CN117512024A - 乙酸盐在促进生物发酵制备乳酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酸盐在促进生物发酵制备乳酸中的应用。在进行乳酸生物发酵过程中，通过额外添加乙酸盐可以显著提高乳酸发酵菌的生长效率，同时提高发酵过程中乳酸的产量。同时通过对比实验得出，无论额外调节发酵的pH，添加乙酸盐都可以显著提高乳酸发酵菌的生长效率和乳酸产量，本发明公开了乙酸盐在乳酸生物发酵中应用效果，对乳酸的工业化生产具有显著的推动作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种乙酸盐在促进生物发酵制备乳酸中的应用。
背景技术
L-乳酸是一种重要的有机酸，其消费量约占有机酸总消费量的15％以上，广泛应用于食品、医药、农业、塑料等领域。聚乳酸，作为一种重要的热塑聚合物，主要通过L-乳酸聚合合成，具有良好的生物相容性和生物降解性，目前已经被应用至食品包装、纺织加工、医用材料、农用薄膜生产等众多领域。随着我国颁布和实施更加严格的“限塑令”，可降解生物材料越来越受到人们的重视，L-乳酸的市场需求量也呈现较大程度的增长。目前，L-乳酸的生产主要通过发酵法、化学合成法及酶法。在发酵法中，通常以淀粉或糖类物质为原料，通过乳酸菌等微生物转化合成L-乳酸。在发酵过程中，需使用碳酸钙对发酵液进行中和，将乳酸转化为乳酸钙，防止因pH值降低太快从而影响发酵。随后，用硫酸酸化发酵液，再经过过滤、浓缩及离子交换等处理过程，才能获得L-乳酸产品。目前，聚乳酸虽然已经被应用至多个领域，但其生产成本仍然较高，其中，如何降低其原料L-乳酸的价格仍然是今后一大研究重点及热点。
乳酸的生物发酵是乳酸的一大来源渠道，如何提高乳酸的生物发酵产量是一项最主要的技术问题。本申请欲提供一种能显著提高乳酸生物发酵产量的方法，在生产和生活中具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供乙酸盐在促进生物发酵制备乳酸中的应用，在进行乳酸生物发酵过程中，通过添加乙酸盐可以显著提高生物发酵菌的生长效率，同时提高发酵过程中乳酸的产量。
为了达到上述目的，本发明提供了一种乙酸盐在促进生物发酵制备乳酸中的应用，通过在乳酸的生物发酵过程中添加乙酸盐可提高乳酸的产量，其中，该生物发酵的发酵菌为凝结芽孢杆菌。
优选地，上述的发酵菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ATCC 7050。
优选地，上述乙酸盐的添加量为5-20g每升培养基，其中，最优的添加量为10g每升培养基。
优选地，上述生物发酵的培养基为其配方为葡萄糖100g/L、乙酸盐5-20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、七水硫酸镁0.3g/L、氯化钠2.5g/L，其pH为6.5，其中，最优的乙酸盐添加量为10g/L。
本发明提供的乙酸盐在促乳酸生物发酵中的应用，具有以下优点：
1、乙酸盐作为唯一碳源，有助于降低发酵成本，助力碳减排
利用乙酸钠作为唯一碳源培养凝结芽孢杆菌生产L-乳酸，有助于降低L-乳酸发酵过程中的原料成本，相比于葡萄糖，乙酸钠来源更为广泛，更易获得。与葡萄糖相比，乙酸钠具有更短、更高效的同化利用方式，可以减少在代谢过程中的物质和能量损失。由于乙酸钠可来源于厌氧消化及CO2合成气发酵，该过程有助于CO2固定和利用，对碳减排和碳中和有很好的推动作用。
2、利用乙酸盐发酵生产L-乳酸，技术路线更加经济、环保
凝结芽孢杆菌利用乙酸钠作为底物合成L-乳酸，乙酸钠一方面可以作为碳源直接被凝结芽孢杆菌利用，另一方面，乙酸钠也起着维持培养基pH的作用，可以避免因乳酸产生而造成的培养基pH降低及微生物生长和产物合成受到抑制。发酵过程中，通过监测培养基pH值和底物浓度，当pH降低较快且底物浓度低时，可以通过补加乙酸钠，同时实现碳源添加和培养基pH调节的目的。另外，由乳酸钠制备乳酸的技术路线更为简洁环保，可以避免副产物的产生和大量硫酸的使用，过程更经济环保。
3、L-乳酸与凝结芽孢杆菌联产
通过凝结芽孢杆菌利用乙酸盐发酵产L-乳酸，在发酵终止时，通过固液分离及后续分离、精制过程可获得凝结芽孢杆菌菌体和L-乳酸，菌体可直接作为饲料添加剂使用，L-乳酸可用于后续合成聚乳酸，达到两者联产的目的。
4、应用前景及对科技及经济社会发展的促进作用
本研究利用凝结芽孢杆菌以乙酸盐作为唯一碳源生产L-乳酸，与葡萄糖等碳源相比，乙酸盐价格相对较低，且凝结芽孢杆菌可进行不灭菌、敞开式发酵，此研究可以降低发酵法产L-乳酸的成本，对于后续聚乳酸价格的降低有极大的推动作用，可促进聚乳酸生物可降解材料的进一步广泛应用。在本研究中，由于使用乙酸盐同时作为碳源和pH调节剂，避免了L-乳酸传统生产方法中需添加大量碳酸钙和硫酸进行pH调节和中和的问题，提出更为清洁、环保的技术路线，有助于降低副产物的产生和污染排放，促进聚乳酸产业健康持续发展。此外，研究中使用的凝结芽孢杆菌是极具应用前景的益生菌，在饲料添加剂中广泛使用，本研究中获得的凝结芽孢杆菌菌体也可直接用于饲料添加剂，从而达到菌体、菌液的综合利用。
附图说明
图1为本发明中凝结芽孢杆菌对不同浓度乙酸钠的耐受性及利用度结果。
图2为本发明中凝结芽孢杆菌利用葡萄糖和不同浓度乙酸钠为共底物生产乳酸的结果。
图3为不调节pH时发酵罐中乙酸钠促进凝结芽孢杆菌转化葡萄糖生产乳酸的结果。
图4为调节pH时发酵罐中乙酸钠促进凝结芽孢杆菌转化葡萄糖生产乳酸的结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
说明：本发明所用菌种为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansATCC 7050(模式菌)。
种子液制备时培养基采用商业化MRS培养基，其配方为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温-80 1mL。
本发明中未具体说明的方法均为本领域的常规方法，未具体说明的试剂均为本领域的常规试剂。
实验例1凝结芽孢杆菌对不同浓度乙酸钠的耐受性和利用效率探究
在250mL摇瓶中，加入50mLMRS液体培养基，从MRS平板上接种凝结芽孢杆菌7050至MRS液体培养基中，于37℃摇床培养48h，摇床转速为200rpm，制成种子液。随后将种子液接种至含有乙酸盐的无机盐培养基中，培养基体积为100mL(250mL摇瓶)，具体配方为：磷酸二氢钾7g/L、硫酸铵2g/L、硫酸钠2g/L、硫酸镁1.5g/L、酵母粉1.5g/L，乙酸钠浓度分别设置为0、5、10、20、40、60及80g/L作为实验组，实验设置对照组采用10g/L葡萄糖作为对照，培养基其余成分与实验组一致，pH均调至6.5。培养基使用前于116℃灭菌15分钟，初始接种OD为0.2，于37℃摇床培养，摇床转速为200rpm。每隔24h取样一次，于600nm处监测OD值，通过高效液相色谱检测培养基中乙酸钠和乳酸含量，通过pH计监测培养基pH值。得到凝结芽孢杆菌对不同浓度乙酸钠的耐受性及利用度结果如图1所示，其中，图1中的A为凝结芽孢杆菌的生长曲线结果，图1中的B为底物的浓度变化曲线结果，图1中的C为培养基pH值变化结果。
由图1可知，凝结芽孢杆菌可以利用乙酸钠作为唯一碳源进行生长，利用乙酸钠时培养基pH升高(从6升至8)，呈碱性。当乙酸钠浓度为10g/L时，培养至96h，OD值达到2.21，且乙酸钠被完全消耗完。当乙酸钠浓度为20g/L时，细胞浓度达到最高，培养至72h时，OD值为2.67，但培养至96h时培养基中残余乙酸钠为8.7g/L。结果表明，10g/L乙酸钠添加为最适浓度，并且以乙酸钠作为唯一碳源时，未检测到乳酸生成。
实验例2葡萄糖和乙酸盐共利用产乳酸研究
进一步采用富营养的MRS培养基培养凝结芽孢杆菌。在250mL摇瓶中，加入50mLMRS液体培养基，从MRS平板上接种凝结芽孢杆菌至MRS液体培养基中，于37℃摇床培养48h，摇床转速为200rpm，制成种子液。随后将种子液接种至含有乙酸盐的富营养培养基中，培养基体积为100mL(250mL摇瓶)，实验组配方为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5-20g/L(四个梯度，5、10、15、20g/L)，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温-80 1mL；对照组配方为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温-801mL，pH均调至6.5。培养基使用前于116℃灭菌15分钟，初始接种OD为0.2，于37℃摇床培养，摇床转速为200rpm。每隔24h取样一次，于600nm处监测OD值，通过高效液相色谱检测培养基中乙酸钠和乳酸含量，通过pH计监测培养基pH值。得到凝结芽孢杆菌利用葡萄糖和不同浓度乙酸钠为共底物生产乳酸的结果如图2所示，其中，图2中的A为凝结芽孢杆菌的生长曲线结果，图2中的B为底物的浓度变化曲线结果，图2中的C为乳酸浓度变化曲线结果。
由图2可知，相比只添加有葡萄糖的对照组，实验组额外添加乙酸钠(5-20g/L)均可以促进葡萄糖快速利用，从而促进菌体快速生长。实验组的葡萄糖48h完全被消耗，对照组需72h才完全消耗完。实验组24h乳酸产量最大，为3.78-5.99g/L(不同浓度乙酸钠)，对照组24h乳酸产量为1.33g/L。证明乙酸盐添加可以促进葡萄糖快速利用，有助于菌体生长和乳酸合成。
实验例3发酵罐中乙酸盐促进乳酸合成研究
对比例1：不调节pH的发酵情况
在250mL摇瓶中，加入50mLMRS液体培养基，从MRS平板上接种凝结芽孢杆菌至MRS液体培养基中，于37℃摇床培养48h，摇床转速为200rpm，制成种子液。随后将种子液接入发酵罐中，发酵罐体积为5L，装液量3L，初始pH调至6.5，发酵罐转速为120rpm，温度为50℃。实验组培养基配方为：葡萄糖100g/L，乙酸钠10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，七水硫酸镁0.3g/L，氯化钠2.5g/L；对照组培养基配方为：葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，七水硫酸镁0.3g/L，氯化钠2.5g/L。每隔24h取样一次，于600nm处监测OD值，通过高效液相色谱检测培养基中乙酸钠和乳酸含量，pH通过pH计监测。得到发酵罐中乙酸钠促进凝结芽孢杆菌转化葡萄糖生产乳酸的结果如图3所示，其中，图3中的A为凝结芽孢杆菌的生长曲线和培养基pH变化结果，图3中的B为底物和乳酸浓度变化曲线结果。
由图3可知，在5L发酵罐中，不调节pH的情况下，培养基中添加10g/L乙酸钠可以显著提高细胞生长OD值，同时减缓pH下降趋势。发酵12h后，添加乙酸钠的实验组乳酸产量为12.37g/L，对照组为2.71g/L，差异显著。结果表明，在不调节pH的发酵罐中，培养基中添加乙酸钠可以显著提高细胞生长和乳酸生产。
对比例2：调节pH时的发酵情况
在250mL摇瓶中，加入50mLMRS液体培养基，从MRS平板上接种凝结芽孢杆菌至MRS液体培养基中，于37℃摇床培养48h，摇床转速为200rpm，制成种子液。随后将种子液接入发酵罐中，发酵罐体积为5L，装液量3L，初始pH调至6.5，开始发酵后pH用10M NaOH控制保持为6.5，发酵罐转速为120rpm，温度为50℃。实验组培养基配方为：葡萄糖100g/L，乙酸钠10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L；硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，七水硫酸镁0.3g/L，氯化钠2.5g/L；对照组培养基配方为：葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L；硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，七水硫酸镁0.3g/L，氯化钠2.5g/L。每隔24h取样一次，于600nm处监测OD值，通过高效液相色谱检测培养基中乙酸钠和乳酸含量。得到发酵罐中乙酸钠促进凝结芽孢杆菌转化葡萄糖生产乳酸的结果如图4所示，其中，图4中的A为凝结芽孢杆菌的生长曲线结果，图4中的B为氢氧化钠的添加量情况，图4中的C为底物和乳酸浓度变化曲线结果。
由图4可知，在5L发酵罐中，通过NaOH调节pH的情况下，培养基中添加10g/L乙酸钠仍可以显著提高细胞生长OD值。发酵24h时，实验组最大OD为15.675，对照组为13.325。发酵至41h时，实验组乳酸产量为89.21g/L，对照组为77.35g/L，提高15.33％。发酵结束时，实验组所用NaOH用量为280mL，而对照组所用NaOH用量为300mL，减少6.7％。结果表明，在控制pH的发酵罐中，培养基添加乙酸钠可以显著提高细胞生长和乳酸生产，且能减少pH调节剂(NaOH)用量。
本技术方案以乙酸盐作为唯一碳源培养凝结芽孢杆菌生产L-乳酸，由于乙酸钠价格相对较低，代谢途径更短更高效，且过程可采用不灭菌、开放式发酵，有助于有效降低发酵成本。另外，乙酸钠的来源十分广泛，可以通过多种生物过程产生，如CO2固定、厌氧消化等，本技术方案有助于助力碳减排和碳中和。由于乙酸钠为碱性，常被用做pH调节剂，利用乙酸钠作为碳源，一方面可以直接被凝结芽孢杆菌利用生产L-乳酸，另一方面，乙酸钠可以维持培养基pH，减缓发酵过程中由于L-乳酸累积造成的pH降低问题，在实际发酵过程中可以通过流加乙酸钠实现碳源添加和pH调节双重目的。
综上可知，本发明提供的技术方案，即通过在乳酸的生物发酵中添加乙酸盐可以显著提高乳酸的产量，这对乳酸的工业化生产具有显著的推动作用和经济价值。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (6)
1.乙酸盐在促进生物发酵制备乳酸中的应用，其特征在于，通过在乳酸的生物发酵过程中添加乙酸盐可提高乳酸的产量，所述生物发酵的发酵菌为凝结芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述所述的应用，其特征在于，所述的发酵菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ATCC 7050。
3.根据权利要求1所述所述的应用，其特征在于，所述乙酸盐的添加量为5-20g每升培养基。
4.根据权利要求1所述所述的应用，其特征在于，所述乙酸盐的添加量为10g每升培养基。
5.根据权利要求1所述所述的应用，其特征在于，所述生物发酵的培养基为葡萄糖100g/L、乙酸盐5-20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、七水硫酸镁0.3g/L、氯化钠2.5g/L，其pH为6.5。
6.根据权利要求5所述所述的应用，其特征在于，所述的培养基，其配方为葡萄糖100g/L、乙酸盐10g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、七水硫酸镁0.3g/L、氯化钠2.5g/L，其pH为6.5。
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