CN101603057A - 一种生物法合成1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物法合成1，3－丙二醇的生产工艺，属于生物化工技术领域。本发明采用微生物好氧发酵，以兼性厌氧的克雷伯氏肺炎杆菌为出发菌株，依次含有以下步骤：克雷伯肺炎杆菌的种子活化；好氧条件下种子培养；微好氧条件下，以上述克雷伯肺炎杆菌菌体为生物催化剂，在发酵温度30～50℃，pH 7.0～9.0条件下，以葡萄糖辅助的甘油培养基进行发酵生产1，3－丙二醇，发酵18～36h后结束发酵。利用本发明方法合成1，3－丙二醇具有生产周期短，生产强度高，发酵控制简单，操作方便，成本低的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
1，3-丙二醇(1，3-Propanidiol)是一种重要的化工原料，可作为聚酯、聚醚和聚氨酯的重要单体原料，是工业生物技术领域研究的重要产品之一。由1，3-丙二醇合成的聚合物具有生物可降解性、安全无毒等许多其它二元醇合成塑料所不具有的优良特性，不仅在服装和工程塑料领域得到应用，已作为食品、药品和化妆品的包装材料开始应用。以1，3-丙二醇为原料合成的食品添加剂丙二醇酯，作为世界六大食品乳化剂之一，目前也已被美国、日本和中国等国家及欧盟、联合国粮农组织和世界卫生组织批准使用。1，3-丙二醇作为一种重要的化工原料，还在油墨、印染、涂料、药物、润滑剂、抗冻剂等众多领域均具有广泛的应用。
生物法与化学法相比条件温和、操作简便、副产物少、无环境污染，已成为各国研究的焦点，因此人们越来越倾向于利用可再生资源甘油为原料生物法生产1，3-丙二醇。自1881年Auhust Freund发现巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum)能够利用甘油合成1，3-丙二醇以来，至今已发现多种微生物具有在厌氧或兼性厌氧条件下利用甘油发酵生产1，3-丙二醇的能力，其中克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)及丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)因具有较高的1，3-丙二醇转化率及生产强度，是研究的最多的三种菌。
利用肠道细菌将甘油歧化为1，3-丙二醇的发酵方法为目前普遍采用发酵方法，其发酵过程大多采用厌氧或好氧厌氧两步发酵(如USP5254467、CN1955304A和CN 1206362C等)，其生产过程中需要提供制氮设备，增加了固定设备投资和能耗，过程控制较为繁琐，因此利用微氧或好氧发酵进行1，3-丙二醇的生产逐渐受到重视。研究发现，在微好氧或好氧条件下，兼性厌氧的克雷伯氏菌也可以发酵甘油生产1，3-丙二醇，修志龙等开发了一种微生物微氧发酵生产1，3-丙二醇的方法(CN 1204260C)，初步探索了在有氧条件下发酵生产1，3-丙二醇的工艺技术，但产物终浓度低。宫衡等(CN 101182552A)报道了在微氧条件下通过对发酵液的渗透进行分阶段调控，提高产物浓度和生产强度。刘德华等发明了一种微生物好氧发酵生产1，3-丙二醇的方法(CN1763210)，但该方法也存在发酵周期相对较长，生产强度较低。与化学合成法相比成本偏高的问题。在专利(CN 100999742A)中刘德华等改进上述方法，根据发酵过程中3-羟基丙醛的检测值进行调控，产物终浓度有一定提高。但与化学法生产相比，微生物发酵生产1，3-丙二醇技术仍需要继续在提高转化率、产品终浓度和生产强度，简化发酵工艺控制，减少能耗，等方面开展研究，以降低生产成本提高其产品的市场竞争力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，以解决现有工艺中转化率低，工艺复杂，成本高的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明是一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，具体操作步骤如下：
1)将甘油管保存的克雷伯氏菌(张根林等，Biochemical engineeringJournal.2007，37：256-260)在无菌条件下接种到LB(Luria-Bertani)固体培养基上，30～37℃活化培养8～12小时；
2)在上步培养后得到的固体培养基表面挑取单个菌落，在无菌条件下接入到种子培养基中，30～40℃摇床培养8～12小时，得一级种子液；得到的一级种子在无菌条件下接入到种子培养基中，种子液接种量为培养基的5～10％，30～40℃摇床培养8～12小时，得到二级级种子液；种子培养基占培养容器体积的20～40％，摇床转速150～220rpm；
3)将发酵培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐体积的50％～80％，发酵培养基110～121℃灭菌15min以上，搅拌冷却至室温后，在无菌条件下向发酵罐中接入第二步制得的二级种子液进行发酵，发酵18～36小时后得到目标产物；二级种子液占发酵培养基体积的5～15％，发酵温度30～50℃，搅拌转速150～300rpm，发酵过程中发酵液pH值由发酵罐的pH在线监测装置检测，在发酵开始后1～2小时后通过发酵罐补料装置调节发酵液pH在7.0～9.0范围内，补料溶液为摩尔比为2～5∶1的甘油与氢氧化钾或氢氧化钠混合溶液。
所述步骤(1)中LB培养基为每升中含酵母浸膏粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，以酸或碱调节pH 6.5～7.5。
所述步骤(2)中种子培养基为每升中含甘油15～60g，酵母粉0.5～5g，(NH4)2SO43～10g，K2HPO4·3H2O 4～8g，KH2PO40.5～3.5g，MgSO4·7H2O 0.1～1g，CaCl2·H2O0.01～0.1g，以酸或碱调节调节pH 7.0～9.0。
所述步骤(3)中发酵培养基为每升中含甘油15～60g，酵母粉0.5～5g，(NH4)2SO43～10g，K2HPO4·3H2O 4～8g，KH2PO40.5～3.5g，MgSO4·7H2O 0.1～1g，CaCl2·H2O0.01～0.1g，微量元素溶液0.1～5mL，铁溶液0.5～5mL，以酸或碱调节调节pH7.0～9.0。
其中每升铁溶液包括硫酸亚铁5g和浓盐酸4ml。
每升微量元素溶液包括MnSO4·H2O 50～200mg，ZnCl250～100mg，Na2MoO4·2H2O20～80mg，H3BO350～100mg，CoCl2·6H2O 10～300m，CuSO4·5H2O 20～80mg，NiCl2·6H2O 50～100mg，浓盐酸0.5～2ml。
所述步骤(3)中在每升发酵培养基中一次性添加辅助碳源葡萄糖或蔗糖等2～20g，辅助碳源的添加促进菌体生物量的快速积累，缩短菌体发酵生产过程中的延迟期，减少菌体生长对底物甘油的消耗，提高甘油对1，3-丙二醇的转化率。在发酵开始后间歇式通入无菌空气，通气时每次间隔30～60min，每次通气30～60min，通气量1～5vvm，有利于二氧化碳等发酵代谢产物的及时排除避免对发酵过程的干扰，提高1，3-丙二醇生产强度和转化率。
本发明的优点在于：发酵培养基中添加辅助碳源，菌体生物量在发酵前期快速积累，发酵周期短，生产强度高；同时补料通过在线发酵液pH调控完成，甘油的流加时间和流加量仅由pH在线调控，可实现实时调控，不需要频繁取样，避免染菌，易于操作，且避免底物和产物抑制。发酵采用间歇法通空气的好氧发酵条件，有利于菌体的生长，能耗低；实验证明，该方法转化甘油合成1，3-丙二醇，生产强度达到2～4g/l·h，甘油对1，3-丙二醇的转化率达65％以上，发酵周期比同类方法缩短12～24小时。
具体实施方式
以下结合具体实施实例对本发明作进一步详细描述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
实施例1
1)将甘油管中保存的兼性厌氧的克雷伯肺炎杆菌无菌条件下接种到LB(Luria-Bertani)固体培养基上，30℃活化培养8小时；其中LB培养基每升中含酵母浸膏粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，以碳酸钠调节培养基pH 7.0；
2)在上步培养后得到的固体培养基表面挑取单个菌落，接入到150mL种子培养基中，培养容器为500mL摇瓶，30℃摇床培养8小时，摇床转速180rpm，得到一级种子液；得到的一级种子在无菌条件下接入到种子培养基中，种子液接种量为培养基的5～10％，相同条件下培养，得到二级种子液；其中种子培养基每升中含甘油20g，酵母粉1g，(NH4)2SO46g，K2HPO4·3H2O 5g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·H2O 0.02g，以NaCO3调节培养基pH 7.0。
3)将3升发酵培养基装入体积为5升的发酵罐中，发酵液初始pH为8.0，发酵温度40℃，搅拌转速160rpm，发酵过程中通气量1.2vvm，发酵24小时。
所述步骤(3)发酵培养基每升中含甘油20g，酵母粉1g，(NH4)2SO46g，K2HPO4·3H2O 5g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·H2O 0.02g，微量元素溶液1mL，铁溶液2mL，以NaCO3调节pH 8.0。
其中每升铁溶液(Fe2+solution)包括硫酸亚铁5g，浓盐酸4ml(37％)。
每升微量元素溶液包括MnSO4·H2O100mg，ZnCl270mg，Na2MoO4·2H2O 50mg，H3BO360mg，CoCl2·6H2O 200m，CuSO4·5H2O 28mg，NiCl2·6H2O 70mg，浓盐酸1ml。
发酵结果：
发酵过程中，发酵液pH也随菌体的生长而逐渐降低，到对数生长后期，发酵液pH值与初始相比降低2左右。在甘油初始浓度为20g/L情况下，底物甘油被快速消耗，发酵8小时就已经很难检出，发酵8小时，甘油的摩尔转化率达0.65，生产强度为1.34g/L·h，1，3-PD的终浓度为10.8g/L。
实施例2
1)同实施例1的第一步
2)同实施例1的第二步
3)同实施例1的第三步，但发酵过程中发酵液pH值由4M氢氧化钠调节，甘油以2.2g/L·h的流速恒速补加，发酵36小时。
发酵结果：
发酵过程中，甘油浓度在前20小时内消耗速率较为平稳，后期减缓甘油积累影响到1，3-丙二醇的合成，发酵36小时，1，3-丙二醇终浓度为36.02g/L，摩尔转化率0.62，生产强度为1.0g/L·h。与不补料发酵相比虽然产物浓度提高，但甘油恒速补料方式使得1，3-丙二醇的合成滞后，导致生产强度、转化率等都有所降低。
实施例3
1)同实例1的第一步
2)同实例1的第二步
3)同实例1的第三步，补料流加的溶液为摩尔比为2.5∶1的甘油与碱(氢氧化钾或氢氧化钠)混合溶液。发酵过程中不通气。发酵36小时。
发酵结果：
不通气条件下进行甘油pH调控的甘油实时补料发酵，发酵36小时1，3-丙二醇终浓度提高到55.76g/L，平均生产强度为1.55g/l·h，但甘油对1，3-丙二醇的摩尔转化率有所降低为0.62。虽然不通气方式可减少大量动力消耗，但在发酵过程中微生物代谢产生的二氧化碳等代谢废物无法排出，影响1，3-丙二醇转化率和生产强度。
实施例4
1)同实施例1的第一步
2)同实施例1的第二步
3)同实施例3的第三步，但通气方式通入无菌空气，通气量为1.5vvm
通气条件下，菌体生长迅速，1，3-丙二醇的合成从对数生长期开始持续增长。发酵30小时，1，3-丙二醇的浓度已经达60.3g/l，甘油对1，3-丙二醇的摩尔转化率为0.65，生产强度为2.01g/l·h。
实施例5
1)同实施例1的第一步
2)同实施例1的第二步
3)同实施例3的第三步，补加5g/L的葡萄糖作为辅助碳源。发酵时间36小时。
发酵结果：
作为辅助碳源，葡萄糖的添加促进了菌体生物量的快速积累，菌体在发酵罐中的生长几乎没有延滞期，并且在12h即进入了稳定期。由于葡萄糖的加入使1，3-丙二醇的合成在初期有一个延迟现象，但此后合成迅速增加，发酵30小时，1，3-丙二醇浓度为64.47g/L，生产强度2.17g/L·h，转化率为0.70。发酵结果与宫衡等报道的在微氧条件下发酵结果接近(CN 101182552A)。与报道的好氧发酵生产1，3-丙二醇的发酵工艺相比，刘德华等在专利(CN 100999742A)报道通过对发酵过程中3-羟基丙醛的浓度调控甘油的流加，发酵36小时1，3-丙二醇浓度最高达73g/l，但转化率仅为50％，。相比较本实施例使用的方法在发酵生产1，3-丙二醇调控过程不需要频繁取样检测，减少发酵的染菌几率，并可实现在线检测，不会出现调控相对滞后的现象，操作方便，转化率较高。
Claims (6)
1、一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，其特征在于具体操作步骤如下：
1)将甘油管保存的克雷伯氏菌(张根林等，Biochemicalengineering Journal.2007，37：256-260)在无菌条件下接种到LB(Luria-Bertani)固体培养基上，30～37℃活化培养8～12小时；
2)在上步培养后得到的固体培养基表面挑取单个菌落，在无菌条件下接入到种子培养基中，30～40℃摇床培养8～12小时，得一级种子液；得到的一级种子在无菌条件下接入到种子培养基中，种子液接种量为培养基的5～10％，30～40℃摇床培养8～12小时，得到二级级种子液；种子培养基占培养容器体积的20～40％，摇床转速150～220rpm；
3)将发酵培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐体积的50％～80％，发酵培养基110～121℃灭菌15min以上，搅拌冷却至室温后，在无菌条件下向发酵罐中接入第二步制得的二级种子液进行发酵，发酵18～36小时后得到目标产物；二级种子液占发酵培养基体积的5～15％，发酵温度30～50℃，搅拌转速150～300rpm，发酵过程中发酵液pH值由发酵罐的pH在线监测装置检测，在发酵开始后1～2小时后通过发酵罐补料装置调节发酵液pH在7.0～9.0范围内，补料溶液为摩尔比为2～5∶1的甘油与氢氧化钾或氢氧化钠混合溶液。
2、如权利要求1所述的一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤1)中LB培养基为每升中含酵母浸膏粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，以酸或碱调节pH 6.5～7.5。
3、如权利要求1所述的一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤2)中种子培养基为每升中含甘油15～60g，酵母粉0.5～5g，(NH4)2SO4 3～10g，K2HPO4·3H2O 4～8g，KH2PO4 0.5～3.5g，MgSO4·7H2O 0.1～1g，CaCl2·H2O 0.01～0.1g，以酸或碱调节调节pH 7.0～9.0。
4、如权利要求1所述的一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤3)中发酵培养基为每升中含甘油15～60g，酵母粉0.5～5g，(NH4)2SO43～10g，K2HPO4·3H2O 4～8g，KH2PO4 0.5～3.5g，MgSO4·7H2O 0.1～1g，CaCl2·H2O 0.01～0.1g，微量元素溶液0.1～5mL，铁溶液0.5～5mL，以酸或碱调节调节pH 7.0～9.0；其中每升铁溶液包括硫酸亚铁5g和浓盐酸4ml，每升微量元素溶液包括MnSO4·H2O 50～200mg，ZnCl2 50～100mg，Na2MoO4·2H2O 20～80mg，H3BO3 50～100mg，CoCl2·6H2O 10～300m，CuSO4·5H2O 20～80mg，NiCl2·6H2O 50～100mg，浓盐酸0.5～2ml。
5、如权利要求1所述的一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤3)中在每升发酵培养基中添加葡萄糖或蔗糖2～20g，可促进菌体生物量的快速积累，缩短菌体发酵生产过程中的延迟期，减少菌体生长对底物甘油的消耗。
6、如权利要求1所述的一种生物法合成1，3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤3)中在发酵开始后间歇式通入无菌空气，通气时每次间隔30～60min，每次通气30～60min，通气量1～5vvm，可提高转化率和生产强度。
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