CN105567603B

CN105567603B - 一种提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性的方法

Info

Publication number: CN105567603B
Application number: CN201610076666.4A
Authority: CN
Inventors: 郭亭; 孙东磊; 王庆福; 斑文婷; 黄清铧; 陈瑞荣; 梁磊; 安玉兴
Original assignee: Guangdong Institute of Bioengineering Guangzhou Cane Sugar Industry Research Institute
Current assignee: Guangdong Institute of Bioengineering Guangzhou Cane Sugar Industry Research Institute
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: CN105567603A

Abstract

本发明公开了一种提高拜氏梭菌对4‑羟基肉桂酸抗逆性的方法。该方法是将拜氏梭菌中编码依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过二型内含子基因敲除技术使拜氏梭菌中编码依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活。结果表明该重组菌株具有较好的传代稳定性，当培养基中4‑羟基肉桂酸的浓度为0.5 g/L时，出发菌株8052几乎不产溶剂，本发明构建重组菌丁醇产量达3.4 g/L，说明通过本发明的方法提高了拜氏梭菌对4‑羟基肉桂酸的抗逆性。

Description

一种提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性的方法。

背景技术

石油枯竭，能源短缺等问题日益严重；丁醇具有与石油能源相似性质，作为第二代生物能源被广泛认知；进而生物法生产丁醇逐渐成为研究热点。传统的丙酮-丁醇-乙醇发酵（ABE发酵）底物原料一般直接采用葡萄糖、木糖等，消耗成本高，研究人员不得不将目标锁定向廉价的废弃可再生的木质纤维素原料（甘蔗渣、玉米芯、秸秆等）。然而木质纤维素原料在预处理成为微生物可利用的碳源的同时也释放出大量的有机酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、酚类化合物等物质，这些物质严重抑制了菌体的生长及产醇，此外对于去除该抑制物的工艺，成本消耗高，因此，在利用木质纤维素为底物原料进行ABE发酵的基础上，提高微生物自身的毒素物质抗逆性尤其重要。

目前，生物丁醇的抗逆性研究主要集中在拜氏梭菌利用木质纤维素水解液方面，其中有毒物质（如酚类化合物）的毒害作用尤为显著。高浓度酚类物质能够改变细胞膜疏水性，破坏细胞膜，导致菌体死亡。Thaddeus Ezeji等（Bioresource Technol. 2008, 99:5915-5922）利用BA101，以XAD-4 树脂脱毒的玉米芯稀硫酸水解和酶解液为发酵底物，得到总溶剂产量为9.3 g/L；但BA101在未脱毒的稀酸水解液中几乎不产丁醇。

4-羟基肉桂酸，又称为对香豆酸，英文名为ρ-coumaric acid，其化学结构式为：。Thaddeus Ezeji等（Biotechnol. Bioeng. 2007，97, 1460-1469.）报道拜氏梭菌突变株BA101在2g/L4-羟基肉桂酸胁迫下完全不生长；同时，郭亭等（J IndMicrobiol Biotechnol., 2012, 39(3), 401-407）研究发现，在P2发酵培养基中添加0.5g/L4-羟基肉桂酸时，拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）8052生长受到较大抑制，细胞干重仅达到0.5g/L左右，并且丁醇产量低于1g/L。然而，4-羟基肉桂酸对菌体的抑制具体机制尚未明确，通过基因工程手段来提高产溶剂菌的抗逆性，提高丁醇得率越来越得到重视。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性的方法，该方法是将拜氏梭菌中依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A失活。

进一步的，使辅酶Q氧化还原酶亚基A失活的方法为使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达，该基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A基因失活的方法选自碱基突变失活、碱基插入失活、碱基缺失失活。

进一步的，通过碱基插入失活的方法使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活。

进一步的，通过插入二型内含子使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活。

进一步的，所述通过插入二型内含子使编码依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，具体操作包括如下步骤：

1）将SEQ ID NO：2所示的内含子序列S-62连接到二型内含子基因敲除质粒中，得到重组质粒；

2）将步骤1）得到的重组质粒进行甲基化；

3）将步骤2）得到的甲基化的重组质粒转化拜氏梭菌，筛选得到编码依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A基因失活的菌株。

进一步的，SEQ ID NO：2所示的内含子序列的基因插入位点为SEQ ID NO：1中第62位和第63位碱基之间。

按上述所述方法得到的拜氏梭菌。

上述拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用。

一种对4-羟基肉桂酸具有高抗逆性拜氏梭菌，在拜氏梭菌NCIMB 8052中缺失依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A的正常功能，编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的有益效果是：

(1) 本发明将拜氏梭菌中编码依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A基因Cbei_2996进行插入失活后，使得此基因不能正常表达，获得Cbei_2996基因插入失活的重组菌株。

(2) 本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌抗逆性的方法，借助此方法得到的重组菌株对4-羟基肉桂酸具有较高抗逆性，当以葡萄糖为碳源，在100ml厌氧瓶中含有4-羟基肉桂酸的发酵培养基培养时，丁醇产量达到3.4 g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不产醇。

(3)利用本发明方法构建的重组菌株，其对4-羟基肉桂酸抗逆性强、丁醇产量高。

附图说明

图1为质粒pWJ的质粒图谱；

图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图；

图3为转化子菌落PCR电泳图；

图4为本发明重组菌和出发菌株NCIMB 8052对4-羟基肉桂酸的抗逆性考察。

具体实施方式

优选的，使辅酶Q氧化还原酶亚基A失活的方法为使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达，该基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A基因失活的方法选自碱基突变失活、碱基插入失活、碱基缺失失活。

优选的，通过碱基插入失活的方法使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活。

优选的，通过插入二型内含子使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，又称为二型内含子基因敲除技术。

优选的，所述通过插入二型内含子使编码依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，具体操作包括如下步骤：

2）将步骤1）得到的重组质粒进行甲基化；

优选的，SEQ ID NO：2所示的内含子序列的基因插入位点为SEQ ID NO：1中第62位和第63位碱基之间。

优选的，所述二型内含子基因敲除质粒为pWJ质粒，该质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示。

优选的，所述重组质粒甲基化操作为将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli Top 10中进行甲基化。

优选的，所述拜氏梭菌为拜氏梭菌NCIMB 8052。

按上述所述的提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性的方法得到的拜氏梭菌。

上述所述拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用。

优选的，所述发酵环境中存在4-羟基肉桂酸。

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1 ：拜氏梭菌Cbei_2996基因失活突变株的构建方法

（1）设计内含子：

根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的Cbei_2996基因序列（如SEQ ID No：1所示），即编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的碱基序列（nuoA），借助软件设计合适的插入基因位点（http://www.clostron.com），通过前期的实验筛选和验证，选择插入在Cbei_2996基因序列第62和63个碱基之间，并生成内含子序列，合成的内含子为S-62，其序列如SEQ ID NO：2所示。

（2）Cbei_2996插入失活载体的构建：

用XhoⅠ和BsrGⅠ分别双酶切载体pWJ（上海生科院杨晟老师提供，其序列如SEQ IDNO：5所示，pWJ的质粒图谱如图1所示）和DNA片段S-62。酶切产物经纯化试剂盒（Takara）纯化后，通过T4连接酶（Takara）过夜连接。将连接的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli DH5a（本实验室），涂布到含有50ug/ml 氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有50ug/ml 氨苄霉素LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒（AXYGEN质粒提取试剂盒），测序验证，获得Cbei_2996基因的二型内含子基因敲除载体pWJ-62。

（3）载体pWJ-62甲基化：

制备含有pAN2质粒的E.coli Top 10（本实验室）的化学感受态，将测序成功的Cbei_2996插入失活载体pWJ-62转化到大肠杆菌E.coli Top 10，由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂布到含有50µg/ml氨苄霉素和10µg/ml四环素双抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有50ug/ml 氨苄霉素和10ug/ml四环素LB培养基中，37℃、200r培养12h，提取甲基化的载体pWJ-62（pAN2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化）。

（4）电转化甲基化的敲除质粒至拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB8052)：

1）将Clostridium beijerinckii NCIMB 8052（本实验室常期存有的常用菌株）接种至YPS种子培养基（酵母粉 3 g/L，蛋白胨 5 g/L，可溶性淀粉 10 g/L，乙酸铵 2 g/L，NaCl 3 g/L，MgSO₄ ·7H₂O 3 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1 g/L）37℃过夜培养，次日以5%比例接种到YPS培养基，37℃培养6-8h，以10%接种到2×YTG培养基（酵母粉16 g/L，蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 5 g/L，氯化钠 5 g/L）37℃培养3h，OD₆₀₀=1。

2）取50ml菌液，5000rpm，4℃离心10 min，弃上清。再用ETM缓冲液（270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM Na₂HPO₄，10mM MgCl₂·7H₂O）重悬；同上离心，去上清，再次以ETM缓冲液重悬，同上离心，彻底取上清。

3）取1µg甲基化的pWJ-62质粒加入到0.2cm预冷的电转杯；再用1mL ET 缓冲液（270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM Na₂HPO₄）重悬步骤2）菌泥，取200µl加入到电转杯，轻轻混匀。

4）使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压1.8kV，电阻200Ω，电容2.5µF，电击后立刻加入1mL 2×YTG 培养基，转移到无菌离心管中复苏2-3h。

5）取200ul上述菌液，涂布到含有10 µg/ml红霉素的YPS固体培养基，培养2-3天。

（5）筛选Cbei_2996插入失活突变株：

挑取转化子，使用引物Cbei-2996-T-S（其序列如SEQ ID NO：3所示）和Cbei-2996-T-A（其序列如SEQ ID NO：4所示），对转化子进行菌落PCR验证，筛选出内含子插入基因组的突变株（插入后，PCR扩增出基因条带电泳图上比野生型大约1Kbp，如图3所示）。将正确插入的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的YPS固体培养基上，筛选出敲除质粒丢失的突变株（在红霉素抗性平板上不能生长的突变株），本发明使用二型内含子插入失活的机理图如图2所示。

实施例2 ：Cbei_2996基因失活的重组菌的传代稳定性

本实施例所述的培养基配方：

平板培养基：酵母粉 3 g/L，蛋白胨 5 g/L，可溶性淀粉 10 g/L，乙酸铵 2 g/L，氯化钠 3 g/L，七水合硫酸镁3 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水合硫酸亚铁0.1 g/L，琼脂15 g/L，其余为水，pH 6。

种子培养基：酵母粉 3 g/L，蛋白胨 5 g/L，可溶性淀粉 10 g/L，乙酸铵 2 g/L，氯化钠 3 g/L，七水合硫酸镁3 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水合硫酸亚铁0.1 g/L，其余为水，pH 6。

发酵培养基：葡萄糖30 g/L，乙酸铵2.2 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠0.01 g/L，七水合硫酸镁 0.2 g/L，七水合硫酸亚铁0.01 g/L，一水合硫酸锰0.01 g/L，玉米浆0.1 %（v/v），其余为水，pH 6.6。

将实施例1中构建的Cbei_2996基因插入失活的拜氏梭菌重组菌接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间12 h。将平板培养的重组菌接种到种子培养基中，培养温度37℃，25 mL 肖特厌氧瓶装液量15 mL，充N₂ 3min，培养温度37℃，培养时间12 h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度37℃，100 mL 肖特厌氧瓶装液量50mL，充N₂3min，发酵培养72 h。

实施例1中构建的Cbei_2996基因失活的拜氏梭菌重组菌在固体培养基上连续转接7次，发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，生长状态良好。在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测重组菌的传代稳定性，重组菌传代发酵试验结果如表1所示。

表1 不同传代次数的Cbei_2996基因插入失活重组菌的发酵情况

从实验结果可知，经过7次连续传代，重组菌的总溶剂产量和丁醇产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例3 ：重组菌和出发菌株对4-羟基肉桂酸抗逆性考察

发酵培养基：葡萄糖30 g/L，乙酸铵2.2 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠0.01 g/L，七水合硫酸镁 0.2 g/L，七水合硫酸亚铁0.01 g/L，一水合硫酸锰0.01 g/L，玉米浆0.1（v/v）%，4-羟基肉桂酸0.5 g/L，其余为水，pH 6.6。

将实施例1中构建的Cbei_2996基因插入失活的拜氏梭菌重组菌和出发菌株NCIMB8052接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37℃，培养时间12 h。将平板培养的重组菌接种到种子培养基中，培养温度37℃，25 mL 肖特厌氧瓶装液量15 mL，充N₂ 3min，培养温度37℃，培养时间12 h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10 (v/v)%，发酵温度37℃，100 mL 肖特厌氧瓶装液量50 mL，充N₂3min，发酵培养72 h。进行气相检测，最终结果见图4，明显突出了本发明重组菌对4-羟基肉桂酸的高抗逆性，丁醇产量达3.4 g/L，而出发菌株8052丁醇产量为0.3g/L。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广州甘蔗糖业研究所

<120> 一种提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性的方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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<211> 8601

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ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca 4080

taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt 4140

ctacaaactc ttcctgtcgt catatctaca agcatatggt gcactctcag tacaatctgc 4200

tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 4260

cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 4320

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata 4380

cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact 4440

tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 4500

tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 4560

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 4620

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 4680

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 4740

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 4800

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 4860

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 4920

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 4980

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 5040

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 5100

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 5160

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 5220

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 5280

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 5340

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 5400

tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 5460

ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 5520

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 5580

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 5640

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 5700

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta 5760

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 5820

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 5880

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 5940

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 6000

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 6060

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 6120

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 6180

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 6240

ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 6300

gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 6360

gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 6420

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 6480

ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 6540

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctt 6600

tggctaacac acacgccatt ccaaccaata gttttctcgg cataaagcca tgctctgacg 6660

cttaaatgca ctaatgcctt aaaaaaacat taaagtctaa cacactagac ttatttactt 6720

cgtaattaag tcgttaaacc gtgtgctcta cgaccaaaag tataaaacct ttaagaactt 6780

tcttttttct tgtaaaaaaa gaaactagat aaatctctca tatcttttat tcaataatcg 6840

catcagattg cagtataaat ttaacgatca ctcatcatgt tcatatttat cagagctcgt 6900

gctataatta tactaatttt ataaggagga aaaaataaag agggttataa tgaacgagaa 6960

aaatataaaa cacagtcaaa actttattac ttcaaaacat aatatagata aaataatgac 7020

aaatataaga ttaaatgaac atgataatat ctttgaaatc ggctcaggaa aagggcattt 7080

tacccttgaa ttagtacaga ggtgtaattt cgtaactgcc attgaaatag accataaatt 7140

atgcaaaact acagaaaata aacttgttga tcacgataat ttccaagttt taaacaagga 7200

tatattgcag tttaaatttc ctaaaaacca atcctataaa atatttggta atatacctta 7260

taacataagt acggatataa tacgcaaaat tgtttttgat agtatagctg atgagattta 7320

tttaatcgtg gaatacgggt ttgctaaaag attattaaat acaaaacgct cattggcatt 7380

atttttaatg gcagaagttg atatttctat attaagtatg gttccaagag aatattttca 7440

tcctaaacct aaagtgaata gctcacttat cagattaaat agaaaaaaat caagaatatc 7500

acacaaagat aaacagaagt ataattattt cgttatgaaa tgggttaaca aagaatacaa 7560

gaaaatattt acaaaaaatc aatttaacaa ttccttaaaa catgcaggaa ttgacgattt 7620

aaacaatatt agctttgaac aattcttatc tcttttcaat agctataaat tatttaataa 7680

gtaagttaag ggatgcataa actgcatccc ttaacttgtt tttcgtgtac ctattttttg 7740

tgaatcgata atttacagaa aagaaaatta tagaatttag tatgattaat tatactcatt 7800

tatgaatgtt taattgaata caaaaaaaaa tacttgttat gtattcaatt acgggttaaa 7860

atatagacaa gttgaaaaat ttaataaaaa aataagtcct cagctcttat atattaagct 7920

accaacttag tatataagcc aaaacttaaa tgtgctacca acacatcaag ccgttagaga 7980

actctatcta tagcaatatt tcaaatgtac cgacatacaa gagaaacatt aactatatat 8040

attcaattta tgagattatc ttaacagata taaatgtaaa ttgcaataag taagatttag 8100

aagtttatag cctttgtgta ttggaagcag tacgcaaagg cttttttatt tgataaaaat 8160

tagaagtata tttatttttt cataattaat ttatgaaaat gaaagggggt gagcaaagtg 8220

acagaggaaa gcagtatctt atcaaataac aaggtattag caatatcatt attgacttta 8280

gcagtaaaca ttatgacttt tatagtgctt gtagctaagt agtacgaaag ggggagcttt 8340

aaaaagctcc ttggaataca tagaattcat aaattaattt atgaaaagaa gggcgtatat 8400

gaaaacttgt aaaaattgca aagagtttat taaagatact gaaatatgca aaatacattc 8460

gttgatgatt catgataaaa cagtagcaac ctattgcagt aaatacaatg agtcaagatg 8520

tttacataaa gggaaagtcc aatgtattaa ttgttcaaag atgaaccgat atggatggtg 8580

tgccataaaa atgagatgtt t 8601

Claims

1.一种提高拜氏梭菌对4-羟基肉桂酸抗逆性从而提高丁醇产量的方法，其特征在于：该方法是将拜氏梭菌中依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A失活，所述拜氏梭菌为拜氏梭菌NCIMB 8052，其中，使辅酶Q氧化还原酶亚基A失活的方法为使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达，该基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A基因失活的方法选自碱基突变失活、碱基插入失活、碱基缺失失活。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：通过碱基插入失活的方法使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：通过插入二型内含子使编码辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述通过插入二型内含子使编码依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶亚基A的基因失活，具体操作包括如下步骤：

2）将步骤1）得到的重组质粒进行甲基化；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：SEQ ID NO：2所示的内含子序列的基因插入位点为SEQ ID NO：1中第62位和第63位碱基之间。

7.拜氏梭菌在存在4-羟基肉桂酸的情况下发酵制备丁醇中的应用，所述拜氏梭菌按权利要求1～6任一所述方法改造得到。