CN103571772B

CN103571772B - 一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法

Info

Publication number: CN103571772B
Application number: CN201310466649.8A
Authority: CN
Inventors: 姜岷; 贺爱永; 尹春燕; 孔祥平; 陈佳楠; 马江锋; 韦萍
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2033-11-08
Also published as: CN103571772A

Abstract

本发明公开了一株新的产丁醇的贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌IT66（<i>Clostridium？beijerinckii</i>？IT66），保藏编号为CCTCC？M？NO：2011404。本发明还公开了上述贝氏梭菌在发酵生产丁醇中的应用。本产品采用恒化器连续培养、等离子诱变贝氏梭菌IB4，然后经刃冬青平板筛选出对抑制物耐受、还原力强的菌株，该菌株高耐受酸解副产物、高丁醇比、高溶剂产量；未脱毒的玉米芯酸解糖液为碳源时，在5L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了11.3g/L和9.1g/L，分别比同等条件培养的出发菌株提高了2.3倍和2.4倍，丁醇比高达80%，糖转化率为0.32，具有重大的社会意义和经济价值。

Description

一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株新的产丁醇的菌株及其生产丁醇的方法。

背景技术

随着石油资源加速枯竭和价格飞涨，发酵法生产丁醇又受到了广泛的重视，已经成为生物能源的研究热点之一。作为新一代的液体能源，丁醇正在被越来越多的国家重视，其具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。

丙酮丁醇梭菌和贝氏梭菌可直接有效利用玉米等淀粉物质或糖蜜等原料，且丁醇生产菌株对纤维水解液中的葡萄糖和木糖都有较高的利用效率。以纤维素原料生产丁醇具有优势，但纤维素原料处理过程中会产生一定量的酸类、醛类、木质素衍生物等副产物。水解液中含有乙酸、甲酸、醛类物质（糠醛和HMF）、酚类物质（阿魏酸、香豆酸、丁香醛、香草醛）等，这些物质通过破坏H+离子梯度、抑制发酵过程中酶的活性、破坏细胞膜的稳定性、改变渗透性等方式抑制丁醇发酵的正常进行。

近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、纤维原料糖液的制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。

Mermelstein等（BiotechnologyandBioengineering.1993,42:1053～1060）利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株ClostridiumnacetobutylicumATCC824提高了37%。NasibQureshi等（BiomassandBioenergy.2008,32:176-183）利用贝氏梭菌P260，在小麦秸秆中加入纤维素酶、木聚糖酶等进行同步糖化发酵，经过533小时的连续发酵，其溶剂的产率为0.41。Annous等（Appl.Environ.Microbiol.1991,57:2544-2548）利用化学诱变，得到了超级菌株BA101，单批发酵总溶剂最高可达25g/L以上；ThaddeusEzeji等（BioresourceTechnology.2008,99:5915-5922）利用突变株BA101，以XAD-4resin脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底物发酵，总溶剂产量为9.30g/L，但其不能利用未脱毒的酸解和酶解糖液发酵产丁醇。木质纤维原料经稀酸处理后，会产生有机酸、糠醛、酚类等抑制物，这些抑制物的除去成本较高、并对微生物生长有一定的抑制作用；Guo等（JIndMicrobiolBiotechnol,2012,99(3),401-407.）利用离子束诱变，得到了一株能利用未脱毒玉米芯酸解糖液的丁醇生产菌株ClostridiumbeijerinckiiIB4（本专利的出发菌株），利用毒素总酚约为1.4g/L的水解液得到产丁醇和总溶剂分别为6.8g/L和9.5g/L。。

可见，木质纤维原料中的毒素抑制物严重抑制产丁醇梭菌的发酵性能；而菌种改良是提高菌株对抑制物的耐受性、发酵经济性的关键手段之一。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株新的产丁醇的菌株。

本发明的第二个目的是提供一种上述菌株生产丁醇的方法。

一、为实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下：

一株新的产丁醇的菌株，其分类命名为贝氏梭菌IT66（ClostridiumbeijerinckiiIT66），已于2011年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCMNO：2011404。

上述贝氏梭菌IT66的获取方法，是以贝氏梭菌IB4为出发菌株经恒化器连续培养装置，等离子诱变，再利用含有酚类等抑制物的刃天青平板筛选得到对抑制物耐受性高、还原力强的菌株，最后以未脱毒的玉米芯酸解糖液（本发明人团队文章发表，JIndMicrobiolBiotechnol,2012,99(3),401-407.）为底物，经厌氧发酵筛选获得高耐受纤维酸解副产物、高产溶剂的贝氏梭菌目标菌株。

具体地说，所述贝氏梭菌IT66的获取方法包括如下步骤：

a）连续培养驯化诱变：将贝氏梭菌原始菌株IB4活化培养，33～37℃培养，在25mL的厌氧瓶装液量为10～15mL，培养时间12～18h，取对数生长期的菌液，接入含有新鲜培养基的自制连续培养装置中连续培养，接种量为5%～15%（v/v）。以纤维酸解副产物为限制因子加TPC培养450～600h，初步筛选到耐纤维酸解副产物的贝氏梭菌菌株；

b）等离子体诱变：将恒化器连续培养装置（本发明人团队在先专利申请，专利申请公开号CN101709263A）中驯化筛选得到的菌液活化培养，培养温度33～37℃，25mL的肖特厌氧瓶装液量为10～15mL，培养时间12～16h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD600=0.1～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，对菌株进行等离子体诱变；

c）刃天青平板初筛：将等离子体诱变得到的菌液稀释至OD600=0.1～1.0涂布于含刃天青（0.002%）的玉米芯酸解糖液(总还原糖4.0%)平板上培养基平板上，33～37℃厌氧培养12～36h，挑选出10～50株单菌落；

d）玉米芯酸解糖液平板复筛：将步骤c）筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶装液量10～15mL，充氮气3min，33～37℃厌氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD=0.1的菌悬液，吸取2uL点滴到含抑制物和刃天青（0.002%）的玉米芯酸解糖液平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～30h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落；

e）厌氧瓶发酵筛选：将步骤d）筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33～37℃，厌氧培养培养时间10～16h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5%～15%（v/v），充氮气3min，发酵温度33～37℃，厌氧发酵发酵时间60～80h；考察筛选出的菌落发酵产丁醇和总溶剂的产量，同时选出丁醇和总溶剂产量高的菌株。

在上述筛选方法中：所述步骤a）中所述的连续培养驯化方法中，TPC1.4～2.1g/L。

所述步骤b）中射频功率为80～120W，气体流量10～30SLM，辐照时间；10～1800s，优选180S。

所述步骤c）和d）中采用常规固体培养基，碳源为葡萄糖、淀粉和木质纤维酸解糖液中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。

所述步骤e）中所采用的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、淀粉、木质纤维酸解糖液中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。

二、一种利用贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法，其包括如下步骤：

1)平板培养

将贝氏梭菌IT66接种至平板培养基，33~37℃下厌氧培养12~24小时；

2）种子培养

将步骤１）平板培养的菌株氏梭菌IT66接种至种子培养基中，在33~37℃下厌氧培养12~24小时；

3)发酵生产丁醇

将步骤2）培养后的菌株氏梭菌IT66接种到发酵培养基中，接种量5~15%，充氮气保证厌氧条件，在33~37℃，发酵培养60~80小时。

在利用菌株贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法中，所述平板培养的培养基配方：碳源0.5%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、其余为水；其中，所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。

所述种子培养的培养基配方：碳源0.5%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、其余为水；其中，所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。

所述发酵培养的培养基配方：碳源3%～6%、氮源0.1%～0.3%、无机盐0.1%～0.2%、生长因子0.05～0.1%、其余为水；其中，所述的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木质纤维酸解糖液和木质纤维酶解糖液中的一种或多种；所述的氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。

作为本发明贝氏梭菌IT66生产丁醇的一个优选实施方式，所述平板培养基配方：平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂粉1.5%，其余为水，pH6。

所述的种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH6。所述的发酵培养基：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，用未脱毒的玉米芯酸解糖液（总还原糖为3.5%）配置，其余为水，pH6.6。

本发明有益效果：

本发明采用恒化器连续培养装置连续培养驯化后由等离子体诱变，再利用含未脱毒的玉米芯酸解糖液的刃天青平板筛选出对纤维酸解糖液中的酚类等抑制物具有较强的耐受性、并能直接利用木质纤维酸解糖液发酵生产丁醇，高耐受纤维酸解副产物、高丁醇比和溶剂产量高的菌株。利用本发明的菌株和工艺进行发酵，以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在5L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了11.3g/L和9.1g/L，分别比同等条件培养的出发菌株提高了2.3倍和2.4倍，丁醇比高达80%，糖转化率为0.32；同时该菌株对TPC的耐受性从1.4g/L提高到1.9g/L，具有重大的社会意义和经济价值。

附图说明

图1为贝氏梭菌连续培养驯化筛选的重要参数曲线；

其中，DilutionRate是指稀释比例；

图2为贝氏梭菌的等离子体诱变存活率曲线；

其中，SurvivalRate是指存活率；Times指时间。

本发明所述的生物材料，其分类命名为贝氏梭菌IT66（ClostridiumbeijerinckiiIT66），已于2011年11月21号保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址是：中国.武汉.武汉大学），保藏编号：CCTCCNO：M2011404。

具体实施方式

下面列举实施例对本发明进行进一步说明，但并不因此限制本发明的内容。

实施例1：本实施例说明将贝氏梭菌原始菌株IB4作为出发菌株诱变筛选贝氏梭菌IT66的方法。

出发菌株来源：本申请人发明人团队在先文献公开的菌株，Guo等（JIndMicrobiolBiotechnol,2011,99(3),401-407.）。本申请人在此声明，保证从本申请日起20年内免费对公众发放本出发菌株的生物材料。

本实施例中所使用的培养基配方（%为质量百分比）：

（1）固体平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂1.5%，其余为水，pH6。

（2）刃天青平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂1.5%，刃天青0.002%，加入1/2(v/v)的未脱毒玉米芯酸解糖液，其余为水，pH6。

（3）玉米芯酸解糖液平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂1.5%，刃天青0.002%，用未脱毒玉米芯酸解糖液配置，其余为水，pH6。

（4）发酵筛选培养基：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，未脱毒玉米芯酸解糖液（总还原糖3.5%），其余为水，pH6.6。

获取贝氏梭菌IT66的具体步骤如下：

a）连续培养驯化诱变：将贝氏梭菌原始菌株IB4活化培养，37℃培养，在25mL的厌氧瓶装液量为15mL，培养时间12h，取对数生长期的菌液，接入含有新鲜培养基的自制恒化器连续培养装置中连续培养，接种量为8%（v/v）。以纤维酸解副产物为限制因子加TPC1.8g/L培养500h，初步筛选到耐纤维酸解副产物的贝氏梭菌菌株；结果如图1所示。

b）等离子体诱变：将恒化器连续培养装置（本发明人团队在先专利申请，专利申请公开号CN101709263A，专利名称一种恒化器连续培养装置名称及其筛选琥珀酸突变菌的方法”）中驯化筛选得到的菌液活化培养，培养温度37℃，25mL的肖特厌氧瓶装液量为10mL，培养时间12h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD600=0.4，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，射频功率为90W，气体流量10SLM，辐照时间100s，对菌株进行等离子体诱变；结果如图2所示。

c）刃天青平板初筛：

用生理盐水洗出经离子束诱变的菌株，稀释成不同浓度涂布于含有酚类抑制物(0.02%)和刃天青（0.002%）的常规固体培养基平板上，在35℃温度下厌氧培养30h，挑选可以在筛选平板上生长、菌落较大、且变色圈明显较大的菌落30株。

d）玉米芯酸解糖液平板复筛：

将筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶装液15mL，充氮气3min，35℃厌氧培养14h，无菌生理盐水制成浓度OD=0.1的菌悬液，吸取2uL点滴到含有酚类抑制物(0.15%)和刃天青（0.002%）的玉米芯酸解糖液平板上，在35℃温度下厌氧培养20h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落。

最终菌株IT3、IT4、IT66和IT111显示了较强的抑制物耐受性和还原活力。

e）厌氧瓶发酵筛选：

将菌株IT3、IT41、IT66和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度35℃，250mL的肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养时间12h。然后在以发酵培养基中发酵，接种量10%（v/v），发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量60mL，充氮气3min，发酵时间72h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示：

表1筛选培养基中IB4、IB9和原始菌发酵结果

经过平板组合筛选获得的突变株在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量均明显高于出发菌株，其中IT66具有最高的总溶剂产量、糖转化率也最高。这与组合平板筛选的结果一致。

实施例1的贝氏梭菌IT66的遗传稳定性测试

在以玉米芯酸解糖液为碳源的发酵培养基中，检测突变株IT66的传代稳定性。菌株IT66传代发酵试验结果如表2所示：

表2菌株IT66传代发酵试验结果

从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的总溶剂产量和丁醇产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例2：本实施例说明贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法

本实施例所用的培养基配方：

平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂粉1.5%，其余为水，pH6。

种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH6。

发酵培养基：未脱毒玉米芯酸解糖液3%；乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH6.6。

平板培养

将实施例1获取的贝氏梭菌IT66接种至平板培养基厌氧培养，在35℃下，培养时间12h。

种子培养

将步骤1）平板培养的IT66接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，在35℃下，培养时间12h。

3）发酵培养

将步骤2）种子培养的IT66接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量60mL，充氮气3min，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了9.6g/L和7.8g/L，与同等条件培养的出发菌株基本相当，而丁醇比提高了17.7%。

实施例3：本实施例说明贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法

本实施例所用的培养基配方：

发酵培养基：未脱毒玉米芯酸解糖液3.5%；乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH6.6。

1)平板培养

将实施例1获取的贝氏梭菌IT66接种至平板培养基厌氧培养，在35℃下培养时间12h。

2)种子培养

将步骤1）平板培养的IT66接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h。

3）发酵培养

将步骤2）种子培养的IT66接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量60mL，充氮气3min，发酵培养12h，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.5g/L和8.5g/L，比同等条件培养的出发菌株提高了2.1倍和2.3倍。

实施例4：本实施例说明贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法

本实施例所用的培养基配方：

发酵培养基：未脱毒玉米芯酸解糖液4.0%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH6.6。

1）平板培养

将实施例2获得的贝氏梭菌IT66接种至平板培养基厌氧培养，在35℃下，培养时间12h。

2）种子培养

将步骤1）平板培养的IT66接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量150mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h。

3）发酵培养

将步骤2）种子培养的IT66接种到装有1L发酵培养基的2L发酵罐中，接种量10%（v/v），发酵温度35℃，连续通入氮气，流速为0.3L/min，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了7.6g/L和5.2g/L，同等条件培养的出发菌株由于毒素浓度过高的缘故基本不生长。

实施例5：本实施例说明贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法

本实施例所用的培养基配方：

发酵培养基：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，用未脱毒的玉米芯酸解糖液（总还原糖为3.5%）配置，其余为水，pH6.6。

平板培养

将实施例1所获的贝氏梭菌IT66接种至平板培养基厌氧培养，在35℃下，培养12h后。

种子培养

将步骤1）平板培养的贝氏梭菌IT66用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养12h。

发酵培养

将步骤2）种子培养的贝氏梭菌IT66用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为72h。检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了11.3g/L和9.1g/L，是同等条件培养的出发菌株的2.3倍和2.4倍,丁醇比高达80%，糖转化率达到0.32。

实施例6：本实施例说明贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。采用补料分批发酵的方式，即先加入总还原糖1%的未脱毒的玉米芯酸解糖液，16h后一次性补入剩余的2.5%的未脱毒的玉米芯酸解糖液，其余条件同实施例5。贝氏梭菌C.beijerinckiiIT66接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N₂，通气量为0.25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为72h。检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了12.5g/L和9.5g/L，是同等条件培养的出发菌株的2.6倍和2.8倍，丁醇比达到76%，糖转化率达到0.35。

Claims

1.一株产丁醇菌株，其分类命名为贝氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）IT66，保藏编号：CCTCCMNO：2011404。

2.一种利用权利要求1中所述的产丁醇菌株贝氏梭菌IT66生产丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)平板培养

2）种子培养

将步骤１）平板培养的贝氏梭菌IT66接种至种子培养基中，在33~37℃下厌氧培养12~24小时；

3)发酵生产丁醇

将步骤2）培养后的菌株贝氏梭菌IT66接种到发酵培养基中，接种量5~15%，充氮气保证厌氧条件，在33~37℃，发酵培养60~80小时。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的平板培养的培养基配方：碳源0.3%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、琼脂1.5%～2%、其余为水；其中，所述的碳源为葡萄糖、淀粉和未脱毒木质纤维酸解糖液中的任意一种或多种；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的任意一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的平板培养基配方：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂粉1.5%，其余为水，pH6。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的种子培养基配方：碳源0.5%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、其余为水；其中，所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH6。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基配方：碳源3%～6%、氮源0.1%～0.3%、无机盐0.1%～0.2%、生长因子0.05～0.1%、其余为水；其中，所述的碳源为未脱毒的木质纤维素酸解糖液，所述的氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基配方：乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，七水合硫酸镁0.02%，一水合硫酸锰0.001%，七水合硫酸亚铁0.001%，氯化钠0.001%，玉米浆0.1%，总还原糖为3～4%的未脱毒的玉米芯酸解糖液，其余为水，pH6.6。