CN107893083A - 一种人类肠道病毒d68型感染性克隆及其构建方法和应用 - Google Patents

一种人类肠道病毒d68型感染性克隆及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人类肠道病毒D68型感染性克隆及其构建方法和应用。该感染性克隆采用RNA聚合酶I系统，通过插入EV‑D68Fermon毒株的全长cDNA获得，全长cDNA的1882和2593位的BsmB1酶切位点进行不改变氨基酸的突变，两端插入BsmB1酶切位点。本发明提供的含有EV‑D68毒株Fermon全基因组cDNA克隆的重组质粒填补了我国人类肠道病毒D68型感染性克隆的空白，构建方法简洁高效，同时该发明的应用为寻找肠道病毒68型的毒力决定位点以及抗肠道病毒D68型病毒药物和疫苗的研发提供有力工具。

Description

一种人类肠道病毒D68型感染性克隆及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种人类肠道病毒D68型感染性克隆及其构建方法和应用
背景技术
人类肠道病毒D68型(EV-D68)属于小RNA病毒科(Picornaradae)，肠道病毒属(Enterovirus)，归属于人类肠道病毒D组。EV-D68基因组为单股正链RNA，长度约为7.4Kb，由单一的开放读码框(ORF)及其两侧非翻译区(5’UTR和3’UTR)构成。
近年来该病毒在全球多个地区频繁爆发，并且在爆发过程中出现十几例死亡的病例，因此引起世界卫生组织的广泛关注。然而，EV-D68的相关科研工作研究甚少，目前尚无治疗EV-D68感染的特效药物，只能以对症治疗控制病情发展。
应用反向遗传学技术构建RNA病毒的感染性克隆，可以通过基因工程的技术手段较容易的实现对病毒基因组的改造，如定点突变、重组、缺失和嵌合等，为阐明病毒的致病机理，定位病毒的毒力决定簇，研发新的抗病毒药物及获得新的疫苗奠定重要的基础。
CN 106636162 A公开了一种基于人RNA聚合酶I(hPolI)系统的肠道病毒68型(EV-D68)微复制子的构建及应用。该发明所提供的微复制子是将野生型EV-D68基因组RNA中的编码区替换为萤火虫荧光素酶(f-Luc)报告基因得到带有EV-D68基因组全部非编码区(UTR)基因和报告基因的质粒，即EV-D68微复制子。然而该发明的目的是构建微复制子，并不是为了构建感染性克隆。
CN 102517317 A公开了一种带有标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法及应用，其步骤是：(1)总RNA的提取：(2)EV71的RT-PCR扩增：(3)EV71亚克隆的构建(4)含有EV71基因的重组克隆的构建：(5)带有eGFP和DsRed的EV71全长感染性克隆的构建。通过细胞病变、荧光检测、基因检测、病毒蚀斑和药物抑制等实验证明成功获得带有标签的EV71全长感染性克隆。上述发明的感染性克隆均基于T7RNA聚合酶构建，构建方法繁琐复杂，是将EV71全长分为四段，PCR扩增后分别于载体Puc19连接，得到四个亚克隆，再进行重组克隆。
CN 103194475 A公开了一种肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法和应用。肠道病毒71型感染性克隆是以从肠道病毒71型毒株SZ2010EV71提取的
RNA为模板，经RT-PCR扩增得到全基因组序列，再与载体连接，酶切筛选阳性克隆而获得的。该发明所用载体为TOPO-XL-PCR，构建的感染性克隆需要体外转录为RNA。
目前尚没有针对人类肠道病毒D68型的感染性克隆的报道，人类肠道病毒D68型的感染性克隆在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种人类肠道病毒D68型感染性克隆及其构建方法和应用，所述感染性克隆填补了我国人类肠道病毒D68型感染性克隆的空白，为寻找人类肠道病毒D68型的毒力决定位点以及抗人类肠道病毒D68型病毒药物和疫苗的研发奠定重要基础，制备方法简洁高效，具有广泛的应用领域和重要的市场价值。
第一方面，本发明提供一种人类肠道病毒D68型的感染性克隆；
所述感染性克隆采用RNA聚合酶I系统，通过插入EV-D68病毒Fermon株的全长cDNA获得，所述EV-D68病毒Fermon株的全长cDNA的1882和2593位的BsmB1酶切位点进行不改变氨基酸的突变，所述EV-D68病毒Fermon株的全长cDNA的两端插入BsmB1酶切位点。
本发明基于RNA聚合酶I(PolI)系统来实现的，hPolI是人的RNA聚合酶I，通过这个系统可以在细胞中直接将DNA转录为RNA，从而使得病毒RNA在细胞内直接产生，无需体外转录先合成病毒RNA，再将病毒RNA转染细胞，节省实验步骤和试剂，避免RNA污染，大大简化了实验过程。
本发明使用的质粒带有hPolI序列以及mTer序列，hPolI为人的RNA聚合酶I，用来启动EV-D68全基因组的转录；mTer为鼠源终止子，是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，采用定点突变，人为敲除基因组1882、2593位两个BsmB1酶切位点，同时这两个位点也可以作为区别于亲本毒株的分子标记，本发明中采用的是pHH21质粒。
优选地，所述感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或与其具有至少80％同一性，同一性例如可以是80％、82％、85％、86％、90％、94％、95％、98％或100％，优选至少90％同一性的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一种构建如第一方面所述的感染性克隆的方法：
通过分段RT-PCR法获得EV-D68病毒Fermon株的全长基因组cDNA序列，敲除基因组394、1882和2593位三个BsmB1酶切位点，在全长基因组cDNA序列两端插入BsmB1酶切位点，克隆到带有hPolI序列和mTer序列的质粒中，再将394位点进行回复突变，即得到感染性克隆重组质粒。
本发明中，发明人发现394位突变会导致病毒增殖速率下降，从而将394位点进行回复突变。
优选地，所述分段RT-PCT分3段进行PCR，其中3对特异引物F1F、F1R、F2F、F2R、F3F和F3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-7所示；
F1F：ctagctagct taatacgact cactataggt taaaacagct ctggggttg(SEQ ID NO:2)
F1R：atagtttagc ggccgcgtca gtaccggtgg ttactatgtt gtg(SEQ ID NO:3)
F2F：actgacaccg gtccaggttt tgggggagtc(SEQ ID NO:4)
F2R：gtacgtaccg gttcaatgcg agatttggac(SEQ ID NO:5)
F3F：actgacaccg gtttgtttaa taatacacgg c(SEQ ID NO:6)
F3R：ttttcctttt gcggccgctt tttttttttt tttttttttt tttggtcccc aagtgaccaaaatttac(SEQ ID NO:7)。
优选地，所述敲除基因组394、1882和2593位三个BsmB1酶切位点的3对引物G394CF、G394C R、T1882A F、T1882A R、G2593A F和G2593A R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8-13所示；
G394CF：ctcatggtga aaaccatcag acgctagaca tgaac(SEQ ID NO:8)
G394CR：gttcatgtct agcgtctgat ggttttcacc atgag(SEQ ID NO:9)
T1882AF：caaatggcat ggagcgactc agagttgaca tatc(SEQ ID NO:10)
T1882AR：gatatgtcaa ctctgagtcg ctccatgcca tttg(SEQ ID NO:11)
G2593AF：gcatggtgtg tcggaaacgt tagtggagaa ttttc(SEQ ID NO:12)
G2593AR：gaaaattctc cactaacgtt tccgacacac catgc(SEQ ID NO:13)。
优选地，所述在全长基因组cDNA序列两端插入BsmB1酶切位点的引物pHH21F和pHH21R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14-15所示；
pHH21F：atcgcgtctc ctattttaaa acagctctgg ggttg(SEQ ID NO:14)
pHH21R：atcgcgtctc cgggattttt tttttttttt tttttttttt ggtccccaagtgaccaaaat ttacc(SEQ ID NO:15)。
优选地，所述394位点回复突变的引物C394GF和C394GR的核苷酸序列如SEQ IDNO:16-17所示；
C394GF：ggtgaaaacc atgagacgct agacatgaac aaggtg(SEQ ID NO:16)
C394GR：caccttgttc atgtctagcg tctcatggtt ttcacc(SEQ ID NO:17)。
优选地，所述构建方法具体包括如下步骤：
(1)以从EV-D68病毒Fermon株提取的RNA为模板，反转录得到cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，分三段RT-PCR法获得EV-D68病毒Fermon株的全长基因组cDNA序列F1、F2和F3三个片段；
(3)将步骤(2)扩增出的三个片段构建到同一个亚克隆中，突变亚克隆中的394、1882和2593位的BsmB1酶切位点；
(4)用双酶切的方法将亚克隆上的片段改造到真核表达载体上，回复突变394位点，得到重组质粒，即为人类肠道病毒D68型感染性克隆。
优选地，步骤(1)中所述反转录程序为52-58℃25-35min，82-88℃3-8min，优选为55℃30min，85℃5min。
优选地，步骤(3)所述亚克隆采用的载体为pcDNA3.1。
优选地，步骤(3)所述突变的PCR的条件为92-98℃15-25s，52-58℃15-25s，70-75℃3-8min，15-23个循环，优选为95℃20s，55℃20s，72℃5min，18个循环。
在一个具体的实施例中，所述构建人类肠道病毒D68型感染性克隆的方法为：
(1)以从EV-D68病毒Fermon株提取的RNA为模板，oligo-dT为引物，反转录得到cDNA，反转录条件为55℃30min，85℃5min；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，以下述三对引物SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，分三段RT-PCR法获得EV-D68病毒Fermon株的全长基因组cDNA序列F1、F2和F3三个片段；
所述引物序列如下：
F1F：ctagctagct taatacgact cactataggt taaaacagct ctggggttg(SEQ ID NO:2)
F1R：atagtttagc ggccgcgtca gtaccggtgg ttactatgtt gtg(SEQ ID NO:3)
F2F：actgacaccg gtccaggttt tgggggagtc(SEQ ID NO:4)
F2R：gtacgtaccg gttcaatgcg agatttggac(SEQ ID NO:5)
F3F：actgacaccg gtttgtttaa taatacacgg c(SEQ ID NO:6)
F3R：ttttcctttt gcggccgctt tttttttttt tttttttttt tttggtcccc aagtgaccaaaatttac(SEQ ID NO:7)；
(3)将F1片段经酶切后与真核表达载体pcDNA3.1连接，再转化至大肠杆菌中获得克隆质粒pcDNA3.1-F1，再将pcDNA3.1-F1质粒与F3片段酶切后连接转化获得克隆质粒pcDNA3.1-F13，再将pcDNA3.1-F13质粒与F2片段酶切后连接转化，获得含有F1、F2和F3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒pcDNA3.1-Fermon；
(4)以步骤(3)得到的重组质粒pcDNA3.1-Fermon为模板，在不改变氨基酸前提下，以下述三对引物分别进行394、1882和2593位的点突变PCR获得不含BsmB1酶切位点的重组质粒pcDNA3.1-FermonΔBsmB1，所用三对引物为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，突变条件为95℃20s，55℃20s，72℃5min，18个循环；
所述引物序列如下：
G394CF：ctcatggtga aaaccatcag acgctagaca tgaac(SEQ ID NO:8)
G394CR：gttcatgtct agcgtctgat ggttttcacc atgag(SEQ ID NO:9)
T1882AF：caaatggcat ggagcgactc agagttgaca tatc(SEQ ID NO:10)
T1882AR：gatatgtcaa ctctgagtcg ctccatgcca tttg(SEQ ID NO:11)
G2593AF：gcatggtgtg tcggaaacgt tagtggagaa ttttc(SEQ ID NO:12)
G2593AR：gaaaattctc cactaacgtt tccgacacac catgc(SEQ ID NO:13)；
(5)以步骤(4)得到的重组质粒pcDNA3.1-FermonΔBsmB1为模板，以SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15为引物进行PCR扩增；
所述引物序列如下：
pHH21F：atcgcgtctc ctattttaaa acagctctgg ggttg(SEQ ID NO:14)
pHH21R：atcgcgtctc cgggattttt tttttttttt tttttttttt ggtccccaagtgaccaaaat ttacc(SEQ ID NO:15)；
(6)BsmB1酶切经步骤(5)得到的PCR产物和真核表达载体pHH21，连接，筛选阳性克隆，获得带有非编码区突变的重组质粒pHH21-EV-D68FermonG394C；
(7)为不改变病毒非编码区结构，以步骤(4)得到的质粒pcDNA3.1-F1为模板，以C394GF和C394GR为引物扩增获得112-1418片段，将112-1418片段与pHH21-EV-D68FermonG34C质粒进行HindⅢ和Nde1双酶切，酶切片段回收后，进行T4连接，PCR条件为95℃20s，55℃20s，72℃6min，18个循环；
所述引物序列如下：
C394GF：ggtgaaaacc atgagacgct agacatgaac aaggtg(SEQ ID NO:16)
C394GR：caccttgttc atgtctagcg tctcatggtt ttcacc(SEQ ID NO:17)
(8)筛选阳性克隆，获得基于RNA聚合酶I系统的含有F1、F2和F3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒pHH21-EV-D68Fermon，即为人类肠道病毒D68型感染性克隆。
第三方面，本发明提供一种包含第一方面所述的人类肠道病毒D68型的感染性克隆的宿主细胞。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的人类肠道病毒D68型的感染性克隆在制备病毒及其衍生物的应用。
优选地，将所述人类肠道病毒D68型的感染性克隆转染易感细胞，获得拯救病毒及其衍生物。
优选地，所述易感细胞为横纹肌瘤细胞(RD)和/或人源胚胎肾细胞(293T)，优选为RD细胞。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的人类肠道病毒D68型的感染性克隆在制备抗病毒和/或肿瘤药物及疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所提供的肠道病毒68型感染性克隆为首次成功的人类肠道病毒D68型的感染性克隆，采用RNA聚合酶I系统，通过插入EV-D68病毒Fermon株的全长cDNA获得，填补了我国人类肠道病毒D68型感染性克隆的空白；
(2)本发明所提供的构建方法简洁高效，采用定点突变，人为敲除基因组1882和2593位两个BsmB1酶切位点，同时这两个位点也可以作为区别于亲本毒株的分子标记；采用的载体质粒带有hPolI序列以及mTer序列，hPolI为人的RNA聚合酶I，用来启动转录；mTer为鼠源终止子，传递终止信号；基于RNA聚合酶I(PolI)系统来实现，无需体外转录，节省步骤和试剂，成功率高；
(3)本发明所提供的应用可以通过基因工程的技术手段较容易的实现对EV-D68基因组的改造，如定点突变、重组、缺失和嵌合等，为阐明EV-D68的致病机理，定位EV-D68的毒力决定簇，研发新的抗病毒药物及获得新的疫苗奠定重要的基础，提供有力的工具。
附图说明
图1为人类肠道病毒D68型感染性克隆的结构示意图；
图2为本发明实施例1扩增得到的F1、F2和F3三个片段的核酸条带；
图3为本发明实施例2中的细胞病变图，图3(A)为空白对照组，图3(B)为野生型(WT)病毒感染产生的细胞病变图，图3(C)为拯救病毒感染产生的细胞病变图；
图4为拯救病毒与野生型病毒的酶切结果图以及测序结果图，图4(A)为酶切结果图，图4(B)为测序结果图，其中WT为野生型，RgEV-D68Fermon为拯救病毒；
图5为拯救病毒RgEV-D68Fermon与野生病毒产生的空斑形态图，图5(A)为野生型病毒产生的空斑形态图，图5(B)为拯救病毒RgEV-D68Fermon产生的空斑形态图，其中-4、-5和-6表示稀释104倍、105倍和106倍；
图6为野生病毒与拯救病毒RgEV-D68FermonG394C产生的空斑形态图，图6(A)为野生型病毒产生的空斑形态图，图6(B)为拯救病毒RgEV-D68FermonG394C空斑形态图，其中-3、-4和-5表示稀释103倍、104倍和105倍；
图7为拯救病毒RgEV-D68Fermon与野生病毒在RD细胞中的一步增殖曲线；
图8为拯救病毒RgEV-D68FermonG394C与野生病毒在RD细胞中的一步增殖曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1 EV-D68Fermon株的全长cDNA克隆的构建
(1)引物设计：从Genebank中选取EV-D68Fermon毒株的基因组序列，通过比较分析后，设计带有修饰的扩增覆盖全基因组的三对特异引物F1F、F1R、F2F、F2R、F3F和F3R，引物均由GENEWIZ公司合成。具体引物序列如下：
F1F：ctagctagct taatacgact cactataggt taaaacagct ctggggttg(SEQ ID NO:2)
F1R：atagtttagc ggccgcgtca gtaccggtgg ttactatgtt gtg(SEQ ID NO:3)
F2F：actgacaccg gtccaggttt tgggggagtc(SEQ ID NO:4)
F2R：gtacgtaccg gttcaatgcg agatttggac(SEQ ID NO:5)
F3F：actgacaccg gtttgtttaa taatacacgg c(SEQ ID NO:6)
F3R：ttttcctttt gcggccgctt tttttttttt tttttttttt tttggtcccc aagtgaccaaaatttac(SEQ ID NO:7)
(2)RT-PCR：按照病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取实验室保存的病毒RNA，反转录的引物为oligo-dT，按SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen公司)说明书构建20μL反应体系，反转录程序为：50℃1h，70℃15min；
(3)片段扩增：得到病毒基因组cDNA后，PCR扩增的引物为F1F、F1R、F2F、F2R、F3F和F3R，按照TransStart Fastpfu DNA Polymerase(Transgen公司)说明书构建50μL反应体系，扩增得到F1、F2和F3三个片段；
(4)亚克隆构建：将F1片段与pcDNA3.1(-)质粒进行Nhe1和BshT1双酶切，酶切片段回收后，进行T4连接获得pcDNA3.1-F1重组质粒。
将F3片段与pcDNA3.1-F1重组质粒进行BshT1和Not1双酶切，酶切片段回收后，进行T4连接获得pcDNA3.1-F13重组质粒。
将F2片段与pcDNA3.1-F13重组质粒进行BshT1单酶切，酶切片段回收后，进行T4连接获得pcDNA3.1-Fermon重组质粒。
以pcDNA3.1-Fermon重组质粒为模板，在不改变氨基酸前提下，利用G394C F、G394C R、T1882A F、T1882A R、G2593A F和G2593A R三对引物分别进行点突变PCR获得不含BsmB1酶切位点的重组质粒pcDNA3.1-FermonΔBsmB1。
所用三对引物为：
G394CF：ctcatggtga aaaccatcag acgctagaca tgaac(SEQ ID NO:8)
G394CR：gttcatgtct agcgtctgat ggttttcacc atgag(SEQ ID NO:9)
T1882AF：caaatggcat ggagcgactc agagttgaca tatc(SEQ ID NO:10)
T1882AR：gatatgtcaa ctctgagtcg ctccatgcca tttg(SEQ ID NO:11)
G2593AF：gcatggtgtg tcggaaacgt tagtggagaa ttttc(SEQ ID NO:12)
G2593AR：gaaaattctc cactaacgtt tccgacacac catgc(SEQ ID NO:13)
以突变后的pcDNA3.1-FermonΔBsmB1为模板，pHH21F和pHH21R为引物，扩增得到FermonΔBsmB1片段。
所用引物为：
pHH21F：atcgcgtctc ctattttaaa acagctctgg ggttg(SEQ ID NO:14)
pHH21R：atcgcgtctc cgggattttt tttttttttt tttttttttt ggtccccaagtgaccaaaat ttacc(SEQ ID NO:15)；
(5)pHH21-EV-D68FermonG394C构建：将FermonΔBsmB1片段与pHH21质粒进行BsmB1酶切，酶切片段回收，进行T4连接，筛选获得带有非编码区突变的重组质粒pHH21-EV-D68FermonG394C，结构示意图为图1。
(6)pHH21-EV-D68Fermon构建：以pcDNA3.1-F1重组质粒为模板，C394GF和C394GR为引物扩增获得112-1418片段，将112-1418片段与pHH21-EV-D68FermonG394C质粒进行HindⅢ和Nde1双酶切，酶切片段回收后，进行T4连接获得pHH21-EV-D68Fermon重组质粒，结构示意图为图1。
所用引物为：
C394GF：cccaagcttt taaaccaaag ctcaatagg(SEQ ID NO:16)
C394GR：ccgctcgagc atatgggtgg ttaaacgtcc c(SEQ ID NO:17)。
将步骤(3)扩增的片段进行核酸电泳验证，核酸电泳结果如图2所示；
由图2可以看出，本实施例成功扩增出F1、F2和F3三个片段。
实施例2 病毒拯救
使用质粒大提试剂盒提取pHH21-EV-D68Fermon和pHH21-EV-D68FermonG394C质粒备用。按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书将pHH21-EV-D68Fermon和pHH21-EV-D68FermonG394C质粒转染至生长为70％的RD或293T细胞培养板中(24孔板)，转染计量为1μg。6h后换为含有2％胎牛血清的DMEM维持液，并将转染后的细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养，并同时设置未转染质粒的细胞作为对照组。转染细胞后，观察细胞病变，5d后收获病毒，反复冻融3次后连续在RD细胞上传代，待第三代72h出现特征性细胞病变(CPE)。结果如图3(A)-图3(C)所示。
由图3(A)-图3(C)可以看出，拯救病毒导致的细胞病变与野生型病毒相同，收获细胞及培养液，反复冻融3次，获得拯救病毒RgEV-D68Fermon和RgEV-D68FermonG394C。
实施例3 RT-PCR鉴定拯救病毒的特异序列
应用通用引物2F和4R扩增病毒基因组RgEV-D68Fermon第958位至2870位核苷酸，由于拯救病毒RgEV-D68Fermon的第958位至2870位核苷酸不含有BsmB1酶切位点，因此通过BsmB1酶切以及测序分析对拯救病毒进行鉴定，结果如图4(A)-图3(B)所示。
由图4(A)-图3(B)可以看出，拯救病毒RgEV-D68Fermon的扩增基因并不被BsmB1酶切，且测序结果显示与野生型病毒存在碱基差异。
实施例4 病毒空斑实验测定病毒滴度
将RD细胞接种至6孔板，使1d后细胞长成致密单层。取拯救病毒RgEV-D68Fermon、RgEV-D68FermonG394C和野生病毒WT进行10倍梯度稀释，即10-1～10-8。待细胞长成单层后，弃掉6孔板中的生长液，用不含血清的DMEM细胞培养基清洗两遍。取10-3～10-8稀释液，每孔加入1ml病毒稀释液，37℃吸附2h，每15分钟充分晃动一次。另设置细胞对照，每孔加入1ml DMEM细胞培养基。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有1％、0.7％甲基纤维素、2％FBS的1×DMEM培养基覆盖物，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。每日观察细胞的CPE变化，待噬斑形成后用1％甲醇固定30min，0.1％结晶紫染色液染色20min，用流水冲洗孔底，烘干后即可观察噬斑形态并计算病毒滴度，结果如图5(A)-图3(B)和图6(A)-图3(B)所示。
从图5(A)-图3(B)和图6(A)-图3(B)中可以看到，拯救病毒和野生病毒具有相似的噬斑形态。
实施例5 病毒增殖
按实施例2的步骤，培养获得拯救病毒RgEV-D68Fermon，并测定病毒滴度。待六孔板RD细胞长至单层，用不含血清的DMEM细胞培养基清洗两遍，将拯救病毒RgEV-D68Fermon和野生病毒WT按0.1MOI接种细胞，37℃吸附2h，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，每孔加入2ml含有2％FBS的DMEM维持液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。在接种病毒后的0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h和48h收集病毒感染的细胞至EP管中。提取细胞中RNA，利用实时荧光定量PCR检测细胞中病毒RNA含量，绘制病毒一步增殖曲线结果如图7所示。
由图7可知，拯救病毒RgEV-D68Fermon与野生病毒在细胞中的增殖趋势大致相同。
对比例1 394突变降低病毒增殖能力
待六孔板RD细胞长至单层，用不含血清的DMEM细胞培养基清洗两遍，将拯救病毒RgEV-D68FermonG394C和野生病毒WT按0.1MOI接种细胞，37℃吸附2h，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，每孔加入2ml含有2％FBS的DMEM维持液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。在接种病毒后的0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h和48h收集病毒感染的细胞至EP管中。提取细胞中RNA，利用Real-time Quantitative PCR检测细胞中病毒RNA含量，绘制病毒一步增殖曲线结果如图8所示。
由图8可知，拯救病毒RgEV-D68FermonG394C的增殖速度相比于野生病毒在细胞中的增殖速度明显下降。
综上所述，本发明所提供的技术方案能够成功构建肠道病毒68型的感染性克隆，填补了业内空白。构建方法简洁高效，基于RNA聚合酶I(PolI)系统来实现，无需体外转录，节省步骤和时间。定点突变的方法人为敲除基因组1882、2593位两个BsmB1酶切位点，同时这两个位点也可以作为区别于亲本毒株的分子标记；同时，本发明发现病毒非编码区394位点是病毒复制的关键位点。不仅如此，本发明的拯救病毒应用领域广泛，为EV-D68的致病机理研究提供了一个有效的平台，为寻找EV-D68的毒力决定位点以及抗EV-D68病毒药物和EV-D68疫苗的研发奠定重要基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种人类肠道病毒D68型感染性克隆及其构建方法和应用
<130> 2017
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10232
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttaaaacagc tctggggttg ttcccacctc aagggcccac gtggcggcta gtactctggt 60
atctcggtac ctttgtacgc ctgttttaat tccctcccca acgtaactta gaagctttta 120
aaccaaagct caataggtgg agcgcaaacc agcgctctta tgagcaagca cttctgtctc 180
cccggtgtgg ttgtatagac tgtccccacg gttgaaaaca acttatccgt taaccgctat 240
agtacttcga gaaacctagt attgccttcg gagtgttgat gcgttgcgct cagcacacta 300
acccgtgtgt agcttgggtc gatgagtctg gacgtacccc actggcgaca gtggtccagg 360
ctgcgttggc ggcctactca tggtgaaaac catcagacgc tagacatgaa caaggtgtga 420
agagtctatt gagctactat agagtcctcc ggcccctgaa tgcggctaat cctaaccatg 480
gagcaagtgc tcacaaacca gtgagttact tgtcgtaacg cgcaagtccg tggcggaacc 540
gactactttg ggtgtccgtg tttcactttt tacttttatg actgctaatg gtgacaattt 600
aatattgtta ccatttggct tgtcgaattg atcacataag atctatagtt ttgttcactg 660
atttgctttg aaataatctc acctcaaaac ctccagtaca taacatttaa agagtttaaa 720
cttatttata acaatgggag ctcaagttac tagacagcaa actggaactc atgagaatgc 780
taacattgct acaaatggat cccatattac atacaatcag ataaattttt acaaggatag 840
ttatgcagct tcagccagca agcaagactt ttcacaggat ccatcaaaat tcactgaacc 900
agtggtggaa ggcttaaaag caggggcacc agttttgaaa tctcctagcg ctgaggcttg 960
tggctacagt gatagagtac tacaactcaa attgggcaac tcagctattg tcactcaaga 1020
agcagcaaac tactgttgcg cttatggtga atggcctaat tatttaccag atcatgaagc 1080
agtagctatt gataaaccta cacaaccaga aacttctaca gacagatttt atactttaag 1140
atcagtcgaa tgggagagta atagcacagg atggtggtgg aaactacctg atgcattaaa 1200
caacataggc atgtttggac aaaatgtaca atatcactac ctatacagat ctggcttctt 1260
aattcatgtg cagtgcaacg ctacaaagtt ccatcaaggc gcgctgttgg tggtagcaat 1320
accagagcat cagagagggg cacacgacac caccactagt ccagggttta atgatatcat 1380
gaaaggtgaa agaggaggga cgtttaacca cccatatgtt cttgatgatg gaacatcaat 1440
agcttgtgcg acaatatttc cacatcaatg gataaatcta agaaccaaca attcagcaac 1500
gattgttctt ccatggatga atgttgcacc aatggacttt ccacttagac acaatcagtg 1560
gacactagca gtaataccag tggttccatt gggtacacgc acaatgtcaa gtgttgtccc 1620
aataacagtt tcaattgccc ctatgtgttg tgagtttaac ggactcaggc acgccatcac 1680
ccagggtgtt ccaacatatc ttctaccagg ttcaggacaa tttctgacta ctgatgacca 1740
tagctcagca ccagtcctcc cgtgtttcaa cccaactcca gaaatgcaca ttccagggca 1800
aatccgcaac atgttggaaa tgattcaagt ggaatcaatg atggagatta acaatacaga 1860
cggcgcaaat ggcatggagc gactcagagt tgacatatca gtacaagcag atcttgatca 1920
gttattattt aacattccac tagatataca actggatgga ccacttagaa acactttagt 1980
agggaacata tccagatatt atactcattg gtctggatct ctagaaatga cattcatgtt 2040
ttgcggtagt tttatggcaa cagggaaatt gatcctatgt tacacacctc caggtggatc 2100
atgcccaaca actagagaaa ctgccatgtt aggcactcac atcgtctggg actttggatt 2160
acaatctagt atcaccttaa taataccttg gattagtgga tcccactaca ggatgttcaa 2220
tagcgacgct aagtcaatca atgctaatgt tggctatgta acctgtttca tgcagaccaa 2280
cctgatagtc cccagtgagt cctctgatac ttgttcttta ataggattca tagcagcaaa 2340
agatgacttt tccctcaggt taatgagaga tagtccagat attggacaat taaaccactt 2400
acatggagca gaggcagcct atcaggtgga gagtatcatc aaaacagcaa ctgatactgt 2460
gaagagtgag attaacgccg aacttggtgt ggtccctagt ctaaatgcag ttgaaactgg 2520
tgcaacttcc aacactgaac cagaagaagc catacaaact cgcacagtaa taaatcagca 2580
tggtgtgtcg gaaacgttag tggagaattt tcttggtagg gcagccctag tgtcaaagaa 2640
aagttttgaa tacaagaatc atgcctcatc cagcgcaggg acacacaaaa acttttttaa 2700
atggacaatt aatactaagt cttttgtcca gttaagaaga aagctggaat tattcacata 2760
ccttaggttt gatgctgaaa tcaccatact cacaactgtg gcagtaaatg gtaataatga 2820
cagcacatac atgggtctcc ctgacttgac actccaagca atgtttgtac caactggtgc 2880
tcttactcca aaggagcagg attcatttca ttggcaatca ggcagtaatg ctagtgtgtt 2940
ctttaaaatt tctgatcccc cagctagaat gactatacct tttatgtgca tcaactcagc 3000
gtattcagtt ttttatgatg gctttgctgg atttgagaaa aatggtctat atggaataaa 3060
cccagctgac actattggca acttgtgtgt cagaatagtg aatgaacatc aaccagttgg 3120
ttttacagtg accgttaggg tttacatgaa gcctaaacat ataaaagcat gggctccacg 3180
accaccgcga accatgccat acatgagcat tgctaatgca aattacaaag gtagagatac 3240
agcaccaaac acacttaatg ccataattgg taatagagcg agtgtcacaa ctatgcctca 3300
caacatagta accaccggtc caggttttgg gggagtcttt gtagggtcct ttaagataat 3360
taactatcac ttagccacaa tagaagagag acaatcagcc atctatgtgg actggcaatc 3420
agatgttcta gtcaccccca ttgccgctca tggtagacat caaatagcaa gatgcaagtg 3480
taatacaggg gtttactatt gccggcacag agatagaagc tacccaattt gctttgaagg 3540
tccaggaatt caatggattg aacaaaatga atactacccg gcaagatacc agactaatgt 3600
acttctagca gctggccctg cagaagcagg agattgtggt ggtctattag tctgcccaca 3660
cggggtgatt ggcctcctta cagcaggagg gggtgggatt gtagccttca cagacatcag 3720
aaatttactg tggttagata ctgatgttat ggaacaaggt attactgatt acatacaaaa 3780
tcttggtaat gcttttggag caggattcac agaaacaatc tccaataagg ctaaggaagt 3840
gcaagacatg ttaattggag agagttcatt attggaaaaa ttactaaaag ctctaatcaa 3900
aattatatca gcactggtga ttgtcattag aaattcagaa gatttgataa cagttacagc 3960
tacactagca ttgttagggt gtcatgactc accatggagc tacttgaagc aaaaagtatg 4020
ctcatacttg ggtattccct atgtgcctag acaaagtgaa tcatggctta agaagttcac 4080
agaggcgtgc aatgctctta ggggtttaga ttggctatca caaaagatag acaagttcat 4140
taattggctc aaaactaaaa tattaccaga ggctagggag aaatatgaat tcgtgcaaag 4200
actcaagcag ctaccagtaa tagaaaaaca agttagcact attgagcata gttgcccaac 4260
aacagaacga caacaggcct tattcaacaa tgttcagtat tactcacatt actgtaggaa 4320
gtacgcacca ctttacgcag tggaatcaaa aagagtggcc gctcttgaaa agaaaataaa 4380
caattacatc cagttcaagt ccaaatctcg cattgaaccg gtttgtttaa taatacacgg 4440
ctccccagga actggcaaat cagtagcctc aaatttaatt gctagagcta tcacagaaaa 4500
attaggcggg gacatttact ccctaccccc agaccctaaa tactttgatg gatataaaca 4560
gcaaacagta gtccttatgg atgatttaat gcaaaatcca gatgggaatg atatatctat 4620
gttttgccaa atggtttcaa ctgtggattt tattcctcca atggctagtt tggaagagaa 4680
aggaactcta tataccagtc cattcttaat agccactact aatgctggtt caatacatgc 4740
accaacagtc tcagactcaa aggctttgtc acgcagattc aaatttgatg tggacattga 4800
agttacagat tcatacaaag actcaaacaa actagacatg tccagagcag tggaaatgtg 4860
caaaccagat aactgtaccc ctactaatta taaaagatgc tgcccactga tttgcggaaa 4920
agctattcaa tttagagatc gtagaaccaa tgcaagatcc acggttgata tgctagtgac 4980
tgacattatt aaggaataca gaaccaggaa tagcacacaa gacaaattag aagccctatt 5040
tcaaggacct ccacaattca aggagattaa aatctcagtc gctccagaca caccagcccc 5100
tgatgccata aatgaccttc ttaggtcagt ggactctcaa gaagttagag attattgtca 5160
aaagaagggg tggattgtaa tacacccgtc aaatgagcta gttgtagaaa aacatattag 5220
tagagctttc atcactctgc aagctattgc cacctttgta tcaatagctg gtgtggtcta 5280
tgttatatac aaactttttg ctggtattca gggcccatat acaggaattc ctaatcctaa 5340
acccaaagtg ccctctctta gaacagccaa agtgcaagga ccaggatttg attttgcgca 5400
agccataatg aagaaaaata ctgttattgc tagaactgaa aaaggcgagt tcacaatgct 5460
tggtgtgtat gatagagtgg cagtcattcc aacacatgca tctgttggag aaatcattta 5520
catcaacgat gtagaaacca gagttctaga tgcatgtgca cttagagact tgacagacac 5580
aaacctagaa ataactatag tcaaattgga tcgcaatcaa aaatttagag acatcagaca 5640
cttcttaccc agatgtgagg atgattacaa tgatgctgtg cttagtgtac atacatcaaa 5700
attccctaac atgtacattc cagttggaca agtcactaac tacggcttct tgaacctggg 5760
cggcacacca acacatcgga ttttaatgta taattttcca acaagagctg gtcagtgtgg 5820
tggtgtggtg acaaccacag gtaaagtgat aggaatacac gtgggcggga atggagctca 5880
gggattcgca gcaatgttgc tccactctta ctttactgat acacaaggtg agatagttag 5940
caatgagaag agtgggatgt gtattaatgc accagcaaaa acaaaactcc aacccagtgt 6000
cttccatcaa gtttttgaag gttcaaagga accagcagta ctcaattcaa aagatcctag 6060
actcaagact gatttcgagg aggctatttt ctcaaaatat acaggtaaca aaattatgtt 6120
aatggatgag tacatggaag aagcagtgga tcattatgtg ggatgtttag aaccactgga 6180
tattagtgta gatcccatac cccttgaaaa tgctatgtat ggaatggagg gtcttgaagc 6240
attggactta accaccagtg cgggcttccc ttatttgtta caagggaaaa agaaaaggga 6300
catattcaac agacaaacca gagatactag tgagatgaca aagatgttgg aaaaatacgg 6360
agttgaccta cctttcgtga ctttcgtgaa agacgagctt agatcaagag agaaagtcga 6420
aaaggggaag tcacgcctga ttgaagccag ttccttgaac gactcagttg ccatgagggt 6480
tgcctttgga aatctctacg ctacatttca taacaatcca ggcacagcaa ctggtagtgc 6540
agttggttgt gatccagata tattctggtc aaaaatccct attttgttag atggagagat 6600
ttttgctttt gattacactg gttatgacgc tagtttatca ccagtgtggt ttgcctgttt 6660
gaaaaaggtt ctgattaaat taggttacac ccaccaaaca tcttttatag attatctatg 6720
ccactcagtg catttgtaca aggatagaaa atatgtagtt aatggtggaa tgccctctgg 6780
ttcttcaggt actagtatat ttaacactat gattaataac ataattataa gaactttatt 6840
aattaaggtt tacaaaggca tagatctgga ccagtttaaa atgatagcat acggagatga 6900
tgttattgct agttacccac acaaaattga tccaggttta ttagcagaag caggcaagca 6960
ctatggattg gtaatgacac cagcggacaa aggtaccagt ttcattgaca ctaattggga 7020
aaatgtaact tttttgaaaa gatacttcag agcagatgat caatacccct ttcttataca 7080
tccagtgatg ccaatgaaag agatacatga atctattaga tggactaaag atcccagaaa 7140
cacacaagat catgttagat ccttgtgtta cctggcgtgg cataatggag aagaggctta 7200
caatgaattt tgtagaaaaa ttagaagtgt gcccgtgggg agggcattga cactacctgc 7260
atattctagt cttagacgga aatggttaga ttcgttttag ataactctaa ttgaaaccca 7320
agttacagtt actttcactt agaggtaaat tttggtcact tggggaccaa aaaaaaaaaa 7380
aaaaaaaaaa aaatcccccc caacttcgga ggtcgaccag tactccgggc gaaactttgt 7440
tttttttttt tcccccgatg ctggaggtcg accagatgtc cgaaagtgtc cccccccccc 7500
cccccccccg gcgcggaacg gcggggccac tctggactct tttttttttt tttttttttt 7560
tttttgggga tcggccgcta gcttctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat 7620
acagattaaa tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag 7680
cgcggtggtc ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg 7740
tagtgtgggg tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg 7800
ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga 7860
gtaggacaaa tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc 7920
gggcaggacg cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg 7980
atggcctttt tgcgtttcta caaactcttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 8040
tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 8100
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 8160
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 8220
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 8280
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 8340
cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 8400
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 8460
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 8520
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 8580
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 8640
cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 8700
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 8760
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 8820
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 8880
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 8940
tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 9000
ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 9060
accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 9120
aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 9180
ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 9240
gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 9300
ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 9360
ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 9420
ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 9480
gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 9540
cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 9600
cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 9660
cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 9720
aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 9780
ttctttcctg cgttatcccc tgattcatta atgcaggtca cgatcctttc tggcgagtcc 9840
ccgtgcggag tcggagagcg ctccctgagc gcgtgcggcc cgagaggtcg cgcctggccg 9900
gccttcggtc cctcgtgtgt cccggtcgta ggaggggccg gccgaaaatg cttccggctc 9960
ccgctctgga gacacgggcc ggccccctgc gtgtggcacg ggcggccggg agggcgtccc 10020
cggcccggcg ctgctcccgc gtgtgtcctg gggttgacca gagggccccg ggcgctccgt 10080
gtgtggctgc gatggtggcg tttttgggga caggtgtccg tgtccgtgtc gcgcgtcgcc 10140
tgggccggcg gcgtggtcgg tgacgcgacc tcccggcccc gggggaggta tatctttcgc 10200
tccgagtcgg cattttgggc cgccgggtta tt 10232
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctagctagct taatacgact cactataggt taaaacagct ctggggttg 49
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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atagtttagc ggccgcgtca gtaccggtgg ttactatgtt gtg 43
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtacgtaccg gttcaatgcg agatttggac 30
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<212> DNA
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actgacaccg gtttgtttaa taatacacgg c 31
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<212> DNA
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ttttcctttt gcggccgctt tttttttttt tttttttttt tttggtcccc aagtgaccaa 60
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctcatggtga aaaccatcag acgctagaca tgaac 35
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gttcatgtct agcgtctgat ggttttcacc atgag 35
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caaatggcat ggagcgactc agagttgaca tatc 34
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gatatgtcaa ctctgagtcg ctccatgcca tttg 34
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gcatggtgtg tcggaaacgt tagtggagaa ttttc 35
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gaaaattctc cactaacgtt tccgacacac catgc 35
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atcgcgtctc ctattttaaa acagctctgg ggttg 35
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atcgcgtctc cgggattttt tttttttttt tttttttttt ggtccccaag tgaccaaaat 60
ttacc 65
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ggtgaaaacc atgagacgct agacatgaac aaggtg 36
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<213> 人工序列()
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caccttgttc atgtctagcg tctcatggtt ttcacc 36

Claims (10)

1.一种人类肠道病毒D68型的感染性克隆，其特征在于，所述感染性克隆采用RNA聚合酶I系统，通过插入EV-D68病毒Fermon株的全长cDNA获得，所述EV-D68病毒Fermon株的全长cDNA的1882和2593位的BsmB1酶切位点进行不改变氨基酸的突变，所述EV-D68病毒Fermon株的全长cDNA的两端插入BsmB1酶切位点。
2.根据权利要求1所述的感染性克隆，其特征在于，所述感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或与其具有至少80％同一性，优选至少90％同一性的核苷酸序列；
优选地，所述感染性克隆的骨架载体含有hPolI序列和mTer序列。
3.一种构建如权利要求1或2所述的感染性克隆的方法，其特征在于，通过分段RT-PCR法获得EV-D68毒株Fermon的全长基因组cDNA序列，敲除基因组394、1882和2593位三个BsmB1酶切位点，在全长基因组cDNA序列两端插入BsmB1酶切位点，克隆到带有hPolI序列和mTer序列的质粒中，再将394位点进行回复突变，即得到感染性克隆重组质粒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分段RT-PCT的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-7所示；
优选地，所述敲除基因组394、1882和2593位三个BsmB1酶切位点的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8-13所示；
优选地，所述在全长基因组cDNA序列两端插入BsmB1酶切位点的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14-15所示；
优选地，所述回复突变的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:16-17。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以从EV-D68病毒Fermon株提取的RNA为模板，反转录得到cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，分三段RT-PCR法获得EV-D68毒株Fermon的全长基因组cDNA序列F1、F2和F3三个片段；
(3)将步骤(2)扩增出的三个片段构建到同一个亚克隆中，突变亚克隆中的BsmB1酶切位点；
(4)用双酶切的方法将亚克隆上的片段改造到真核表达载体pHH21上，再将394位点进行回复突变，得到重组质粒，即为人类肠道病毒D68型感染性克隆。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述反转录程序为52-58℃25-35min，82-88℃3-8min，优选为55℃30min，85℃5min；
优选地，步骤(3)所述亚克隆采用的载体为pcDNA3.1；
优选地，步骤(3)所述突变的PCR的条件为92-98℃15-25s，52-58℃15-25s，70-75℃3-8min，15-23个循环，优选为95℃20s，55℃20s，72℃5min，18个循环。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的肠道病毒68型感染性克隆。
8.如权利要求1或2所述的人类肠道病毒D68型感染性克隆在制备病毒及其衍生物的应用；
优选地，将所述人类肠道病毒D68型的感染性克隆转染易感细胞，获得拯救病毒及其衍生物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述易感细胞为横纹肌瘤细胞和/或人源胚胎肾细胞，优选为横纹肌瘤细胞。
10.如权利要求1或2所述的人类肠道病毒D68型的感染性克隆在制备抗病毒和/或肿瘤药物及疫苗中的应用。
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