CN105586365B

CN105586365B - 一种发酵生产混合醇的方法

Info

Publication number: CN105586365B
Application number: CN201510875864.2A
Authority: CN
Inventors: 董维亮; 姜岷; 赵洁; 孔祥平; 王超; 贺爱永; 马江锋; 吴昊
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2035-12-02
Also published as: CN105586365A

Abstract

本发明公开了一种发酵生产混合醇的方法。本发明通过调控胞内还原性辅因子（NADPH/NADH）供给水平实现异丙醇、丁醇和乙醇的高效联产。由于异丙醇的合成，菌体在产醇期还原力需求增大，尤其是NADPH，造成胞内还原力供给失衡，在进行厌氧发酵时，总醇产量仅3.88g/L，细胞生长较差，最高细胞量OD₆₀₀值达到4.19。通过在发酵培养基中添加2g/L氯化钙，促进NADH向NADPH转化，恢复了细胞生长和混合醇的合成，混合醇产量有较大的提高。通过在发酵培养基中添加10g/L的碳酸钙，不仅改善了发酵培养基的pH同时有利于产醇的进行，加强了异丙醇通路的NADPH供给，提高了混合醇的总产量。利用本发明发酵生产混合醇的方法，能提高混合醇的生产强度及产量。

Description

一种发酵生产混合醇的方法

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程复合技术领域，具体涉及一种生物法发酵生产混合醇的方法。

背景技术

随着化石能源日近枯竭，通过微生物利用可再生资源来生产燃料备受关注。生物法制备燃料丁醇是利用产丁醇梭菌(丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等)在严格厌氧条件下进行的，其主要产物是丁醇、丙酮和乙醇，它们的比例通常是6∶3∶1，简称ABE发酵。使用传统的ABE发酵，丁醇在总溶剂中一般只占60％，比例偏低，对后期丁醇回收、分离的成本形成巨大的挑战。研究发现拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593和NESTE 255具有次级醇脱氢酶基因(sadh)可以合成大约100mM的异丙醇。异丙醇作为一种重要的有机化工原料和有机溶剂，在农药、医药、电子、日用化学等领域具有广泛的用途，同时也可作为一种性能优越的燃料。将ABE发酵产物中的丙酮转化为异丙醇从而能够实现混合醇联产(IBE发酵)，可有效降低分离过程的成本，提高生物燃料的市场竞争力。

目前，SimonDusséaux等人在敲除了丁酸激酶基因的ATCC 824(已表达外源sadh基因)中实现了混合醇的生产，但该菌株在最优条件下仍然不能将丙酮完全转化成异丙醇。(SimonDusséaux.etal.,Metabolic engineeringof Clostridium acetobutylicum ATCC824for the high-yield productionofa biofuelcomposed ofan isopropanol/butanol/ethanol mixture.Metab.Eng.2013,18,1-8.)。Florent Collas等在Clostridiumacetobutylicum ATCC 824中表达异丙醇合成基因，并且共表达了adc、ctf A/B基因进一步地强化了异丙醇通路，发酵后仍能检测到最高有0.9g/L的丙酮存在(Collas et al.,Simultaneous production of isopropanol,butanol,ethanol and 2,3-butanediol byClostridium acetobutylicum ATCC 824engineered strains.AMB Express 2012,2:45)。

发明内容

本发明是针对现有混合醇生产菌株生长及产醇能力低的问题，提供了一种高效发酵生产混合醇的方法。利用该方法进行厌氧发酵，可以提高混合醇产量和生产能力，并实现丙酮至异丙醇的完全转化。

为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

一、构建重组菌株：以实验室自主筛选获得的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)XY16(保藏号为CCTCC NO：M 2010011)为出发菌株，表达外源次级醇脱氢酶后，得到能够发酵生产混合醇的重组菌株Clostridium acetobutylicum XY16(pSADH)。

进一步地，所述具体步骤如下：

(1)构建次级醇脱氢酶基因的表达载体pIMP1-ptb-sadh；

(2)将步骤(1)得到的穿梭载体pIMP1-ptb-sadh采用电转化方法导入到丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum XY16中，获得sadh基因表达的重组菌株Clostridiumacetobutylicum XY16(pSADH)。

二、生产混合醇：在发酵培养基中加入钙离子来提高菌株胞内产醇期的还原力供给，进而增加混合醇的产量。

进一步地，其步骤如下：

方法一、在发酵培养基中加入不同浓度的氯化钙。钙离子是NADK的诱导剂，能促进NAD⁺向NADP⁺转化，NADP⁺进而转化为NADPH。增强了辅酶NADPH的供给，异丙醇的合成途径是需要依赖于还原力NADPH，进而可恢复细胞生长，同时能提高异丙醇的产量。

方法二、在发酵培养基中加入不同浓度的碳酸钙。碳酸钙一方面可以提供增强还原力提高的金属离子钙离子；另一方面碳酸根可以在培养基中起到缓冲作用，中和发酵过程中产生的有机酸，调节发酵液的pH，更有利于异丙醇、混合醇产量的提高。

本发明的有益效果：本发明的一种高效发酵生产混合醇的方法有完全转化丙酮至异丙醇的特点，并且本发明首次发现了NADPH在异丙醇制备过程中的重要性。还原力NADH、NADPH作为电子载体参与了胞内的生物合成以及能量转换过程。调控胞内还原力供给可以有效地提高微生物的代谢性能，胞内的NAD(P)H/NAD(P)⁺比值代表了菌体所处环境的氧化还原态势，因此可以通过调节发酵体系中的氧化还原状态来调控菌体细胞内还原力的平衡，进而调节菌体的生长及代谢能力。NADH的产生是通过糖酵解由NAD⁺转化实现的，其消耗主要用于产物的合成。NADPH则是首先是在NADK的作用下由NAD⁺转化为NADP⁺，进而转化为NADPH。还原力在丙酮丁醇梭菌的代谢过程中有至关重要的作用。

本发明通过提高混合醇生产菌株在产醇期的还原力的供给，使菌株胞内NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺的比例在产醇期呈现上升趋势。而混合醇的合成是需要消耗大量的还原力，调控后增加的还原力供给能提高混合醇的产量。当加入2g/L的氯化钙时，钙离子能够促进NAD⁺向NADP⁺的转化，增强了异丙醇通路的NADPH的供给，发酵培养72h后检测到丁醇产量为3.35g/L，异丙醇的产量达到1.71g/L，混合醇总产量是6.04g/L。当加入10g/L的碳酸钙时，在碳酸根的缓冲作用下，钙离子的存在更激活了NAD⁺向NADP⁺的转化，发酵培养72h后检测到丁醇产量为10.43g/L，异丙醇的产量为6.06g/L，混合醇总产量达到17.77g/L。

附图说明

图1是出发菌株上罐发酵结果。

图2是重组菌株上罐发酵结果。

图3是重组菌株生产混合醇的代谢流程图。

图4是NADH、NADPH的合成代谢与分解代谢途径。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

本实施例说明丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16(pSADH)重组菌株的构建方法。

1.表达载体pIMP1-ptb-sadh的构建

用NdeⅠ单酶切载体pIMP1-ptb，酶切线性化产物经纯化试剂盒(Takara)化后，sadh(GenBank数据库中的登录号是AF157307.2的从2351到3406之间的1056bp序列)通过一步克隆连接(ClonExpress)。将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli DH5a(本实验室)，涂布到含有100ug/ml氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有100ug/ml氨苄霉素LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒(AXYGEN)，经测序验证获得能够利用ptb启动子表达sadh的载体pIMP1-ptb-sadh。

2.甲基化表达载体pIMP1-ptb-sadh

利用CaCl₂法制备E.coli Top 10/pAN2(本实验室)感受态，将表达载体pIMP1-ptb-sadh利用热激法转化到大肠杆菌(E.coli)Top 10，由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂布到含有100ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素双抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取阳性转化子，接到液体含有100ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素的LB培养基中，37℃、200rpm、培养12h，提取甲基化缺失载体pIMP1-ptb-sadh(pAN2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)。

3.电转化甲基化的载体pIMP1-ptb-sadh至丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)

XY16。

1)在电转化的前一天晚上，把培养基和EPB放在厌氧箱里，也可将培养基和EPB用无菌氮气排氧。另外，要提前一天将电转杯放在-20℃冷冻。

2)将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16接种至CGM培养基(酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％)37℃培养12h，以5％比例接种到CGM培养基，37℃培养6-8h，接10mL菌液到60mL的2×YTG中，(酵母粉16g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L)，37℃培养至OD600＝1.1。

3)分别取15mL菌液到4个50mL的离心管中，4℃离心10分钟，弃上清液。分别用2.5mL的EPB(270mM蔗糖，5mM NaH₂PO₄，pH7.4)悬浮沉淀，悬浮后再放到冰上，拿出厌氧箱，4℃离心10分钟，弃上清液。用5mL的EPB悬浮四个管子里沉淀，将上述悬浮好的菌液收集到一个管子里，悬浮后再放到冰上，拿出厌氧箱，4℃离心10分钟。

4)最后用2.3mL的EPB悬浮沉淀，悬浮后放在冰上。这些细胞要做电转，所以要一直放在冰上，尽快使用，加2ug的已经甲基化的质粒到每一个0.4cm已经冷冻了的电转杯里。

5)使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压2.0kV，电阻200Ω，电容25uF，电击后立刻加入1mL 37℃预热的2×YTG培养基，转移到无菌离心管中，在37℃厌氧培养箱复苏4-6h。

6)取200ul上述菌液，涂布到含有10ug/ml红霉素的CGM固体平板，37℃厌氧培养2-3天。

4.筛选sadh基因表达的重组菌株

挑取平板上长出的转化子，使用红霉素引物对转化子进行菌落PCR验证，筛选出阳性转化子。得到重组菌株。

实施例2：

本实例说明出发菌株厌氧发酵60h生产ABE的能力考察(利用发酵罐进行发酵，转速120rpm，通氮气)。

种子培养基为：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％。

P2发酵培养基：葡萄糖6％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％。

5L发酵罐培养时培养基装液量为2L。将冻存的甘油管中的菌种接入到50mL血清瓶中20mL的种子培养基中，通入氮气，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12h后，用无菌移液枪将活化的菌种按5％的比例接种到含有200mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10％(v/v)，搅拌转速在120rpm，37℃发酵培养。接种后通入氮气，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境，发酵时间为60h。

发酵结果如图1所示：发酵培养60h后检测到得丁醇产量为10.05g/L，丙酮产量为6.51g/L，ABE总溶剂达到17.56g/L。发酵过程证明该出发菌株在P2发酵培养基中有较强的丁醇及ABE生产能力。

实施例3：

本实例说明重组菌株厌氧发酵60h生产混合醇的能力考察(利用发酵罐进行发酵，转速120rpm，通氮气)。

种子培养基为：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，红霉素10ug/mL。

P2发酵培养基：葡萄糖6％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，红霉素10ug/mL。

发酵结果如图2所示：发酵培养60h后检测到丁醇产量为2.13g/L，异丙醇产量为1.13g/L，IBE混合醇总产量仅为3.88g/L。由于检测不到发酵液中丙酮的残留可以说明丙酮可以通过次级醇脱氢酶完全转化为异丙醇。发酵过程证明该重组菌株在P2发酵培养基中可以产混合醇，但是产量不高，糖耗速率差，最高生长OD仅达到4.19，其生长及产醇能力相比出发菌株均大幅下降，但发酵液中未检测到丙酮的存在，说明该重组菌能够完全转化丙酮为异丙醇。

实施例4：

本实例说明重组菌株发酵过程中，在发酵培养基中加入不同浓度氯化钙生产混合醇的能力。钙离子可以增强NADK的活性，提供更多的NADPH用于合成异丙醇，进一步地可以提高混合醇的产量。

将菌种接种至CGM培养基(酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，红霉素10ug/mL)。50mL血清瓶中装液量20mL，通入氮气，37℃培养12h。然后接种到P2发酵培养基(葡萄糖6％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，红霉素10ug/mL)，接种量10％(v/v)，发酵温度37℃，100mL血清瓶中装液量50mL，发酵时间72h后检测其各产物产量如表1所示：

表1不同浓度的氯化钙条件下血清瓶发酵结果对比

由表1中的实验结果可看出，发酵产物中检测不到丙酮的残留，说明sadh基因的表达可以将丙酮完全转化为异丙醇。在一定的范围(0-2g/L)内，各溶剂的产量随着氯化钙的浓度的增加而增加。由于氯化钙可以作为渗压剂，大于4g/L就会对菌体产生毒性，抑制其生长。因而当控制在2g/L时，菌体生长速率及总溶剂得率达到最大，丁醇及混合醇产量也达到最高，相较于对照分别提高到1.57倍和1.51倍。

表2不同氯化钙浓度下NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺比例的比较

氯化钙浓度(g/L)	NADH/NAD<sup>+</sup>	NADPH/NADP<sup>+</sup>
			0	0.99	0.29
0.5	1.02	0.31
			2	1.25	0.36
4	0.78	0.22
			6	0.66	0.16

由表2可看出，在不加钙离子条件下进行摇瓶发酵，产醇期NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺的比例均处于较低水平。当逐渐增加钙离子浓度，随着混合醇产量的提高，NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺的比例也逐渐上升，在添加氯化钙2g/L下，分别提高到原来的1.26倍和1.24倍。当氯化钙添加量大于2g/L时，NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺的比例均有所下降。

实施例5：

本实例说明在发酵培养基中加入不同浓度碳酸钙。碳酸钙的作用在于一方面可以提供钙离子，增强NADK的活性，提供更多的NADPH用于合成异丙醇；另一方面由于碳酸根可以中和发酵过程中产生的有机酸，调节发酵液的pH，因此可以进一步地提高混合醇的总产量。

将菌种接种至CGM培养基(酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，红霉素10ug/mL)。50mL血清瓶中装液量20mL，通入氮气，37℃培养12h。然后接种到P2发酵培养基(葡萄糖6％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，红霉素10ug/mL)，接种量10％(v/v)，发酵温度37℃，100mL血清瓶中装液量50mL，发酵时间72h后检测其各产物产量如表3所示：

表3不同浓度的碳酸钙条件下血清瓶发酵结果对比

由表3中的实验结果可看出，发酵产物中检测不到丙酮的残留，说明sadh基因的表达可以将丙酮完全转化为异丙醇。在发酵培养基中加入不同浓度的碳酸钙，发酵结果不一致。其特点如下：在发酵培养基中加入碳酸钙能提高混合醇的总产量，并且随着碳酸钙浓度的增加而增加。当碳酸钙的浓度达到10g/L时，混合醇的总产量能达到17.77g/L。

表4不同碳酸钙浓度下NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺比例的比较

由表4可看出，NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺的比例变化也是随着菌体的生长及发酵呈现正相关性。在最优碳酸钙浓度(10g/L)下，NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺比不加碳酸钙时分别提高到2.23及2.00倍。通过加入比氯化钙更有优势的碳酸钙，更加增强了还原力的转化过程，使得产醇能力提高。

Claims

1.一种发酵生产混合醇的方法，其特征在于：所述方法分两步进行，具体如下：

第一步构建重组菌株：选用保藏号为CCTCC NO：M2010011的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）XY16为出发菌株，将表达载体pIMP1-ptb-sadh导入到出发菌株中，获得表达sadh基因的重组菌株；所述表达载体pIMP1-ptb-sadh的构建方法具体如下：用NdeⅠ单酶切载体pIMP1-ptb，酶切线性化产物经纯化试剂盒纯化后，sadh通过一步克隆连接；将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌（E.coli）DH5a，涂布到含有100ug/ml氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有100ug/ml氨苄霉素LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒，经测序验证获得能够利用ptb启动子表达sadh的载体pIMP1-ptb-sadh；

所述表达载体pIMP1-ptb-sadh采用电转化方式导入到出发菌株中；所用电转化缓冲液配制采用270mM蔗糖，5mM NaH₂PO₄，缓冲液pH=7.4；电转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25uF；

第二步生产混合醇：将重组菌株接入种子培养基中，通入氮气培养，在发酵培养基中加入氯化钙或碳酸钙进行厌氧发酵；

所述重组菌株厌氧发酵的发酵温度为37℃；发酵时间为72h；所述氯化钙浓度为2g/L；所述碳酸钙浓度为10g/L。

2.根据权利要求1所述发酵生产混合醇的方法，其特征在于：所述种子培养基配制如下：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%。

3.根据权利要求1所述发酵生产混合醇的方法，其特征在于：所述重组菌株厌氧发酵过程中，每1L发酵液采用的发酵培养基按照如下方法制备：葡萄糖6%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，碳酸钙1%（或氯化钙0.2%），红霉素10ug/mL。