度，达到较准确的控制底物浓度的目的，并且可以提高目的产物乳酸的浓度。在发酵过程中不需要增加额外设备，而且补加的底物和碱性物质的混合液可以省去灭菌操作，使生产操作更简单，适合于工业化生产。

具体实施方式

比较例1

使用的微生物菌种为拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei，NERCB0401(工业微生物，第37卷，2007，第4期，1～5))，用上述菌株进行分批补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温801mL/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.25g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏6g/L，酵母粉10g/L，氯化钠0.03g/L，硫酸亚铁0.01g/L，醋酸钠4g/L，柠檬酸二胺2g/L，磷酸二氢钾2g/L，吐温801mL/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.2g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.0，于121℃灭菌15分钟，其中葡萄糖单独灭菌后再混合。

菌种接入含150mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速100转/分钟，37℃振荡培养12小时，得到种液。种液按5％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在37±0.5℃，不通气，搅拌转速100转/分钟。发酵过程中通过流加质量浓度为25％的氨水将pH值控制在5.9～6.1。第14小时开始分批补糖，每两小时补加一次，每次补加60mL，补加的糖液葡萄糖浓度为500g/L，到第48小时停止补糖。发酵50小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到186g/L，葡萄糖对乳酸的转化率为93％。

实施例1

使用的微生物菌种为拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei，NERCB0401(工业微生物，第37卷，2007，第4期，1～5))，用上述菌株进行pH反馈补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温801mL/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.25g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏6g/L，酵母粉10g/L，氯化钠0.03g/L，硫酸亚铁0.01g/L，醋酸钠4g/L，柠檬酸二胺2g/L，磷酸二氢钾2g/L，吐温801mL/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.2g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.0，于121℃灭菌15分钟，其中葡萄糖单独灭菌后再混合。

菌种接入含150mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速100转/分钟，37℃振荡培养12小时，得到种液。种液按5％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在37±0.5℃，不通气，搅拌转速100转/分钟。在第8小时之前通过流加质量浓度25％的氨水控制pH值在5.9～6.1。第8小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与氨水的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，氨浓度为98g/L，当pH降至5.9时自动流加葡萄糖与氨水的混合液至pH升至6.1，残糖浓度维持在8～12g/L之间。第48小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到192g/L，葡萄糖对乳酸的转化率达96％。与比较例1相比，乳酸浓度提高了3.2％。

实施例2

其它发酵条件同实施例1。调节发酵pH所用的碱为氢氧化钠。在第8小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值。第8小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与氢氧化钠的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为600g/L，氢氧化钠的浓度为272g/L，当pH降至5.9以下时自动流加葡萄糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第48小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到178g/L，葡萄糖对乳酸的转化率为89％。

实施例3

其它发酵条件同实施例1。调节发酵pH所用的碱为氢氧化钾。在第8小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钾水溶液调节pH值。第8小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与氢氧化钾的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为400g/L，氢氧化钾的浓度为250g/L，当pH降至5.9以下时自动流加葡萄糖与氢氧化钾的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第48小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钾水溶液调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到176g/L，葡萄糖对乳酸的转化率为88％。

实施例4

其它发酵条件同实施例1。调节发酵pH所用的碱为碳酸钠。在第8小时之前通过流加5mol/L的碳酸钠水溶液调节pH值。第8小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与碳酸钠的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，碳酸钠的浓度为294g/L，当pH降至5.9以下时自动流加葡萄糖与碳酸钠的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第48小时停止pH反馈补糖，改用5mol/L的碳酸钠水溶液调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到175g/L，葡萄糖对乳酸的转化率为87％。

实施例5

其它发酵条件同实施例1。调节发酵pH所用的碱为碳酸氢钠。在第8小时之前通过流加5mol/L的碳酸氢钠水溶液调节pH值。第8小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与碳酸氢钠的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，碳酸氢钠的浓度为455g/L，当pH降至5.9以下时自动流加葡萄糖与碳酸氢钠的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第48小时停止pH反馈补糖，改用5mol/L的碳酸氢钠水溶液调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到176g/L，葡萄糖对乳酸的转化率为88％。

实施例6

其它发酵条件同实施例1。发酵培养基中葡萄糖改为蔗糖，蔗糖初始浓度为60g/L。在第12小时之前通过流加质量浓度25％的氨水调节pH值在5.9～6.1。第12小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加蔗糖与氨水的混合液控制pH及糖浓度，流加液中蔗糖浓度为500g/L，氨的浓度为98g/L，当pH降至5.9以下时自动流加蔗糖与氨的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第48小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，蔗糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到190g/L，蔗糖对乳酸的转化率达95％。

实施例7

其它发酵条件同实施例1。发酵培养基中葡萄糖改为乳糖，乳糖初始浓度为80g/L；调节发酵pH所用的碱为氢氧化钠。在第18小时之前通过流加10moL/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在5.9～6.1。第18小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加乳糖与氢氧化钠的混合液控制pH及糖浓度，流加液中乳糖浓度为500g/L，氢氧化钠的浓度为227g/L，当pH降至5.9以下时自动流加乳糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第48小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，乳糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到176g/L，乳糖对乳酸的转化率达88％。

实施例8

其它发酵条件同实施例1。发酵培养基中初始葡萄糖浓度为120g/L，调节发酵pH所用的碱为碳酸铵。在第38小时之前通过流加5mol/L的碳酸铵水溶液调节pH值。第38小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与碳酸铵的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，碳酸铵浓度为252g/L，当pH降至5.9以下时自动流加葡萄糖与氨水的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第50小时停止pH反馈补糖，改用5mol/L的碳酸铵水溶液调节pH值在5.9～6.1。发酵54小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到189g/L，葡萄糖对乳酸的转化率达94.5％。

实施例9

其它发酵条件同实施例1。发酵培养基中初始葡萄糖浓度为80g/L，调节发酵pH所用的碱为碳酸氢铵。在第18小时之前通过流加5mol/L的碳酸氢铵水溶液调节pH值。第18小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与碳酸氢铵的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，碳酸氢铵浓度为413g/L，当pH降至5.9以下时自动流加葡萄糖与碳酸氢铵的混合液至pH升至6.1，残糖维持在8～12g/L。第48小时停止pH反馈补糖，改用5mol/L的碳酸氢铵水溶液调节pH值在5.9～6.1。发酵50小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到188g/L，葡萄糖对乳酸的转化率达94％。

比较例2

使用的微生物菌种为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans，RS12-6(氨基酸和生物资源，2005，27卷，第1期，70～73))，用上述菌株进行分批补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，硫酸镁0.5g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨0.5g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.5，于121℃灭菌15分钟，其中葡萄糖单独灭菌后再混合。

菌种接入含200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速100转/分钟，55℃振荡培养14小时，得到种液。种液按8％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在55±0.5℃，不通气，搅拌转速100转/分钟。发酵过程中通过流加质量浓度25％的氨水将pH值控制在6.4～6.6。第24小时开始分批补糖，每两小时补加一次，每次补加60mL，补加的糖液葡萄糖浓度为500g/L，第58小时停止补糖。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到181g/L，葡萄糖对乳酸的转化率为90.5％。

实施例10

使用的微生物菌种为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans，RS12-6(氨基酸和生物资源，2005，27卷，第1期，70～73))，用上述菌株进行pH反馈补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，硫酸镁0.5g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母粉15g/L，硫酸镁0.5g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.5，于121℃灭菌15min，其中葡萄糖单独灭菌后再混合。

菌种接入含200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速100转/分钟，55℃振荡培养14小时，得到种液。种液按8％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在55±0.5℃，不通气，搅拌转速100转/分钟。在第8小时之前通过流加质量浓度25％的氨水控制pH值在6.4～6.6。第8小时后采用pH反馈控制补糖，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，氨浓度为98g/L，当pH降至6.4以下时自动流加葡萄糖与氨的混合液至pH升至6.6，残糖浓度维持在8～12g/L之间。第58小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在6.4～6.6。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到187g/L，葡萄糖对乳酸的转化率达94.5％。与比较例2相比，乳酸浓度提高了3.3％。

实施例11

其它发酵条件同实施例10。发酵培养基中葡萄糖改为木糖，木糖初始浓度为40g/L；调节发酵pH所用的碱为氢氧化钠。在第14小时之前通过流加10moL/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.4～6.6。第14小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加木糖与氢氧化钠的混合液控制pH及糖浓度，流加液中木糖浓度为500g/L，氢氧化钠的浓度为227g/L，当pH降至6.4以下时自动流加木糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.6，残糖维持在8～12g/L。第58小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.4～6.6。发酵50小时，木糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到173g/L，木糖对乳酸的转化率达86.5％。

实施例12

其它发酵条件同实施例10。发酵培养基中葡萄糖改为麦芽糖，麦芽糖初始浓度为60g/L；调节发酵pH所用的碱为氢氧化钾。在第20小时之前通过流加10moL/L的氢氧化钾水溶液调节pH值在6.4～6.6。第20小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加麦芽糖与氢氧化钾的混合液控制pH及糖浓度，流加液中麦芽糖浓度为500g/L，氢氧化钾的浓度为313g/L，当pH降至6.4以下时自动流加麦芽糖与氢氧化钾的混合液至pH升至6.6，残糖维持在8～12g/L。第58小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钾水溶液调节pH值在6.4～6.6。发酵60小时，麦芽糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为200g/L，乳酸浓度达到171g/L，麦芽糖对乳酸的转化率达95％。

比较例3

使用的微生物菌种为米根霉(Rhizopus Oryzae，NRRL395 HS 99(华南师范大学学报(自然科学版)，2002年2月，第1期，31～35))，用上述菌株进行分批补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖50g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖80g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌1g/L，硫酸镁1g/L，消泡剂THIX-298(烟台恒鑫科技有限公司)0.3mL/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.2，于121℃灭菌15分钟，其中葡萄糖单独灭菌后再混合。

菌种接入含100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200转/分钟，33℃振荡培养24小时，得到种液。种液按3％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在33±0.5℃，通无菌空气，搅拌转速500转/分钟，溶氧控制在20～30％。发酵过程中通过流加质量浓度25％的氨水将pH值控制在6.1～6.3。第24小时开始分批补糖，每两小时补加一次，每次补加35mL，补加的糖液葡萄糖浓度为500g/L，第58小时停止补糖。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗总糖浓度为160g/L，乳酸浓度达到135g/L，葡萄糖对乳酸的转化率为90.5％。

实施例13

使用的微生物菌种为米根霉(Rhizopus Oryzae，NRRL395 HS 99(华南师范大学学报(自然科学版)，2002年2月，第1期，31～35))，用上述菌株进行pH反馈补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L

2)发酵培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌1g/L，硫酸镁1g/L，消泡剂THIX-298(烟台恒鑫科技有限公司)0.3mL/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.2，于121℃灭菌15分钟，其中葡萄糖单独灭菌后再混合。

菌种接入含100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200转/分钟，33℃振荡培养24小时，得到种液。种液按3％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在33±0.5℃，通无菌空气，搅拌转速500转/分钟，溶氧控制在20～30％。在第16小时之前通过流加质量浓度25％的氨水控制pH值在6.1～6.3。第16小时后采用pH反馈控制补糖，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，氨浓度为104g/L，当pH降至6.1以下时自动流加葡萄糖与氨的混合液至pH升至6.3，残糖浓度维持在18～22g/L之间。第56小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为160g/L，乳酸浓度达到141g/L。与比较例3相比，乳酸浓度提高了4.4％。

实施例14

其它发酵条件同实施例13。发酵培养基中初始葡萄糖浓度为60g/L。调节发酵pH所用的碱为氢氧化钠。在第20小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.1～6.3。第20小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与氢氧化钠的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，氢氧化钠浓度为250g/L，当pH降至6.1以下时，自动流加葡萄糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.3，残糖维持在18～22g/L。第56小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗总糖浓度为160g/L，乳酸浓度达到128g/L，葡萄糖对乳酸的转化率达80％。

实施例15

其它发酵条件同实施例13。发酵培养基中初始葡萄糖浓度为120g/L。调节发酵pH所用的碱为氢氧化钾。在第36小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钾水溶液调节pH值在6.1～6.3。第36小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加葡萄糖与氢氧化钾的混合液控制pH及糖浓度，流加液中葡萄糖浓度为170g/L，氢氧化钾浓度为121g/L，当pH降至6.1以下时，自动流加葡萄糖与氢氧化钾的混合液至pH升至6.3，残糖维持在18～22g/L。第56小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钾水溶液调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗总糖浓度为140g/L，乳酸浓度达到110g/L，葡萄糖对乳酸的转化率达78.6％。

实施例16

其它发酵条件同实施例13。发酵培养基中葡萄糖改为蔗糖，蔗糖初始浓度为40g/L。在第20小时之前通过流加质量浓度25％的氨水调节pH值在6.1～6.3。第20小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加蔗糖与氨水的混合液控制pH及糖浓度，流加液中蔗糖浓度为500g/L，氨的浓度为104g/L，当pH降至6.1以下时自动流加蔗糖与氨的混合液至pH升至6.3，残糖维持在18～22g/L。第56小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，蔗糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为160g/L，乳酸浓度达到139g/L，蔗糖对乳酸的转化率达95％。

实施例17

其它发酵条件同实施例13。发酵培养基中葡萄糖改为蔗糖，初始蔗糖浓度为60g/L。调节发酵pH所用的碱为氢氧化钠。在第20小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.1～6.3。第20小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加蔗糖与氢氧化钠的混合液控制pH及糖浓度，流加液中蔗糖浓度为500g/L，氢氧化钠浓度为250g/L，当pH降至6.1以下时，自动流加蔗糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.3，残糖维持在18～22g/L。第56小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，蔗糖基本耗尽，消耗总糖浓度为160g/L，乳酸浓度达到125g/L，蔗糖对乳酸的转化率达78％。

实施例18

其它发酵条件同实施例13。发酵培养基中葡萄糖改为果糖，初始果糖浓度为80g/L。调节发酵pH所用的碱为氢氧化钾。在第24小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钾水溶液调节pH值在6.1～6.3。第24小时后采用pH反馈控制补糖，通过流加果糖与氢氧化钾的混合液控制pH及糖浓度，流加液中果糖浓度为500g/L，氢氧化钾浓度为367g/L，当pH降至6.1以下时，自动流加果糖与氢氧化钾的混合液至pH升至6.3，残糖维持在18～22g/L。第56小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钾水溶液调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，蔗糖基本耗尽，消耗总糖浓度为160g/L，乳酸浓度达到124g/L，果糖对乳酸的转化率达77.5％。

实施例19

使用的微生物菌种为德式乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii，CGMCC1.2624^T)，用上述菌株进行批pH反馈控制补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温801mL/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.25g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，玉米浆40mL/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.5，于121℃灭菌15分钟，其中葡萄糖单独灭菌后再混合。

菌种接入含300mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，37℃静置培养20小时，得到种液。种液按10％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在37±0.5℃，不通气，搅拌转速100转/分钟。在第14小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钠水溶液控制pH值在6.4～6.6。第14小时后采用pH反馈控制补糖，流加液中葡萄糖浓度为250g/L，氢氧化钠浓度为113g/L，当pH降至6.4以下时自动流加葡萄糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.6，残糖浓度维持在8～12g/L之间。第58小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.4～6.6。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为100g/L，乳酸浓度达到96g/L。

实施例20

使用的微生物菌种为唾液链球菌(Streptococcus salivarius，CGMCC1.2498^T)，用上述菌株进行pH反馈补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温801mL/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.25g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，玉米浆40mL/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.5，于121℃灭菌15分钟。

菌种接入含300mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，37℃静置培养20小时，得到种液。种液按10％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在37±0.5℃，不通气，搅拌转速100转/分钟。在第14小时之前通过流加质量浓度25％的氨水控制pH值在6.4～6.6。第14小时后采用pH反馈控制补糖，流加液中葡萄糖浓度为250g/L，氨浓度为49g/L，当pH降至6.4以下时自动流加葡萄糖与氨的混合液至pH升至6.6，残糖浓度维持在8～12g/L之间。第58小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在6.4～6.6。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为90g/L，乳酸浓度达到85g/L。

实施例21

使用的微生物菌种为行走根霉(Rhizopus Stolonifer，CICC 3146)，用上述菌株进行pH反馈补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.1g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌1g/L，硫酸镁1g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.2，于121℃灭菌15分钟。

菌种接入含200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200转/分钟，30℃振荡培养24小时，得到种液。种液按8％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在30±0.5℃，通无菌空气，搅拌转速500转/分钟，溶氧控制在20～30％。在第16小时之前通过流加10mol/L的氢氧化钠水溶液控制pH值在6.1～6.3。第16小时后采用pH反馈控制补糖，流加液中葡萄糖浓度为250g/L，氢氧化钠浓度为111g/L，当pH降至6.4以下时自动流加葡萄糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.6，残糖浓度维持在18～22g/L之间。第56小时停止pH反馈补糖，改用10mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为90g/L，乳酸浓度达到64g/L。

实施例22

使用的微生物菌种为日本根霉(Rhizopus Japonicus，CGMCC 3.1218)，用上述菌株进行分批补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.1g/L。

2)发酵培养基：葡萄糖80g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌1g/L，硫酸镁1g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.2，于121℃灭菌15分钟。

菌种接入含200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200转/分钟，28℃振荡培养24小时，得到种液。种液按5％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在28±0.5℃，通无菌空气，搅拌转速500转/分钟，溶氧控制在20～30％。在第16小时之前通过流加质量浓度25％的氨水控制pH值在6.1～6.3。第16小时后采用pH反馈控制补糖，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，氨浓度为104g/L，当pH降至6.1以下时自动流加葡萄糖与氨的混合液至pH升至6.3，残糖浓度维持在18～22g/L之间。第56小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为90g/L，乳酸浓度达到65g/L。

实施例23

使用的微生物菌种为少根根霉(Rhiozopus Arrhizus，ACCC 30307)，用上述菌株进行pH反馈补料发酵。所用培养基有两种：

1)液体种子培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.1g/L

2)发酵培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌1g/L，硫酸镁1g/L。

将上述两种培养基按配方配制后用NaOH和盐酸调pH值均为6.2，于121℃灭菌15分钟。

菌种接入含200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200转/分钟，28℃振荡培养24小时，得到种液。种液按5％的接种量接入装有2L发酵培养基的5L自动控制发酵罐中。发酵温度控制在28±0.5℃，通无菌空气，搅拌转速500转/分钟，溶氧控制在20～30％。在第16小时之前通过流加质量浓度25％的氨水控制pH值在6.1～6.3。第16小时后采用pH反馈控制补糖，流加液中葡萄糖浓度为500g/L，氨浓度为104g/L，当pH降至6.1以下时自动流加葡萄糖与氨的混合液至pH升至6.3，残糖浓度维持在18～22g/L之间。第56小时停止pH反馈补糖，改用质量浓度25％的氨水调节pH值在6.1～6.3。发酵60小时，葡萄糖基本耗尽，消耗的总糖浓度为90g/L，乳酸浓度达到63g/L。

Claims (10)

1.一种反馈补料发酵生产乳酸的方法，该方法包括使用常规方法制备发酵菌种的种液，然后接入装有底物的发酵罐中进行好氧、厌氧或兼性厌氧乳酸发酵，其特征是：在乳酸发酵过程中，利用底物的消耗量和酸的产生量之间的比例关系，通过pH反馈控制加入底物和碱性物质的混合流加液来控制体系的pH，从而维持体系中的底物浓度在一适宜乳酸发酵的范围内，使乳酸发酵时既不产生底物抑制，也不构成限制；该发酵过程进行至乳酸的浓度达到所需时停止，得到含有乳酸的发酵液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的发酵菌种是好氧发酵菌种或厌氧发酵菌种，其中：

好氧发酵菌种选自根霉属的米根霉、行走根霉、日本根霉或少根根霉中的一种；

厌氧发酵菌种选自乳杆菌属的德式乳杆菌、拟干酪乳杆菌、链球菌属的唾液链球菌或芽孢杆菌属的凝结芽孢杆菌中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的pH反馈控制加入底物和碱性物质的混合流加液来控制体系的pH，是当发酵液的pH降至设定点以下时，加入底物和碱性物质的混合流加液，直至发酵液的pH回升至设定点。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述的发酵液的pH设定点在3.5～8之间。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述的底物和碱性物质的混合流加液中的底物浓度为150～600克/升，底物与碱性物质的比例为90～210克底物/摩尔碱。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：在好氧、厌氧或兼性厌氧乳酸发酵中，发酵培养基中的初始底物浓度为10～150克/升。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征是：所述的好氧乳酸发酵的温度为25～35℃；所述的厌氧乳酸发酵的温度为35～60℃。

8.根据权利要求1、3、5或6所述的方法，其特征是：所述的底物选自蔗糖、葡萄糖、木糖、果糖、麦芽糖、乳糖中一种或大于一种以上的混合物。

9.根据权利要求1、3或5所述的方法，其特征是：所述的碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、氨、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵或碳酸氢铵。

10.根据权利要求1或3所述的方法，其特征是：所述的pH反馈控制体系的pH，是通过pH电极和仪表完成控制，或由人工完成控制。