CN102212554A

CN102212554A - 肠道病毒71型感染性克隆及构建方法

Info

Publication number: CN102212554A
Application number: CN2011100822568A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 李建强; 曹伟军; 杨帆; 王玉琳; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-04-24
Filing date: 2011-04-24
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2031-04-24
Also published as: CN102212554B

Abstract

本发明公开一种肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法。本发明的肠道病毒71型感染性克隆的构建方法是：从EV17病毒毒株提取的RNA为模板，用下述三对引物分别扩增出L1、L2和L3三个片段；再将L1片段经酶切后与真核表达载体连接，再转化至大肠杆菌中获得亚克隆质粒PL1，再将经PL1质粒与L2片段经酶切后连接转化为质粒PL2，再将质粒PL2与L3片段经酶切后连接转化，获得含L1、L2和L3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒；再将重组质粒转染至非洲绿猴肾细胞宿主细胞，得到EV711型感染性克隆。

Description

肠道病毒71型感染性克隆及构建方法

技术领域

本发明涉及一种正链RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法。

背景技术

由肠道病毒71型(Enterovirus type 71；EV71)引起的婴幼儿手足口病常形成大范围爆发流行，其主要临床特征为发热和手足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者还可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等致命性并发症。手足口病四季均发病，人群对引起手足口病的肠道病毒普遍易感，但病毒隐性感染与显性感染之比为100∶1，成人大多已通过隐性感染获得相应抗体，因此，手足口病患者主要为学龄前儿童。

目前国内对EV71引起的手口足病尚无有效的治疗药物和疫苗，主要依靠预防综合防治措施。2008年以来EV71在我国大陆广泛流行，疫情在全国各地蔓延开来，其来势更汹涌、更严重，EV71导致的疾病给家庭和社会带来了沉重的负担。因此需要建立感染性克隆，特别是迫切需要利用本土流行毒株构建感染性克隆，来研究其致病机理、病毒变异与毒力关系，并用于制备疫苗。这一工作显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明目的之一是提供一种构立EV71感染性克隆的方法；本发明目的之二是在前述基础上提供一种针对正链RNA病毒高效拯救系统；本发明目的之三是在前述基础上提供一种EV71病毒的cDNA克隆的重组质粒。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

本发明的肠道病毒71型感染性克隆的构建方法是：

a.以从EV17病毒毒株提取的RNA为模板，用下述三对引物分别扩增出L1、L2和L3三个片段，所用的三对引物为：

L1上游引物：

atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtc

L1下游引物：gaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaag

L2上游引物：ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagat

L2下游引物：tttgagatctgattctctagaagtggcagctgt

L3上游引物：tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaat

L3下游引物：ttttctagagcggccgct₃₈；

b.将L1片段经酶切后与真核表达载体连接，再转化至大肠杆菌中获得亚克隆质粒PL1，再将经PL1质粒与L2片段经酶切后连接转化为质粒PL2，再将质粒PL2与L3片段经酶切后连接转化，获得含L1、L2和L3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒；

c.将b所得到的含L1、L2和L3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒转染至非洲绿猴肾细胞宿主细胞，得到EV711型感染性克隆。

本发明的肠道病毒71型感染性克隆的构建方法中所用真核表达载体为pcDNA3.1(+)，所用的大肠杆菌为JM109；如此得到的三个亚克隆质粒分别是pPL1质粒、pPL2质粒和pPL3质粒；所得到的含L1、L2和L3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒为pPev3.1(+)重组质粒。

以前述优选方式得到的全基因组cDNA克隆的重组质粒为pPev3.1(+)重组质粒。

EV71是小RNA病毒科肠道属中的一员，根据衣壳蛋白VP1区的核苷酸序列的不同，EV71可以分为A、B、C三个基因型，其中B型和C型又进一步划分为B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3、C4和C5亚型，而C4亚型又细分为C4a和C4b亚群。EV71基因组为长度约7.5nts的单股正链RNA，病毒在复制过程中不经历DNA中间体，而常规基因工程操作技术都是在DNA分子水平上进行操作的，对EV71的分子病毒学领域的相关研究因此受到限制。本发明是利用EV71病毒的全长cDNA为模板，体内或体外转录出感染性的RNA分子，以拯救出RNA病毒。感染性克隆是将病毒DNA逆转录为cDNA，借助载体构建病毒的全长cDNA分子克隆，同时将RNA聚合酶的启动子调控元件也导入该分子克隆中，由含病毒基因组cDNA的质粒获取RNA病毒的一项技术。由于最终获取的RNA病毒来源于cDNA克隆，通过人为加入的DNA环节，实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种修饰或改造，然后通过拯救病毒的表型变化来判定这些基因操作的效果，从而为筛选无神经毒或低神经毒的EV71基因工程疫苗毒株提供条件，同时也可为研究RNA病毒的致病机制、致弱机理提供便利。

本发明有如下优点：

1)根据通过分子克隆技术获得的EV71全基因组序列，所设计的特异性引物可扩增覆盖整个基因组；

2)本发明以EV71病毒的RNA为模板，反转录合成cDNA，同时，利用带修饰的特异性引物分别扩增覆盖基因组的3个片段，获得的三个片段的cDNA两端分别含有不同的酶切位点，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收后，可分别与克隆载体连接，建立亚克隆；

3)为了利用单一限制性酶切位点连接病毒全长基因，本发明采用沉默突变，在所述基因组第4240位人为引入XbaI位点，同时这一位点也可作为区别于亲本毒的分子标记；

利用双酶切方法将三个片段的cDNA依次定向克隆至改造的pcDNA3.1(+)载体，构建了含EV71基因组全长cDNA分子克隆的重组质粒pPev3.1(+)。以非洲绿猴肾细胞(Vero)为受体细胞，获得所需感染性克隆。

上述构建过程中，用RT-PCR方法分三个片段扩增EV71的全长cDNA时，在基因组5`非编码区前引入了聚合酶I和聚合酶II双启动子的核心序列，为了利用单一酶切位点连接病毒全长基因，采用沉默突变的方法，在不改变编码氨基酸的前提下通过扩增引物将鸟嘌呤(G₄₂₄₀)变成胸腺嘧啶(T)从而引入XbaI酶切位点，并可以作为区别于亲本毒的遗传标记；

5)本发明构建EV71全长感染性cDNA克隆的方法分三个片段扩增病毒的基因组，所扩增的片段相对较短，且采用适合长片段扩增、性能优良的聚合酶Premix

Version 2.0(TaKaRa公司)进行扩增，使用时只需在制品溶液中加入模板和引物便可进行PCR反应，大大简化了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染。从而能够更好的保证所扩增片段序列的保真性，病毒基因组位于含聚合酶I和聚合酶II双启动子真核质粒的下游，3`末端具有终止转录翻译的终止子和限制性内切酶NotI位点，能够保证感染性克隆在受体细胞内包装出高丰度高质量的病毒粒子，因此用本发明方法所构建EV71的感染性克隆高效稳定，由该拯救系统所拯救的EV71在宿主细胞上的生长特性、致病性与亲本毒具有较高的一致性。

6)本发明方法操作简便，成功率高，难度较小，可成功构建我国大陆EV71流行毒株的感染性cDNA分子克隆。

附图说明

图1是表示覆盖基因组的3个cDNA片段，在图1中，1：L1片段扩增产物；2：L2片段扩增产物；3：L3片段扩增产物；M：500-12000bp的DNA marker。；

图2是表示构建全长cDNA的技术流程图；

图3是含病毒全长cDNA重组质粒的鉴定；

图4沉默突变引入的XbaI位点的分子标签序列；

图5在Vero细胞上产生的细胞病变图；

图6感染Vero细胞的间接免疫荧光检测结果。

具体实施方式

以下是本发明的一个实施例，这一实施例所用的EV71病毒毒株系2010年分离自兰州市临床诊断手口足病患儿的粪便，并经人肠道通用病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus types A 16，CA16)和肠道病毒EV71型RT-PCR特异性核酸检测以及实时荧光定量PCR平行检测后得到的阳性标本，命名为EV71Lanzhou/01，分子流行病学基因分型为C4a型，EV71 Lanzhou/01毒株保藏于兰州生物制品研究所，冻存于-70℃。本实施例用于说明本发明，但本发明并不局限于本实施例。

实施例1.EV71病毒基因组的获得。

根据对EV71病毒的分子生物学研究，参考GenBank(GenBank登录号：GU396280)公开的相关序列，通过比较分析后，设计出带修饰扩增覆盖全基因组的三对特异性引物L1上、下游引物，L2上、下游引物和L3上、下游引物，这三段特异性引物分别是：

L1上游引物：

atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtc

L1下游引物：gaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaag

L2上游引物：ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagat

L2下游引物：tttgagatctgattctctagaagtggcagctgt

L3上游引物：tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaat

L3下游引物：ttttctagagcggccgct₃₈；

在以上的特异引物中，扩增L1片段所用上游引物L1中加入PacI酶切位点和含聚合酶I、聚合酶II双启动子，以保证在转录时产生高丰度高质量的RNA，其下游引物L1`含HindIII酶切位点；扩增L2片段所用上游引物L2含HindIII酶切位点，其下游引物L2`和扩增L3片段的上游引物L3中引入点突变，扩增后将基因组第4240位的G突变为T，突变后密码子CTT与突变前密码子CTG均编码亮氨酸，为同义突变，获得的序列tctaga为限制性内切酶XbaI的识别序列，能够用于基因组全长cDNA的拼接，同时也作为区别于亲本毒的遗传标记；扩增L3片段所用下游引物L3`含NotI酶切位点和38nt的poly(A)。

从临床诊断手口足病患儿的粪便中得到的EV71病毒毒株中得到RNA，以其为模板，用上述特异性引物分别进行扩增，得到基因组的L1、L2和L3三个片段，大小分别为1448bp、2906bp和3197bp(图1)，与预期大小相符。以上述EV71病毒RNA反转录后的cDNA为模板，分别以L1上、下游引物，L2上、下游引物，L3上、下游引物为扩增引物，使用适合长片段扩增、性能优良的Premix

Version 2.0(TaKaRa公司)DNA聚合酶扩增出上述L1、L2和L3三个片段。按照产品说明书构建50μL反应体系，三个片段的扩增条件分别为片段L1：94℃5min，94℃30s，57℃30s，68℃1min30s，go to 2，72℃8min；片段L2：94℃5min，94℃30s，57℃30s，68℃3min，go to 2，72℃8min；片段L3：94℃5min，94℃30s，57℃30s，68℃3min20s，go to 2，72℃8min；PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收，获得上述三个片段的DNA。扩增产物的电泳结果如图1所示。

将上述L1，L2和L3三段分别进行切胶回收，分别与pMD20-T Vector连接，转化感受态细胞以及阳性克隆筛选等本领域技术人员的常规操作，将筛选出的三个片段的阳性克隆pMD-L1、pMD-L2和pMD-L3送交测序，测序获得的三个片段再通过相应的软件进行拼接，最终获得EV71病毒Lanzhou/10株的基因组。

EV71病毒基因组全长cDNA克隆的构建。

将pcDNA3.1(+)载体与前述得到的L1片段分别用PacI/HindIII双酶切后，连接转化至JM109，测序鉴定阳性克隆，获得含L1片段的亚克隆质粒pPL1；将pPL1与实例1得到的L2片段分别用HindIII/XbaI双酶切后，连接转化至JM109，测序鉴定阳性克隆，获得含L1和L2片段的亚克隆质粒pPL12；将pPL12与实例1得到的L3片段分别用XbaI/NotI双酶切后，连接转化至JM109，测序鉴定阳性克隆，获得含L1、L2和L3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒pPev3.1(+)，参见图2所示。

将上述所构建全基因组cDNA克隆的重组质粒pPev3.1(+)各20μL分别用XbaI和PstI进行酶切鉴定，37℃2.5h，用0.8％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分析，用PstI酶切后产生4个片段分别为4672bp、4287bp、2753bp和1889bp；用XbaI酶切后产生一个片段大小为13601bp，表明重组质粒含有第4240位突变形成的XbaI酶切位点，酶切鉴定结果表明，酶切所得的片段与预期结果一致，对其进行测全序。在图3中，1：重组质粒pPev3.1(+)XbaI酶切产物；2：重组质粒pPev3.1(+)PstI酶切产物；3：500-12000bp的DNA marker。初步证明成功克隆到了EV71基因组的全长cDNA。本实施例中所涉及的双酶切、连接和转化等步骤，均采用本领域的常规操作。

病毒拯救和鉴定

用Promega公司生产的

SV Genomic DNA Purification System制备纯化由实例2得到的含全基因组cDNA的重组质粒pPev3.1(+)。待Vero单层生长至80％～90％满时用于转染。转染时各取24μL重组质粒pPev3.1(+)和30μL Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)脂质体介导转染Vero细胞。同时设立脂质体对照和正常细胞对照。转染后4-6h吸去细胞上清，加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，置37℃CO₂继续培养5d后收获病毒，反复冻融3次后连续在Vero上传代，待第二代72h出现特征性细胞病变(CPE)(如图5所示)。在图5中，A：拯救病毒感染Vero细胞出现的CPE的图片；B：正常对照细胞图片。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光等进行鉴定(如图4，6所示)，均证实成功拯救到了EV71 Lanzhou/01株病毒。图4为沉默突变引入的XbaI位点的分子标签序列(下划线部分为XbaI位点序列，黑三角为相应的突变位点)；在图6中，A：为拯救病毒感染Vero细胞的免疫荧光图片；B：为正常对照细胞的免疫荧光图片。本实施例中所涉及的RT-PCR、间接免疫荧光等步骤，均采用本领域的常规操作。

由上步骤所得到的EV7 Lanzhou/01感染克隆毒株全基因序列见SEQ ID8，而用引物L2/L2`扩增的产物L2的序列见SEQ ID7。

Claims

1.肠道病毒71型感染性克隆的构建方法，其特征是：

L1上游引物：

atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtc

L1下游引物：gaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaag

L2上游引物：ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagat

L2下游引物：tttgagatctgattctctagaagtggcagctgt

L3上游引物：tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaat

L3下游引物：ttttctagagcggccgct₃₈；

2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型感染性克隆的构建方法，其特征在于所用真核表达载体为pcDNA3.1(+)，所用的大肠杆菌为JM109；所得到的三个亚克隆质粒分别是pPL1质粒、pPL2质粒和pPL3质粒；所得到的含L1、L2和L3片段的全基因组cDNA克隆的重组质粒为pPev3.1(+)重组质粒。

3.由权利要求2所得到的全基因组cDNA克隆的重组质粒为pPev3.1(+)重组质粒。