CN103820367B - 一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产丁醇的基因工程菌株，它是在拜氏梭菌中插入失活编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110，从而得到基因Cbei_4110失活的重组菌株。本发明还公开了上述基因工程菌株的构建方法和应用。本发明的基因工程菌株，以葡萄糖为碳源时，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了12.7g/L和9.9g/L，分别比出发菌提高了17.5%和25.3%，丁醇比高达78%，糖转化率高达0.42，利用本发明方法构建的重组菌株，能提高丁醇产量和糖转化效率，降低生产成本。

Description

一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

丁醇已广泛应用于化工、塑料、油漆等工业领域。丁醇具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点；作为新型的可再生生物能源，丁醇有着广阔的发展前景。随着化石能源日近枯竭，生物法制备丁醇受到越来越多的关注。生物法制备丁醇一般是利用产丁醇梭菌（丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等）在严格厌氧条件下进行的，其主要产物是丁醇、丙酮和乙醇，简称ABE发酵。传统的ABE发酵包括产酸期和产溶剂期，丁醇、丙酮和乙醇的比例约为6:3:1。在产酸期，细胞通过乙酸和丁酸的偶联会通过一系列的质子传递体,将两个还原H形成一个H₂释放出菌体。在产溶剂期，产生的乙酸和丁酸在此阶段被转变为溶剂（丙酮、丁醇和乙醇），释放大量CO₂和少量H₂；导致底物的转化利用率仅在35%左右。因此，提高底物转化率和丁醇比例是生物丁醇研究的热点之一。

中国专利ZL95111733.5报道，上海植物生理研究所通过化学诱变的方法得到一株高产丁醇的菌株C.acetobutylicum EA2018，最终发酵产溶剂比为B:A:E=7:2:1，得率在0.35-0.38之间。美国专利US2005/0089979A1报道了利用gas-stripping和连续发酵耦合来生产丙酮丁醇，在1L发酵罐中，以葡萄糖为底物，丁醇比停留在60-70%之间；Mutschlechner等利用拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B592，通过两阶段调控的方法连续发酵产溶剂，在稳定期丁醇比例的平均值为61%，溶剂产率平均值为0.25。

NADH-辅酶Q氧化还原酶是拜氏梭菌专属的一种位于细胞膜上的质子传递体,作用是以辅酶Q作为质子受体，脱下NADH上一个H,氢气的溢出是菌体维持其内部氧化还原电势稳定的一种方式，然而这种方式造成了还原力的极大浪费，是ABE发酵得率不高的原因之一。可见，利用二型内含子技术阻断位于细胞膜上的还原氢的传递，降低H₂的溢出，提高还原力的利用效率，进而提高丁醇产量，是提高ABE发酵经济性的手段之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产丁醇的基因工程菌株。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌株的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌株的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种高产丁醇的基因工程菌，它是在拜氏梭菌中插入失活编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110从而得到重组菌株。

本发明通过在菌种中失活NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110，以提高丁醇产量。所述菌株可以是所有能够发酵产丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌野生菌，或者经过诱变和基因工程改造后能出产生丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)IB4等。

其中，所述的拜氏梭菌优选为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB8052。

其中，所述的基因Cbei_4110，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

上述高产丁醇的基因工程菌的构建方法，它包括如下步骤：

(1)构建Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392;

(2)将步骤(1)得到的载体pWJ-392转化入拜氏梭菌中，获得Cbei_4110基因插入失活的重组菌株。

具体可通过如下方法构建基因工程菌：在线设计内含子序列并基因合成，构建Cbei_4110基因缺失载体，并将构建好的重组载体转化拜氏梭菌，筛选出阳性重组菌。将含有重组载体的菌株划线挑选，菌落PCR筛出内含子插入的重组菌株，再将内含子插入的重组菌株在含有和不含有红霉素抗性平板上复筛，获得载体丢失、且Cbei_4110基因插入失活的目标重组菌株。

步骤(1)中，以含有二型内含子的大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体pWJ为出发载体，构建Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392。

步骤(2)中，将载体pWJ-392引入拜氏梭菌中，实现Cbei_4110基因的插入失活，采用电转化法。

上述高产丁醇的基因工程菌株在发酵制备丁醇中的应用。

有益效果：本发明是借助含有二型内含子的大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体pWJ，实现拜氏梭菌中编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的Cbei_4110基因的插入失活，构建得到Cbei_4110基因失活的重组菌株。本发明的基因工程菌株，以葡萄糖为碳源时，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了12.7g/L和9.9g/L，分别比出发菌提高了17.5%和25.3%，丁醇比高达78%，糖转化率高达0.42，利用本发明方法构建的重组菌株，能提高丁醇产量和糖转化效率，降低生产成本。

附图说明

图1为本发明Cbei_4110基因插入失活载体pWJ-392的质粒图谱。

图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图。

图3为挑取转化子菌落PCR电泳图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

本实例说明拜氏梭菌Cbei_4110基因插入失活重组菌株的构建方法。

1.设计内含子序列

根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的Cbei_4110基因序列，借助软件设计合适的插入基因位点（http://www.clostron.com），选择插入在392和393之间，并生成内含子序列，合成内含子序列S-392，其序列如SEQ ID NO:2所示，并设计引物：

pWJ-OSC-392-S	ggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttagatgtctctaaag
		pWJ-OSC-392-A	ggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataag
Cbei-4110-T-S	aatcaattgctcctacactctgt
		Cbei-4110-T-A	atgtcaaaatatatggtgattgat

其序列分别如SEQ ID NO:3-6所示。

引物pWJ-OSC-392-S和pWJ-OSC-392-A两端分别引入XhoⅠ和BsrGⅠ酶切位点(下划线部分)。

2.Cbei_4110基因插入失活载体的构建

用XhoⅠ和BsrGⅠ双酶切载体pWJ（上海生科院杨晟老师提供），酶切产物经纯化试剂盒（Takara）化后，与内含子序列S-392通过一步克隆连接（ClonExpress）。将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli DH5a（本实验室），涂布到含有50ug/ml氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有50ug/ml氨苄霉素LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒（AXYGEN），提取重组质粒，测序验证，获得Cbei_4110插入失活载体pWJ-392。

3.甲基化插入失活载体pWJ-392

制备E.coli Top10/pAN2（本实验室）的化学感受态，将测序验证的Cbei_4110插入失活载体pWJ-392转化到大肠杆菌E.coli Top10，由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂布到含有50ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素双抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有50ug/ml氨苄霉素和10ug/ml四环素的LB培养基中，37℃、200rpm、培养12h，提取甲基化缺失载体pWJ-392（pAN2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化）。

4.电转化甲基化的载体pWJ-392至拜氏梭菌(Clostridium beijerinckiiNCIMB8052)

1）将Clostridium beijerinckii NCIMB8052（本实验室）接种至CGM培养基（酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl2g/L，MgSO₄·7H₂O3g/L，KH₂PO₄1g/L，K₂HPO₄1g/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L）37℃培养12h，以5%比例接种到CGM培养基，37℃培养6-8h，以10%接种到2×YTG培养基（酵母粉16g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L），37℃培养至OD600=1。

2）取50ml菌液，5000rpm，4℃离心10min，弃上清。在以ETM缓冲液（270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM Na₂HPO₄，10mM MgCl₂）重悬；同上离心，去上清，再次以ETM缓冲液重悬，同上离心，彻底去除上清。

3）以1ml ET缓冲液（270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM Na₂HPO₄）重悬，取200ul，加入1ug甲基化的插入失活载体pWJ-392，加入0.2cm预冷的电转杯，轻轻混匀。

4）使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压1.8kV，电阻200Ω，电容2.5uF，电击后立刻加入1mL2×YTG培养基，转移到无菌离心管中，在37℃厌氧培养箱复苏2-3h。

5）取200ul上述菌液，涂布到含有10ug/ml红霉素的CGM固体平板，37℃厌氧培养2-3天。

5.筛选Cbei_4110插入失活的重组菌株

挑取平板上长出的转化子，使用引物Cbei-4110-T-S和Cbei-4110-T-A对转化子进行菌落PCR验证，筛选出内含子插入基因组的突变株（插入后，PCR扩增出基因条带电泳图上比野生型大约1Kbp）。将正确插入的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的CGM固体培养基上，筛选出载体pWJ-392丢失（在红霉素抗性平板上不能生长的重组菌株）的重组菌株。

实施例2：

本实例说明重组菌株的丁醇产量比出发菌株提高。

基因Cbei_4110插入失活的重组菌株和野生型菌株接入种子培养基（酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH6）扩大培养，培养温度37℃，25mL肖特厌氧瓶装液量10mL，充氮气3min，培养时间12h。然后接种P2发酵培养基（葡萄糖3%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH6.6），接种量10%（v/v），发酵温度37℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，发酵时间60h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示：

表1 重组菌与出发菌的丁醇发酵结果

拜氏梭菌Cbei_4110基因缺失突变株在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量均明显高于出发菌株，丁醇产量提高26.2%，总溶剂产量提高16.7%。

实施例3：

本实例说明重组菌株的遗传稳定性。

将实施例1中构建的Cbei_4110基因插入失活的拜氏梭菌重组菌株，在CGM固体培养基上连续转接五次，发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，生长状态良好，性质稳定。转接五次中，各代菌株的厌氧瓶发酵结果表明，丁醇产量在9.5-9.9g/L之间，未发生明显变化，说明所构建的重组菌株具有良好的遗传稳定性。

实施例4：

本实例说明重组菌在发酵罐中发酵生产丁醇的工艺。

将拜氏梭菌基因Cbei_4110失活突变株和野生型菌株接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间12h。将平板培养的菌株接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养温度37℃，培养时间12h；将种子接种到装有1L发酵培养基的2L发酵罐中，接种量10%(v/v)，发酵温度37℃，发酵过程中连续通入氮气，流速为0.3L/min，发酵培养60h后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了12.7g/L和9.9g/L，分别比出发菌提高了17.5%和25.3%，丁醇比高达78%，糖转化率高达0.42。

虽然，以上描述已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在发明基础上，对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种高产丁醇的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)构建Cbei_4110基因的插入失活重组载体；

(2)将步骤(1)得到的重组载体转化入拜氏梭菌中，获得Cbei_4110基因插入失活的重组菌株；所述的拜氏梭菌为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052；所述的基因Cbei_4110，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；

步骤(1)中，以含有二型内含子的大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体pWJ为出发载体，在pWJ质粒的Xho Ⅰ和BsrG Ⅰ酶切位点处插入SEQ ID NO：2所示的序列构建得到Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392，所述载体pWJ的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

2.据权利要求1所述的高产丁醇的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，将pWJ-392引入拜氏梭菌中，实现Cbei_4110基因的插入失活，采用电转化法。

3.权利要求1或2所述高产丁醇的基因工程菌株的构建方法构建得到的高产丁醇的基因工程菌株。

4.权利要求1所述的高产丁醇的基因工程菌株在发酵制备丁醇中的应用。