CN102776245A

CN102776245A - 一种1,3-丙二醇的制备方法

Info

Publication number: CN102776245A
Application number: CN2012102628302A
Authority: CN
Inventors: 方柏山; 池帅
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: CN102776245B

Abstract

一种1,3-丙二醇的制备方法，涉及一种化工原料。构建生物砖元件dhaT，再构建生物砖元件T7 promoter-RBS-dhaT-TT，然后构建组基因环路装置T7-RBS1.0-dhaB-TT-T7-RBS1.0-yqhD-TT-T7-RBS1.0-dhaT-TT，再发酵培养。利用合成生物学技术快速、高效构建甘油转化1,3-丙二醇的基因环路装置库，并可广泛应用于合成生物学中标准模块和元件的组合与拼装。此外，基因环路解决了NADH单一还原力瓶颈问题，达到NADH和NADPH辅酶并用的效果，优化甘油转化为1,3-丙二醇的合成生物系统，提高1,3-丙二醇产量和得率。

Description

一种1,3-丙二醇的制备方法

技术领域

本发明涉及一种化工原料，尤其是涉及一种1,3-丙二醇的制备方法。

背景技术

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料。可用于粘合剂、防冻剂、增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成，也广泛应用于食品、化妆品和制药等行业。最主要的用途是合成新型聚酯(聚对苯二甲酸-1,3-丙二醇酯PTT)的原料。PTT由对苯二甲酸(PTA)和1,3-丙二醇作为单体聚合而成。PTT兼具聚对苯二甲酸乙二酷(PET)和聚对苯二甲酸丁二酷(PBT)的优良特性，PTT既具有PET的物理性能，包括强度、韧性和耐热性，又具有PBT的加工优势，如低熔点、结晶快，浇铸温度等，同时又保持聚酯优点，即尺寸稳定性、电绝缘性和耐化学品塑性。同时，PTT纤维还具有柔软，回弹性，抗污染，抗静电，易处理，快干等优点。因此PTT可广泛应用于纺织，地毯，薄膜材料，包装等工业,具有广泛应用前景。1,3-丙二醇的生产方法有化学法和生物法，中国专利CN1400201A，CN1431183A，CN101134713A等均是采用化学法，生产过程中需要高温高压，昂贵的催化剂且产生有毒的中间体等缺点；由于生物法利用的是可再生资源、其生产过程对环境友好等特点，是一种生产成本最低，污染最少的绿色方法，因此具有广阔的发展前景。随着石油等不可再生资源的日益紧缺，及环境问题日益突出，生物柴油的生产应运而生。生物柴油生产过程中产生大量的副产物甘油，如何有效综合利用废甘油成了生物柴油产业发展的一个关键问题，这赋予了甘油生物转化生产1,3-丙二醇新的现实意义。

生物转化甘油产1,3-丙二醇的代谢途径中，还原途径中还原型辅酶I（NADH）的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。中国专利CN101603057A公开一种生物法合成1,3-丙二醇的方法，其特点为以兼性好氧的克雷伯杆菌在发酵温度30-50℃，pH7.0-9.0条件下，以葡萄糖辅助甘油培养基进行发酵生产。该方法利用野生菌生产1,3-丙二醇，只利用单一辅酶I（NADH）并没有解决还原力不足的问题，并且还依赖于维生素B₁₂和葡萄糖，提高了生产成本。传统的基因工程方法通过加强甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶基因的表达来强化还原途径，但这必然导致细胞辅酶I（NAD⁺）浓度的增大，引起3-羟基丙醛累积，并最终影响细胞生长和1,3-丙二醇的生产。因此通过拓展可利用的还原力，引入依赖于还原型辅酶II（NADPH）的来源于大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD，构建NADH和NADPH辅酶并用系统，强化1,3-丙二醇生产的还原途径进而提高1,3-丙二醇的产量。

合成生物学是一个结合了探索性科学和构建性工程的研究领域。合成生物学的核心理念是设计与合成。与传统的生物学通过解剖生命体以研究其内在构造的思路不同，合成生物学的研究方向完全是相反的：它是从最基本的要素开始一步步建立生物体的零部件，是逆自然界的一个过程。基因工程是把一个物种的基因延续、改变并转移至另一物种体内，而合成生物学的目的却在于组装各种生命元件来建立人工生物体系，让它们能像电路一样在生物体内运行，使生物体能按预想的方式完成各种生物学功能。合成生物学除要利用基因工程的手段外还要建立一些标准和采用一些规则来简化人工生物系统的设计过程。合成生物学涉及的生物系统分成DNA、零件、装置、系统4个层次。合成生物学可以同时处理更多的目的基因、构建更复杂的基因环路及网络，以及通过对合成生物系统的分析和建模可以获得更理性的认识，因此，合成生物学被誉为下一代的生物技术。我们利用合成生物学标准化技术及高效组装技术对不同物种来源、代谢途径涉及的关键酶基因进行逐一组合，并实现基因排列顺序的快速调整等，完成产物1,3-丙二醇最大化的目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种1,3-丙二醇的制备方法。

本发明包括以下步骤：

1）将1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT从克雷伯杆菌DSM2026中克隆出来，通过PCR方法加上生物砖标准化酶切位点EcoRI，XbaI，SpeI并与生物砖骨架pSB1A2连接，进行同义突变，完成生物砖元件dhaT的构建；

2）测序完成后分别与RBS1.0，RBS0.6，RBS0.3，RBS0.07连接，再连接上T7 promoter，TT terminater，构建成不同表达效率的蛋白酶表达元件，甘油保种，-70℃保存，来源于丁酸梭状芽孢杆菌VPI 1718的甘油脱水酶基因dhaB及来源于大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD按步骤1）构建；

3）将构建好的dhaB，dhaT，yqhD连接成基因环路，转化到大肠杆菌BL21中，甘油保种；

4）进行发酵培养前先在种子培养基中培养，用无菌注射器将种子液第1次接种于装有种子培养基的血清瓶中再培养，将扩培的种子液第2次接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵后，得产物1,3-丙二醇。

在步骤1）中，所述克雷伯杆菌DSM2026购自德国菌种和细胞收集中心（DSMZ）；所述PCR仪可采用Biometra TProfessional PCR仪。

在步骤2）中，所述丁酸梭状芽孢杆菌VPI 1718购自弗吉尼亚理工大学；所述大肠杆菌BL21购买Takara公司。

在步骤4）中，所述种子培养基可采用LB培养基；所述培养的条件可为37℃、150r/min摇床培养；所述第1次接种的接种量可为5％；所述再培养的条件可为37℃、150r/min摇床培养；所述第2次接种的接种量可为10％；所述发酵的过程中可向发酵罐中通氮气来维持体系的厌氧条件，并控制pH为6.8；所述发酵的过程中可加入补料混合溶液，所述补料混合溶液由甘油和NaOH组成，按质量比甘油∶NaOH=72∶8；所述分析发酵液中甘油和1,3-丙二醇浓度的方法可采用美国安捷伦高效液相色谱Agilent1100分析发酵液中甘油和1,3-丙二醇浓度。

在发酵过程中，可每间隔1～3h取样，测定发酵液的菌体OD值，分析发酵液中甘油和1,3-丙二醇的浓度。

本发明的优点在于利用合成生物学技术快速、高效构建甘油转化1,3-丙二醇的基因环路装置库，并可广泛应用于合成生物学中标准模块和元件的组合与拼装。此外，基因环路解决了NADH单一还原力瓶颈问题，达到NADH和NADPH辅酶并用的效果，优化甘油转化为1,3-丙二醇的合成生物系统，提高1,3-丙二醇产量和得率。

附图说明

图1为甘油标准曲线。在图1中，横坐标为峰面积，纵坐标为甘油浓度（g/L）；甘油标准曲线方程为：y=3×10^-6x－0.2105，线性相关系数R²=0.9998，其中x为甘油峰面积，y为甘油浓度(g/L)。

图2为1,3-丙二醇标准曲线。在图2中，横坐标为峰面积，纵坐标为1,3-丙二醇浓度（g/L）；1,3-丙二醇标准曲线方程为：y=4×10^-6x+0.0288，线性相关系数R²＝0.9999，其中x为1,3-丙二醇峰面积，y为1,3-丙二醇浓度(g/L)。

图3为补料分批发酵动力学曲线。在图3中，横坐标为时间（h），左纵坐标为甘油和1,3-丙二醇浓度（g/L），右纵坐标为OD值；标记■为甘油，◆为1,3-丙二醇，▲为OD；P为补料。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

步骤一、生物砖元件dhaT的构建。

提取克雷伯氏菌基因组，根据NCBI公布的肺炎克雷伯氏菌DSM2026菌株dhaT基因序列设计合成PCR所需的引物，用Primer premier5设计引物：

上游引物S1：CGGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGATGAGCTATCGTATGTTTGA（含EcoRI，XbaI）；

下游引物A1：ACGCGGGACTAGTATAACACTCAGAATGCCTGGCGGAAAATCG（含SpeI）。

向200μL eppedoff管中，加入200pmol的dNTPs,上下游引物各20μmol,模板DNA约1ng,5UFast Pfu DNA聚合酶，10μL5×Fast Pfu酶Buffer，然后加无菌蒸馏水至总体积50μL。利用Biometra TProfessional PCR仪反应参数是94℃预变性5min后，94℃变性45s,66.8℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，然后72℃延伸5min，得到PCR产物。

因目的基因里含有生物砖后缀PstI酶切位点，需进行同义突变消除此酶切位点。用Primerpremier5设计引物:

上游引物S2:CTCGGCAGCAATCTGCAAGCGCGGGAATACATG

下游引物A2：CATGTATTCCCGCGCTTGCAGATTGCTGCCGAG

向200μL eppedoff管中，加入200pmol的dNTPs,上下游引物各20μmol,模板DNA约1ng,2.5U Pfu DNA聚合酶，5μL10×Pfu酶Buffer，然后加无菌蒸馏水至总体积50μL。反应参数是94℃预变性5min后，94℃变性45s,63.3℃退火60s，72℃延伸8min，30个循环，然后72℃延伸10min，得到PCR产物。PCR反应完后，加入1.5μL DpnI酶消化2小时。测序结果显示生物砖元件标准化成功，甘油管保种DH5ɑ（pSB1A2-dhaT）。

步骤二、生物砖元件T7 promoter-RBS-dhaT-TT的构建

提取质粒pSB1A2-dhaT，经XbaI/PstI双酶切，产生约1200bp的目的基因片段。同时提取质粒pSB1A2-RBS1.0，pSB1A2-RBS0.6，pSB1A2-RBS0.3，pSB1A2-RBS0.07经SpeI/PstI双酶切，产生约2100的前端载体片段，跑胶回收插入片段pSB1A2-RBS1.0，pSB1A2-RBS0.6，pSB1A2-RBS0.3，pSB1A2-RBS0.07；连接上述的前端载体片段和目的基因插入片段，转化到DH5ɑ中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养，第二天挑单菌落，37℃LB液体培养基200r/min震荡培养14h，提取质粒进行EcoRI和PstI双酶切和EcoRI单酶切，跑胶验证，双酶切的条带分别为约2000 bp的质粒骨架pSB1A2和约1200bp的目的片段RBS1.0-dhaT，RBS0.6-dhaT，RBS0.3-dhaT，RBS0.07-dhaT；单酶切的条带大小约为3300 bp。这些工程菌分别带有质粒pSB1A2-RBS1.0-dhaT，pSB1A2-RBS0.6-dhaT，pSB1A2-RBS0.3-dhaT，pSB1A2-RBS0.07-dhaT。

提取质粒pSB1A2-RBS1.0-dhaT，pSB1A2-RBS0.6-dhaT，pSB1A2-RBS0.3-dhaT，pSB1A2-RBS0.07-dhaT，经XbaI/PstI双酶切，产生约1200 bp的插入基因片段。同时提取质粒psB1AK8-T7promoter经SpeI/PstI双酶切，产生约3500bp的前端载体片段，分别跑胶回收；连接上述的前端载体片段和目的基因插入片段，转化到DH5ɑ中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃过夜培养，次日挑单菌落，37℃LB液体培养基200r/min震荡培养14h，提取质粒进行EcoRI和PstI双酶切和EcoRI单酶切，跑胶验证，双酶切的条带分别为约3400bp的质粒骨架pSB1AK8和约1300 bp的目的片段T7-RBS1.0-dhaT，T7-RBS0.6-dhaT，T7-RBS0.3-dhaT，T7-RBS0.07-dhaT；单酶切的条带大小约为4700bp。这些工程菌分别带有质粒pSB1AK8-T7-RBS1.0-dhaT，pSB1AK8-T7-RBS0.6-dhaT，pSB1AK8-T7-RBS0.3-dhaT，pSB1AK8-T7-RBS0.07-dhaT。

提取pSB1AK8-T7-RBS1.0-dhaT，pSB1AK8-T7-RBS0.6-dhaT，pSB1AK8-T7-RBS0.3-dhaT，pSB1AK8-T7-RBS0.07-dhaT，经EcoR/SpeI双酶切，产生约1300bp的前端插入基因。同时提取质粒pSB1AK3-TT经EcoRI/XbaI双酶切，产生约3300 bp的后端载体片段，分别跑胶回收；连接上述的前端插入片段和后端载体片段，转化到DH5ɑ中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃过夜培养，次日挑单菌落，37℃ LB液体培养基200r/min震荡培养14h，提取质粒进行EcoRI和PstI双酶切和EcoRI单酶切，跑胶验证，双酶切的条带分别为约3200bp的质粒骨架pSB1AK3和约1400 bp的目的片段T7-RBS1.0-dhaT-TT，T7-RBS0.6-dhaT-TT，T7-RBS0.3-dhaT-TT，T7-RBS0.07-dhaT-TT；单酶切的条带大小约为4600bp。这些工程菌分别带有质粒pSB1AK3-T7-RBS1.0-dhaT-TT，pSB1AK3-T7-RBS0.6-dhaT-TT，pSB1AK3-T7-RBS0.3-dhaT-TT，pSB1AK3-T7-RBS0.07-dhaT-TT。

提取质粒pSB1AK3-T7-RBS1.0-dhaT-TT，pSB1AK3-T7-RBS0.6-dhaT-TT，pSB1AK3-T7-RBS0.3-dhaT-TT，pSB1AK3-T7-RBS0.07-dhaT-TT。经EcoR/PstI双酶切，产生约1400bp的插入片段。同时提取质粒pSB1A2-ccdb经EcoRI/PstI双酶切，产生约2000bp的载体片段，分别跑胶回收；连接上述的插入片段和载体片段，转化到BL21中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃过夜培养，次日挑单菌落，37℃LB液体培养基200r/min震荡培养14h，提取质粒进行EcoRI和PstI双酶切和EcoRI单酶切，跑胶验证，双酶切的条带分别为约2000bp的质粒骨架pSB1A2和约1400 bp的目的片段T7-RBS1.0-dhaT-TT，T7-RBS0.6-dhaT-TT，T7-RBS0.3-dhaT-TT，T7-RBS0.07-dhaT-TT；单酶切的条带大小约为3400bp。这些工程菌分别带有质粒pSB1A2-T7-RBS1.0-dhaT-TT，pSB1A2-T7-RBS0.6-dhaT-TT，pSB1A2-T7-RBS0.3-dhaT-TT，pSB1A2-T7-RBS0.07-dhaT-TT。

T7-RBS1.0-dhaT-TT序列

TAATACGACTCACTATAGGGAATACAAGCTACTTGTTCTTTTTGCAACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGGTGCCAAACGTTAACTTTTTTGGCCCCAACGCCATTTCCGTAGTCGGCGAACGCTGCCAGCTGCTGGGGGGGAAAAAAGCCCTGCTGGTCACCGACAAAGGCCTGCGGGCAATTAAAGATGGCGCGGTGGACAAAACCCTGCATTATCTGCGGGAGGCCGGGATCGAGGTGGCGATCTTTGACGGCGTCGAGCCGAACCCGAAAGACACCAACGTGCGCGACGGCCTCGCCGTGTTTCGCCGCGAACAGTGCGACATCATCGTCACCGTGGGCGGCGGCAGCCCGCACGATTGCGGCAAAGGCATCGGCATCGCCGCCACCCATGAGGGCGATCTGTACCAGTATGCCGGAATCGAGACCCTGACCAACCCGCTGCCGCCTATCGTCGCGGTCAATACCACCGCCGGCACCGCCAGCGAGGTCACCCGCCACTGCGTCCTGACCAACACCGAAACCAAAGTGAAGTTTGTGATCGTCAGCTGGCGCAACCTGCCGTCGGTCTCTATCAACGATCCGCTGCTGATGATCGGTAAACCGGCCGCCCTGACCGCGGCGACCGGGATGGATGCCCTGACCCACGCCGTAGAGGCCTATATCTCCAAAGACGCTAACCCGGTGACGGACGCCGCCGCCATGCAGGCGATCCGCCTCATCGCCCGCAACCTGCGCCAGGCCGTGGCCCTCGGCAGCAATCTGCAAGCGCGGGAATACATGGCCTACGCCTCTCTGCTGGCCGGGATGGCTTTCAATAACGCCAACCTCGGCTACGTGCACGCCATGGCGCACCAGCTGGGCGGCCTGTACGACATGCCGCACGGCGTGGCCAACGCTGTCCTGCTGCCGCATGTGGCGCGCTACAACCTGATCGCCAACCCGGAGAAATTCGCCGATATCGCTGAACTGATGGGCGAAAATATCACCGGACTGTCCACTCTCGACGCGGCGGAAAAAGCCATCGCCGCTATCACGCGTCTGTCGATGGATATCGGTATTCCGCAGCATCTGCGCGATCTGGGGGTAAAAGAGACCGACTTCCCCTACATGGCGGAGATGGCTCTGAAAGACGGCAATGCGTTCTCGAACCCGCGTAAAGGCAACGAGCAGGAGATTGCCGCGATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGTGTTATACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA

T7-RBS0.6-dhaT-TT序列

TAATACGACTCACTATAGGGAATACAAGCTACTTGTTCTTTTTGCAACTAGAGATTAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGGTGCCAAACGTTAACTTTTTTGGCCCCAACGCCATTTCCGTAGTCGGCGAACGCTGCCAGCTGCTGGGGGGGAAAAAAGCCCTGCTGGTCACCGACAAAGGCCTGCGGGCAATTAAAGATGGCGCGGTGGACAAAACCCTGCATTATCTGCGGGAGGCCGGGATCGAGGTGGCGATCTTTGACGGCGTCGAGCCGAACCCGAAAGACACCAACGTGCGCGACGGCCTCGCCGTGTTTCGCCGCGAACAGTGCGACATCATCGTCACCGTGGGCGGCGGCAGCCCGCACGATTGCGGCAAAGGCATCGGCATCGCCGCCACCCATGAGGGCGATCTGTACCAGTATGCCGGAATCGAGACCCTGACCAACCCGCTGCCGCCTATCGTCGCGGTCAATACCACCGCCGGCACCGCCAGCGAGGTCACCCGCCACTGCGTCCTGACCAACACCGAAACCAAAGTGAAGTTTGTGATCGTCAGCTGGCGCAACCTGCCGTCGGTCTCTATCAACGATCCGCTGCTGATGATCGGTAAACCGGCCGCCCTGACCGCGGCGACCGGGATGGATGCCCTGACCCACGCCGTAGAGGCCTATATCTCCAAAGACGCTAACCCGGTGACGGACGCCGCCGCCATGCAGGCGATCCGCCTCATCGCCCGCAACCTGCGCCAGGCCGTGGCCCTCGGCAGCAATCTGCAAGCGCGGGAATACATGGCCTACGCCTCTCTGCTGGCCGGGATGGCTTTCAATAACGCCAACCTCGGCTACGTGCACGCCATGGCGCACCAGCTGGGCGGCCTGTACGACATGCCGCACGGCGTGGCCAACGCTGTCCTGCTGCCGCATGTGGCGCGCTACAACCTGATCGCCAACCCGGAGAAATTCGCCGATATCGCTGAACTGATGGGCGAAAATATCACCGGACTGTCCACTCTCGACGCGGCGGAAAAAGCCATCGCCGCTATCACGCGTCTGTCGATGGATATCGGTATTCCGCAGCATCTGCGCGATCTGGGGGTAAAAGAGACCGACTTCCCCTACATGGCGGAGATGGCTCTGAAAGACGGCAATGCGTTCTCGAACCCGCGTAAAGGCAACGAGCAGGAGATTGCCGCGATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGTGTTATACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA

T7-RBS0.3-dhaT-TT序列

TAATACGACTCACTATAGGGAATACAAGCTACTTGTTCTTTTTGCAACTAGAGTCACACAGGAAAGTACTAGATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGGTGCCAAACGTTAACTTTTTTGGCCCCAACGCCATTTCCGTAGTCGGCGAACGCTGCCAGCTGCTGGGGGGGAAAAAAGCCCTGCTGGTCACCGACAAAGGCCTGCGGGCAATTAAAGATGGCGCGGTGGACAAAACCCTGCATTATCTGCGGGAGGCCGGGATCGAGGTGGCGATCTTTGACGGCGTCGAGCCGAACCCGAAAGACACCAACGTGCGCGACGGCCTCGCCGTGTTTCGCCGCGAACAGTGCGACATCATCGTCACCGTGGGCGGCGGCAGCCCGCACGATTGCGGCAAAGGCATCGGCATCGCCGCCACCCATGAGGGCGATCTGTACCAGTATGCCGGAATCGAGACCCTGACCAACCCGCTGCCGCCTATCGTCGCGGTCAATACCACCGCCGGCACCGCCAGCGAGGTCACCCGCCACTGCGTCCTGACCAACACCGAAACCAAAGTGAAGTTTGTGATCGTCAGCTGGCGCAACCTGCCGTCGGTCTCTATCAACGATCCGCTGCTGATGATCGGTAAACCGGCCGCCCTGACCGCGGCGACCGGGATGGATGCCCTGACCCACGCCGTAGAGGCCTATATCTCCAAAGACGCTAACCCGGTGACGGACGCCGCCGCCATGCAGGCGATCCGCCTCATCGCCCGCAACCTGCGCCAGGCCGTGGCCCTCGGCAGCAATCTGCAAGCGCGGGAATACATGGCCTACGCCTCTCTGCTGGCCGGGATGGCTTTCAATAACGCCAACCTCGGCTACGTGCACGCCATGGCGCACCAGCTGGGCGGCCTGTACGACATGCCGCACGGCGTGGCCAACGCTGTCCTGCTGCCGCATGTGGCGCGCTACAACCTGATCGCCAACCCGGAGAAATTCGCCGATATCGCTGAACTGATGGGCGAAAATATCACCGGACTGTCCACTCTCGACGCGGCGGAAAAAGCCATCGCCGCTATCACGCGTCTGTCGATGGATATCGGTATTCCGCAGCATCTGCGCGATCTGGGGGTAAAAGAGACCGACTTCCCCTACATGGCGGAGATGGCTCTGAAAGACGGCAATGCGTTCTCGAACCCGCGTAAAGGCAACGAGCAGGAGATTGCCGCGATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGTGTTATACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATATA

T7-RBS0.07-dhaT-TT序列

TAATACGACTCACTATAGGGAATACAAGCTACTTGTTCTTTTTGCAACTAGAGTCACACAGGAAACCTACTAGATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGGTGCCAAACGTTAACTTTTTTGGCCCCAACGCCATTTCCGTAGTCGGCGAACGCTGCCAGCTGCTGGGGGGGAAAAAAGCCCTGCTGGTCACCGACAAAGGCCTGCGGGCAATTAAAGATGGCGCGGTGGACAAAACCCTGCATTATCTGCGGGAGGCCGGGATCGAGGTGGCGATCTTTGACGGCGTCGAGCCGAACCCGAAAGACACCAACGTGCGCGACGGCCTCGCCGTGTTTCGCCGCGAACAGTGCGACATCATCGTCACCGTGGGCGGCGGCAGCCCGCACGATTGCGGCAAAGGCATCGGCATCGCCGCCACCCATGAGGGCGATCTGTACCAGTATGCCGGAATCGAGACCCTGACCAACCCGCTGCCGCCTATCGTCGCGGTCAATACCACCGCCGGCACCGCCAGCGAGGTCACCCGCCACTGCGTCCTGACCAACACCGAAACCAAAGTGAAGTTTGTGATCGTCAGCTGGCGCAACCTGCCGTCGGTCTCTATCAACGATCCGCTGCTGATGATCGGTAAACCGGCCGCCCTGACCGCGGCGACCGGGATGGATGCCCTGACCCACGCCGTAGAGGCCTATATCTCCAAAGACGCTAACCCGGTGACGGACGCCGCCGCCATGCAGGCGATCCGCCTCATCGCCCGCAACCTGCGCCAGGCCGTGGCCCTCGGCAGCAATCTGCAAGCGCGGGAATACATGGCCTACGCCTCTCTGCTGGCCGGGATGGCTTTCAATAACGCCAACCTCGGCTACGTGCACGCCATGGCGCACCAGCTGGGCGGCCTGTACGACATGCCGCACGGCGTGGCCAACGCTGTCCTGCTGCCGCATGTGGCGCGCTACAACCTGATCGCCAACCCGGAGAAATTCGCCGATATCGCTGAACTGATGGGCGAAAATATCACCGGACTGTCCACTCTCGACGCGGCGGAAAAAGCCATCGCCGCTATCACGCGTCTGTCGATGGATATCGGTATTCCGCAGCATCTGCGCGATCTGGGGGTAAAAGAGACCGACTTCCCCTACATGGCGGAGATGGCTCTGAAAGACGGCAATGCGTTCTCGAACCCGCGTAAAGGCAACGAGCAGGAGATTGCCGCGATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGTGTTATACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA

步骤三、组基因环路装置T7-RBS1.0-dhaB-TT-T7-RBS1.0-yqhD-TT-T7-RBS1.0-dhaT-TT构建

提取质粒pSB1A2-T7-RBS1.0-dhaT-TT，经EcoRI/XbaI双酶切，产生约3400bp的后端载体片段pSB1A2-T7-RBS1.0-dhaT-TT；同时提取质粒pSB1A2-T7-RBS1.0-yqD-TT，经EcoRI/SpeI双酶切，产生约2000bp的质粒骨架和约1400bp的前端插入片段T7-RBS1.0-yqD-TT，跑胶回收pSB1A2-T7-RBS1.0-dhaT-TT，T7-RBS1.0-yqhD-TT；连接上述的后端载体和前端插入片段，转化到BL21中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃过夜培养，第二天挑单菌落，37℃LB液体培养基200r/min培养14h，提取质粒进行EcoRI和PstI双酶切和EcoRI单酶切，跑胶验证，双酶切的条带分别为约2000 bp的质粒骨架pSB1A2和约2700 bp的目的片段T7-RBS1.0-yqhD-TT-T7-RBS1.0-dhaT-TT；单酶切的条带大小约为4700 bp。该工程菌带有质粒pSB1A2-T7-RBS1.0-yqhD-TT-T7-RBS1.0-dhaT-TT。

提取质粒pSB1A2-T7-RBS1.0-yqhD-TT-T7-RBS1.0-dhaT-TT，经EcoRI/XbaI双酶切，产生约4700bp的后端载体片段；同时提取质粒pSB1A2-T7-RBS1.0-dhaB-TT，经EcoRI/SpeI双酶切，产生约2000 bp的质粒骨架和约3000 bp的前端插入片段T7-RBS1.0-dhaB-TT，跑胶回收并连接上述的后端载体和前端插入片段，转化到BL21中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃过夜培养，次日挑单菌落，37℃LB液体培养基200r/min培养14h，提取质粒进行EcoRI和PstI双酶切和EcoRI单酶切，跑胶验证，双酶切的条带分别为约2000 bp的质粒骨架pSB1A2和约6000 bp的目的片段T7-RBS1.0-dhaB-TT-T7-RBS1.0-yqhD-TT-T7-RBS1.0-dhaT-TT；单酶切的条带大小约为8000 bp。该工程菌带有质粒pSB1A2-T7-RBS1.0-dhaB-TT-T7-RBS1.0-yqhD-TT-T7-RBS1.0-dhaT-TT。

步骤四、发酵培养

（1）发酵方式：5L机械搅拌发酵罐，通氮气分批发酵

（2）培养基：

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，0.1Mpa灭菌20min。。

发酵培养基(g/L)：甘油50，柠檬酸2，磷酸二氢钾7.5，七水硫酸镁2，酵母膏5，硫酸铵0.2，七水合硫酸亚铁0.005，氨水调pH值至6.8；再添加微量元素10mL/L。

微量元素溶液（/L）：ZnCl₂，0.07g；MnCl₂·4H₂O，0.1g；H₃BO₃，0.06g；CoCl₂·6H₂O，0.2g；CuCl₂·2H₂O，0.02g；NiCl₂·6H₂O，0.025g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.035g；HCl（37%），0.9ml。

（3）发酵过程：

发酵培养：将扩培的种子液以10%的接种量接种于装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，搅拌转速150rpm，在发酵过程中向发酵罐中通氮气来维持发酵体系的厌氧条件。

pH控制：用浓度为2mol/LNaOH溶液自动调节为6.8。

补料控制：根据分批发酵中甘油消耗与碱液消耗的比例关系，以甘油(折合后)：NaOH=72：8的比例（质量比）配制混合溶液，补料时用该混合溶液代替单纯的NaOH溶液，在调节pH的同时进行甘油流加，补料结束后换回单纯的NaOH溶液，继续消耗完发酵液中残余的甘油。

取样分析：每间隔1~3h取样，测定发酵液的菌体OD值，分析发酵液中甘油和1,3-丙二醇浓度。

（4）分析方法：

甘油和1,3-丙二醇的测定：采用HPLC分析。

色谱条件为：高效液相色谱Aminex-HPX-87H色谱柱，流动相为0.5mM的硫酸超纯水水溶液，流速为0.5ml/min，柱温30℃，示差折光检测器。

将发酵液12000rpm离心15min后取上清，稀释10倍后进样分析，测得各物质的出峰面积，通过各物质的峰面积与相应浓度的标准曲线进行浓度计算，乘上稀释倍数即得各物质在发酵液中的浓度。

甘油和1,3-丙二醇的标准曲线分别见图1和2。

（5）发酵结果：

从6h补料开始，发酵液中的甘油浓度一直维持在17g/L左右，1,3-丙二醇的浓度快速增加，11h左右菌体生长进入稳定期，15h时发酵结束，但此时补料还没结束，发酵液中仍然含有17.1g/L的残余甘油。发酵结束时1,3-丙二醇浓度为33.7g/L，转化率为0.56g/g，生产强度为2.25g/g/L。发酵动力学曲线见图3。

Claims

1.一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述克雷伯杆菌DSM2026购自德国菌种和细胞收集中心（DSMZ）。

3.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述PCR仪采用Biometra TProfessional PCR仪。

4.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述丁酸梭状芽孢杆菌VPI 1718购自弗吉尼亚理工大学；所述大肠杆菌BL21购买Takara公司。

5.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述种子培养基采用LB培养基。

6.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述培养的条件为37℃、150r/min摇床培养。

7.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述第1次接种的接种量为5％；所述再培养的条件可为37℃、150r/min摇床培养。

8.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述第2次接种的接种量为10％。

9.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述发酵的过程中向发酵罐中通氮气来维持体系的厌氧条件，并控制pH为6.8。

10.如权利要求1所述的一种1,3-丙二醇的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述发酵的过程中加入补料混合溶液，所述补料混合溶液由甘油和NaOH组成，按质量比甘油∶NaOH=72∶8；所述分析发酵液中甘油和1,3-丙二醇浓度的方法可采用美国安捷伦高效液相色谱Agilent 1100分析发酵液中甘油和1,3-丙二醇浓度。