CN103374549B

CN103374549B - 一株新型ev71病毒及其应用

Info

Publication number: CN103374549B
Application number: CN201210127456.5A
Authority: CN
Inventors: 彭涛; 马书智; 廖鹏云; 王弋; 刘钿莲
Original assignee: SOUTHERN CHINA UNITED VACCINE INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: Guangdong Southern China vaccine Limited by Share Ltd
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-04-26
Also published as: CN103374549A

Abstract

本发明公开了一株新型的EV71病毒，其全基因组长7405bp，其序列如SEQ？ID？NO：1所示。本发明的病毒株，可以感染ICR、KM、BALB/c、NIH小鼠，用大于1×10²～1×10⁷TCID50的病毒量能够引起1～17日龄小鼠的发病或死亡，给药途径为腹腔注射、脑腔注射、灌胃，症状表现为典型的EV71病毒感染症状，根据严重程度分为0级：未发病；1级：运动不协调、四肢无力；2级：运动减少、前肢或后肢麻痹；3级：四肢瘫痪、濒临死亡；4级：死亡。可以方便地建立各种动物评价模型，如手足口病疫苗免疫原性评价动物模型、EV71治疗性药物和治疗性疫苗的动物评价模型。

Description

一株新型EV71病毒及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型EV71病毒及其应用。

背景技术

流行病学

手足口病是一种全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道，最早于1957年由新西兰的Seddon加以描述。1974年Schmidt首次从一个脑患儿(1969年)的粪便样品本中分离鉴定到EV71，其后3年中，在加利福尼亚23例重症神经系统患者中再次分离到该病毒。而且随后该病变化谱越来越广，症状从发热、手足口病、疱疹、无菌性脑膜炎、麻痹、脑炎，甚至死亡。

1975年，保加利亚超过750人发病，其中44人死亡。

1978年，日本出现大规模的流行，共发现病例36，301例，除少数无菌性脑膜炎外，主要表现为HFMD。

1997年后，亚太地区发生数次EV71引起的大流行和地域性流行，1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，1998年在日本、马来半岛和新加坡分别报道了EV71引起的手足口病暴发疫情。1998年我过台湾发生迄今最大的HFMD流行，总共报告129，106例HFMD或疱疹性烟峡炎病例。后来在澳大利亚、新加坡、越南、马来西亚均有大规模HFMD暴发的报告。

我国大陆地区1981年在上海首次发现手足口病，自1999年以来，我国广东、福建、上海、重庆等地报告了EV71是HFMD的的主要病原之一。2000年以后我国每年都有大规模的EV71手足口病的报道，2008年在安徽阜阳大规模暴发，当年共报道手足口病病例17.6万例，主要病原为EV71。2010年和2011年，中国CDC发布的报告，手足口病的暴发1,619,706例和1,774,669例，死亡人数分别为509例和905例。

人类是EV71病毒唯一的自然宿主，主要的传染源为EV71患者、健康携带者和隐形感染者，由于EV71的传染性强，传播途径复杂，病原在自然条件下的存活时间较长，流行强度大，传播快，在短时间内可造成大面积流行，其社会危害相当严重。

病原学

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。引起HFMD和中枢神经系统疾病，为危害程度仅次于脊髓灰质炎病毒的嗜神经性肠道病毒。该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。如同其他肠道病毒属成员一样，EV71型病毒基因组编码的分子量分别为34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1(α)、VP2(β)、VP3(γ)、VP4(δ)，构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。EV71病毒由于没有类脂膜，所以它对乙醚、脱氧胆酸盐、去污剂以及弱酸有抵抗性。此外，该病毒还能抵抗70％乙醇和5％甲酚皂溶液等常见的消毒剂，但是高温(56℃，30min)处理和紫外线照射可以很快将病毒灭活，它对各种氧化剂如高锰酸钾、双氧水、漂白粉等也很敏感。

EV71病毒的基因组为含有大约7411个核苷酸(7423/MS/87株)的单股正链RNA，腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(A+U＝52.8)。RNA中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5′和3′非编码区(UTRs)，它与其他肠道RNA病毒一样，在3′末端有多聚腺苷酸(polyA)尾，而其5′末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。

EV71的疫苗研究进展

目前公开发表的EV71候选疫苗种类包括全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒(VLPs)、合成多肽疫苗、DNA和病毒及细菌载体疫苗等。全病毒灭活疫苗由于可借鉴脊髓灰质炎、甲型肝炎疫苗等肠道病毒疫苗的经验，工艺较为成熟，成为目前优先开发的疫苗类型，而其他类型的疫苗在全世界仍处于科学阶段，未见研发成功的报道和产品。

EV71疫苗多选择全病毒灭活疫苗工艺，采用的细胞基质为非洲绿猴肾(Vero)传代细胞或人二倍体细胞，采用生物反应器、细胞工厂或转瓶工艺生产。目前我国大陆地区已有3家企业建立中试的生产工艺和质量标准，完成疫苗临床试验前研究资料，进入临床试验审批阶段，有1～2家已进入III期临床试验阶段。

动物模型的研究

目前缺乏成熟稳定的动物模型是造成手足口病治疗药物及疫苗研发的障碍之一，国内外采用的动物模型都在4日龄以内的新生鼠，这种模型存在不稳定，个体差异比较大的问题，给EV71的致病机理、临床治疗以及疫苗的研发带来了很大的困难，因此，稳定的EV71感染动物模型在疫苗免疫原性评价和手足口病治疗性药物的研发方面就显得尤为重要。中国大陆地区的EV71流行株主要属于C4亚型，而实验动物普遍对该毒株不敏感，导致多数病毒株感染动物后，不能表现出明显的临床症状。

EV71感染的1日龄龄新生ICR或BALB/c小鼠是最为常见的EV71模型动物。临床分离毒株对肌肉组织的噬性高于脑组织，临床分离株经过小鼠体内扶强后，可以引发神经症状，甚至可以感染1周龄或两周龄的小鼠。

Chumakov等使用B1亚型的保加利亚临床分离株感染1日龄的新生小鼠，可引发瘫痪和肌炎及肌纤维坏死。Arita等将Bl亚型的EV71毒株在NOD/SCID小鼠颅内传代扶强，分离到了一株NOD/SCID小鼠适应毒株，该毒株感染3～4周龄的NOD/SCID小鼠后，可以使其表现出后肢麻痹。

Chua等将B3亚型的澳大利亚临床分离株在BALB/c小鼠颅内扶强，扶强后的毒株感染1～7日龄BALB/c小鼠，引发了严重的致死症状，骨骼肌是病毒的主要复制位点，病毒侵染引发严重的坏死性肌炎。

Chan等利用用B3和B4亚型的EV71作为出发毒株，建立了1日龄ICR小鼠的感染模型，对小鼠进行颅内病毒感染后，小鼠均出现明显的体重增长减缓，而B3亚型毒株感染2d后可观察到嗜睡和运动不协调症状，部分小鼠四肢肿胀并伴随死亡，未发现后肢麻痹症状，而未死亡的小鼠在感染6d后，上述症状全部消失，恢复正常。

Chen等用C2亚型的小鼠适应株通过灌胃感染1日龄的ICR小鼠，2d后，小鼠可出现皮肤病变，一般在4～7d后出现后肢麻痹，7～9d后死亡，病理观察发现了脑部的淋巴细胞浸润。随后，Wang等列将上述C2亚型毒株在1日龄的ICR小鼠颅内4次传代扶强后，得到MP4菌株。扶强菌株在体内外的毒力均比出发菌株增强，且扶强后的毒株可通过灌胃法感染7日龄ICR小鼠，导致其后肢麻痹，并在5～9d内死亡。病理观察到了感染小鼠的脑干与脊髓中神经元消失和凋亡，四肢肌肉大面积坏死。感染早期，可在小鼠的小肠内检测到病毒复制，而病毒的主要复制位点是在肌肉、脊髓与脑中。同时，MP4感染小鼠后，可发生同窝之间的交叉感染现象。

Ong等使用B3亚型的小鼠适应株，通过灌胃与注射感染2周龄的ICR小鼠，小鼠感染后表现出脑脊髓炎等与人类似的神经症状，感染小鼠的前角神经元、三叉神经运动核和脑干网状结构的神经元中病毒数量最多，脑的其他部位也有少量的神经元被感染。该模型是迄今为止，能感染EV71病毒的年龄最大的正常小鼠。wu等将新分离的EV71的neu毒株在Vero细胞中进行两轮培养，得到YN3毒株，其通过腹腔感染新生ICR小鼠时表现出较高的毒力，可致新生的ICR小鼠后肢麻痹，最终死亡。

刘刚等报道，用1000TCID50剂量腹腔注射1日龄新生小鼠，感染后11天内小鼠死亡，攻击4日龄小鼠感染后16天死亡，攻击7和10日龄小鼠，在感染后21天的存活率为60％和90％，攻击14日龄小鼠，观察期内未见死亡。有研究经腹腔攻毒，然后从脑组织分离1代病毒，经过4次反复传代的病毒MP4具有更强的毒力，经口服途径感染小鼠可以模仿自然感染过程，早期感染小鼠出现皮疹，晚期出现后肢瘫痪等神经统症状。

李鹏等报道利用MA104细胞制备EV71病毒液，脑腔接种7日龄Balb/C小鼠20ul病毒液，7天内可引起100％的小鼠死亡。

猕猴感染模型

口服EV71病毒不能使猕猴产生严重的神经症状，猕猴免疫与攻毒多使用椎管或静脉注射接种，Chumakov等使用保加利亚临床分离株感染猕猴之后，可使猕猴发生瘫痪，神经系统出现类似于脊髓灰质炎的病变。Nagata等分别用5种EV71的临床分离株(患者分别患有脑炎，脑膜炎和手足口病)，通过椎管注射对猕猴(5～13岁，成年雌性)进行病毒感染，1～6d后，猕猴均表现出了神经症状：迟缓性麻痹、震颤和共济失调，免疫组化证实了病毒在脊髓、脑干、小脑皮层、齿状核和大脑中的复制。随后，Nagata等进一步建立了静脉注射感染猕猴的模型，猕猴(6～17岁，成年雌性)感染病毒后，具有与人脑炎类似的临床体征与神经病理表现，包括震颤、共济失调和脑水肿，但没有发生诸如肺水肿和心脏衰竭之类的神经源性并发症。值得注意的是，许多EV71病毒的临床分离株对猕猴感染时，表现出了较低的神经毒性。

Arita等报道可通过皮下或脊髓接种的方式感染EV71病毒并出现典型的神经系统症状，用于药物和疫苗的安全评价和保护效果验证，但应用受限，适应于毒种研究。目前国内未见使用猴建立感染模型的报道。

免疫保护模型

预防EV71病毒感染的疫苗，均处于研究阶段，目前尚无临床上可以使用的疫苗。猕猴模型中，因为可以感染病毒的猕猴年龄较高，可以用做疫苗的自体免疫评价。Arita等使用减毒的A型EV71病毒做为疫苗，对猕猴进行免疫，45d后经静脉注射进行攻毒，免疫后的猕猴没有表现出症状，且其血清对不同亚型的EV71毒株(A、B1、B4、C2和C4)具有广谱性的中和作用。然而，从减毒毒株接种的猕猴脊索中，分离到了活病毒，表明弱毒株仍具有一定的神经侵染性，并引发了猕猴的震颤等微弱的神经症状。

由于小鼠对EV71病毒的敏感期较短，限制了其在疫苗评价中的使用。目前，国际上多采用对雌鼠或母鼠免疫，疫苗产生的抗体可以通过胎盘屏障传递给幼鼠，随后对幼鼠进行病毒感染，从而间接的评价母源抗体对幼鼠的保护作用。使用此类方法评价的疫苗，包括灭活的病毒、病毒结构类似物、VPl蛋白及VPl的DNA疫苗。Wu等比较了灭活全病毒疫苗、VPl的DNA疫苗和VPl蛋白对雌鼠免疫后，母源抗体对幼鼠的保护能力。雌鼠经灭活病毒免疫后，再交配产下的的幼鼠，经2300LD50的病毒剂量感染时，存活率达到80％，而母鼠经VPl蛋白的DNA疫苗和VPl蛋白免疫后产下的的幼鼠，在230LD50的病毒剂量感染时，存活率分别为40％和80％，指出灭活全病毒作为疫苗具有最佳的保护效果。Chung等表达并纯化了EV71病毒类似物VLP，VLP模仿了全病毒的形状、衣壳蛋白结构和蛋白组成。免疫后的BALB/c母鼠产下的幼鼠，在受到EV71病毒(1000LD50)攻击时，存活率可以达到89％，其保护活性大于变性的VLP蛋白和热灭活的EV71病毒。Ong等使用2周龄ICR小鼠的感染模型，对甲醛灭活的全病毒疫苗进行了自体免疫评价。对1日龄的新生鼠进行初次免疫，7d后进行加强免疫。加强免疫7d后的幼鼠进行病毒感染，结果均未表现出症状，各组织也未检测到病毒。

利用新生小鼠可感染EV71致死，通过接种疫苗之后受孕的方式，使新生小鼠获得保护性母传抗体，再进行病毒攻击，可作为评价疫苗的保护效果一种方式，但是否可类推尚需进一步研究，国内已有一家单位正尝试采用该方法进行评价。

药物筛选

抑制EV71病毒的药物研究，多处于细胞水平上，在动物模型中对于药物治疗效果进行验证的报道并不多见，因为感染病毒的幼鼠存在年龄过低、感染周期短和不宜进行给药等缺点。Li等对12～14d的ICR小鼠进行腹腔注射感染病毒，感染后2h开始腹腔注射利巴韦林药物，每日剂量为100mg/(kg·bw)，持续给药9d，发现利巴韦林可以通过抑制组织内的病毒复制，来降低小鼠在面临病毒感染时的发病率、致死率(致死率降低到30％)和麻痹后遗症。Liu等研究了I型IFNs对病毒感染的幼鼠的治疗效果，对3日龄的ICR小鼠进行腹腔注射攻毒，感染2～3d后注射地塞米松(I型IFNs的抑制剂)，会加剧临床症状，增加组织内病毒滴度。而在病毒感染前12h注射IFN素的诱导剂，则会提高成活率和降低组织内病毒滴度。注射I型IFN的抗体，则会提高死亡率和组织内病毒滴度。并且，在感染病毒后的3d内，连续3d注射IFN-a，则会使幼鼠存活。Weng等发现，牛乳铁蛋白在小鼠体内具有抗病毒效果，它可以延缓麻痹，降低死亡率。但是治疗组的死亡率依然达到了70％，表明其体内治疗效果微弱。

目前手足口病疫苗尚无有效的动物感染模型和免疫保护模型，无法准确评价手足口病疫苗的免疫原性和对手足口病的治疗效果。为加快EV71病毒的研究进展，更快、更好地开发出对抗EV71病毒的药物或疫苗，迫切需要一种新型的EV71病毒作为动物评价模型的攻击毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的EV71病毒(EV71-C2株)。

本发明的另一个目的在于提供上述病毒在构建动物评价模型中和体外评价模型中的应用。

构建动物评价模型，将EV71病毒注射至实验动物体内，引起动物发病和死亡。通过本发明的有益效果是：

本发明的病毒株(EV71-C2株)，可以感染ICR、KM、BALB/c、NIH小鼠，用大于1×10²～1×10⁷TCID50的病毒量能够引起1～17日龄小鼠的发病或死亡，给药途径为腹腔注射、脑腔注射、灌胃，症状表现为典型的EV71病毒感染症状，根据严重程度分为0级：未发病；1级：运动不协调、四肢无力；2级：运动减少、前肢或后肢麻痹；3级：四肢瘫痪、濒临死亡；4级：死亡。可以方便地建立各种动物评价模型，如手足口病疫苗免疫原性评价动物模型、EV71治疗性药物和治疗性疫苗的动物评价模型。

利用该毒株，申请人建立了EV71疫苗的评价模型，用一定量的EV71纯化抗原免疫7日龄小鼠，以PBS为对照，14日龄大于2～5×10⁶TCID50攻毒，10天内对照能够引起100％的发病和死亡，处理均能够达到100％保护。利用该动物模型可以加深对EV71病原学的了解，促进肠道病毒EV71型病毒的致病机制的研究，用于高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制。

附图说明

图1是本发明病毒株滴度的稳定性研究图。

具体实施方式

病毒株的分离筛选：

Vero细胞培养方法

(1)Vero细胞复苏(ATCC编号：CCL-81)：从液氮中拿出一支冻存的细胞，39℃温水中迅速融化后，将细胞悬液按约1.0×10⁶个/ml接种转入175cm²的方瓶中，逐步滴加培养基(含10％胎牛血清(体积/体积)的M199培养基(M199干粉培养基组分见GIBCO培养基手册)至60ml，37℃，5％的CO₂培养箱中培养。

(2)制备24孔板：将(1)的细胞培养72小时，用0.25％的胰酶消化，加入10％血清的M199培养基终止反应，计数后加入培养基使细胞悬液的密度为1.0～2.0×10⁵个/ml，吹打分散均匀，然后24孔板每个孔加入1ml，37℃，5％的CO₂培养箱中培养48小时。

(3)病毒分离、培养、保藏

从医院拿回临床样品，包括咽拭子、肛拭子、血样，长期保存和放置于-20℃，用5000rpm离心15min，用0.22μm的针头滤器过滤除菌，接种于24孔板中，每个孔0.5ml，放置于37℃吸附90min，然后加入含2％胎牛血清的M199培养基0.5ml，在37℃，5％的CO₂培养箱中培养5天，连续盲传3代，第四代出现病变的样品继续传代，未出现病变的舍弃。收集到的样品放置-80℃冰箱保存。

病毒(EV71-C2株)滴度测定

连续传代33代，用TCID50法测定滴度，滴度测定结果表明，连续传代33代，病毒滴度变化见图1；

用TCID50方法测定病毒滴度，具体操作如下：

(1)制备96孔板，细胞消化后，加入M199培养基(10％胎牛血清)，使细胞量达到1～2×10⁵个/ml，37℃，5％的CO2培养箱中培养24小时；

(2)在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-1～10^-8；

(3)将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种200μl；

(4)设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排；

(5)逐日观察并记录结果，观察7天；

(6)结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。

病毒株的测序结果、同源性分析

对分离获得的EV71-C2病毒株进行全基因组测序，发现病毒全基因长7405bp，其基因序列如SEQIDNO：1所示。其序列与GenBank：AEC47477.1、AEC474811、ACD63039.1公开的序列具有较高的相似度。

经检测，该病毒株的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，其特有的氨基酸位点和氨基酸名称如下表所示。

氨基酸位点	氨基酸名称	氨基酸缩写
			218	异亮氨酸	I
416	天冬氨酸	D
			618	苏氨酸	T
765	缬氨酸	V
			860	异亮氨酸	I
878	苏氨酸	T
			944	缬氨酸	V
1050	缬氨酸	V
			1468	异亮氨酸	I
1806	精氨酸	R
			1863	天冬酰胺	N
1919	赖氨酸	K
			1928	缬氨酸	V

基于上述测序结果，本领域技术人员可以使用已知的EV71病毒，合成基因组全序列或者构建cDNA克隆，克隆质粒，体外转染和包装病毒的方法，构建得到本发明所述的新型EV71-C2病毒株。

抗原制备

(1)病毒原液制备

用上述方法分离得到的EV71-GD1株(EV71广东分离株)，利用40层细胞工厂(康宁)放大培养，细胞培养72小时后，接种EV71病毒收获病毒液，按照MOI＝0.1接种病毒液，培养96小时，收获病毒液6L。

(2)灭活处理

用1∶4000的甲醛，37℃，灭活处理72小时，灭活期间每隔12小时震荡一次，使其充分灭活。

(3)澄清过滤和超滤浓缩

利用0.45μl聚醚砜滤芯过滤，去除细胞碎片和大颗粒物质。

利用Millipore公司的0.5平方的PELLICON2超滤系统，安装2块PELLICON2超滤膜包，截留分子量为30KD的滤膜，超滤膜包进行浓缩20～30倍浓缩，获得200～300ml浓缩液。

(4)蔗糖密度离心纯化

利用蔗糖密度离心，30000rpm，5小时，收集35～55％蔗糖密度的样品，脱糖后作为纯化后抗原。

(5)氢氧化铝佐剂吸附抗原

按照氢氧化铝终浓度0.5～0.75mg/ml的量加入氢氧化铝佐剂，1∶1往抗原中加入氢氧化铝佐剂，在室温搅拌吸附2小时，然后分装保存4℃备用。制备得到以下两组抗原：

YP1：纯化后抗原10ml+氢氧化铝10ml；

YP2：(纯化后抗原5ml+PBS5ml)+氢氧化铝10ml。

免疫小鼠制备抗血清

购买6周的KM小鼠(SPF级)，按照0、7、28进行三针免疫，腹腔注射0.5ml/只，每组10只，以PBS免疫组为对照，35天眼球采血，收集血清备用。

血清中和抗体滴度测定

(1)血清按照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024进行稀释，以免疫PBS的为阴性血清；

(2)EV71-C2病毒液稀释成100CCID50/0.05ml；

(3)取无菌的96孔板，拆开包装，做好标记，每个孔中分别加入0.05ml的血清和病毒稀释液，每个稀释度8孔；

(4)盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入37℃5％CO₂孵箱中孵育2h；

(5)另取一块96孔板纵向使用，做100CCID₅₀/0.05ml病毒滴度的核实(每次实验都必须做)。每孔先加病毒稀释液0.05ml，然后从0.1CCID₅₀/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100CCID₅₀/0.05ml；

(6)在孵育期间，用消化液消化细胞(RD细胞)，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×10⁵个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；

(7)孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔(待检标本板)和病毒回滴孔和细胞对照孔(病毒回滴板)分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃CO₂孵箱中孵育培养；

(8)使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100CCID₅₀/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果(约7d)；

按Behrens-公式计算出分离病毒株的CCID₅₀；

logCCID₅₀＝L-d(S-0.5)，其中：

L＝实验中使用的最低稀释度的对数值；

d＝稀释梯度的对数值；

S＝终判时阳性部分的总和(即出现CPE的细胞孔所占的比例之和)；

(9)注意：如果病毒对照结果(病毒回滴)不在32～320CCID₅₀/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验；

(10)结果判定：根据不同稀释度的血清中和后接种的细胞出现CPE的数量，判定血清的中和抗体滴度。

病毒毒力测定

不同品系新生小鼠2日龄新生小鼠敏感性比较

病毒株对2日龄昆明小鼠(KM小鼠)攻毒试验结果

病毒株对2日龄BALB/c小鼠攻毒试验结果

病毒株对2日龄ICR小鼠攻毒试验结果

病毒株对2日龄NIH小鼠攻毒试验结果

对比以上结果发现，不同稀释度的病毒攻击2日龄小鼠后，病毒在稀释度达到10^-6，2日龄KM小鼠累计发病率最高，达到了50％，说明该毒株对2日龄KM小鼠最为敏感。

不同日龄新生小鼠敏感性比较

病毒株对不同日龄KM小鼠攻毒实验结果

动物分组	动物数量(只)	攻毒剂量(μl)	发病动物数(只)	发病率(％)
					3日龄	8	100	8	100
5日龄	8	100	8	100
					7日龄	8	100	8	100
9日龄	8	100	8	100
					11日龄	8	100	8	100
13日龄	8	100	8	100
					15日龄	8	100	8	100
17日龄	8	100	8	100
					19日龄	8	100	1	12.5
21日龄	8	100	0	0
					23日龄	8	100	0	0

病毒株对不同日龄BALB/c小鼠的攻毒实验结果

动物分组	动物数量(只)	攻毒剂量(μl)	发病动物数(只)	发病率(％)
					3日龄	6	100	6	100
5日龄	7	100	7	100
					7日龄	5	100	5	100
9日龄	6	100	6	100
					11日龄	7	100	7	100
13日龄	6	100	6	100
					15日龄	7	100	7	100
17日龄	6	100	2	33.3
					19日龄	8	100	0	0
21日龄	8	100	0	0

病毒株对不同日龄ICR小鼠的攻毒实验结果

动物分组	动物数量(只)	攻毒剂量(μl)	发病动物数(只)	发病率(％)
					3日龄	9	100	8	100
5日龄	8	100	8	100
					7日龄	10	100	8	100
9日龄	5	100	8	100
					11日龄	10	100	8	100
13日龄	9	100	8	100
					15日龄	6	100	5	83.3
17日龄	6	100	0	0
					19日龄	8	100	0	0
21日龄	8	100	0	0

从以上数据看以看出，对不同日龄的小鼠攻毒后100μl病毒原液后，KM小鼠在17日龄仍然能够达到100％的发病率，其中小于15日龄的发病后10天内全部死亡。

不同代次病毒毒力试验

本实验采用攻击14日龄的KM小鼠，病毒株的毒力稳定性如下表所示：

由表中数据可知，病毒在33代以内，本发明获得的的病毒株的毒力稳定，在小鼠上的发病率均能达到100％。

不同浓度不同品系新生小鼠敏感性比较

不同稀释度病毒攻毒实验结果(对14日龄ICR新生鼠)

动物分组	动物数量(只)	攻毒剂量(μl)	发病动物数(只)	发病率(％)
					10^-1	8	100	8	100
10^-2	8	100	4	50
					10^-3	8	100	0	0
对照	8	100	0	0

不同稀释度病毒攻毒实验结果(对14日龄KM新生鼠)

动物分组	动物数量(只)	攻毒剂量(μl)	发病动物数(只)	发病率(％)
					10^-1	8	100	8	100
10^-2	8	100	8	100
					10^-3	8	100	8	100
10^-4	8	100	8	100
					10^-5	8	100	3	37.5
对照	8	100	0	0

不同攻毒方式发病率比较

免疫保护效果研究

不同品系新生小鼠免疫保护研究

YP1对KM小鼠免疫保护试验结果(7日龄免疫，14日龄攻毒)

YP2对ICR小鼠保护试验(7日龄免疫，14日龄攻毒)

从以上可以看出，氢氧化铝佐剂吸附的抗原，按照1/2、1/4、1/8、1/16稀释后，7日龄免疫1针，14日龄腹腔攻毒，对KM和ICR新生小鼠均出现良好的免疫保护效果。

不同剂量抗原免疫保护效果比较

不同稀释倍数YP1抗原对KM小鼠的免疫保护试验结果

(7日龄免疫，14日龄攻毒)

从上表可以看出，YP1在对倍稀释至1/256，7日龄免疫1针，14日龄腹腔攻毒小鼠，1/64稀释的抗原免疫的小鼠发病率为0，免疫保护率达到100％，在1/128稀释的抗原免疫的小鼠发病率增加至62.5％，免疫保护效果明显降低。

<110>广东华南联合疫苗开发院有限公司

<120>一种新型EV71病毒及其应用

<130>

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>7405

<212>DNA

<213>肠道病毒71型

<400>1

ttaaaaagcctgtgggttgcacccactcacagggcccactgggcgcaagcactctggtat60

ctcggtacctttgtgcgcctgttttataccccccccccagtgaaacttaaaagcagtaaa120

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aaagactcctatgctgccacagcaggcaaacagagtctcaagcaggatccagacaagttt900

gcaaatcctgttaaagacatcttcactgaaatggcagcgccactgaagtccccatccgct960

gaggcatgtgggtacagtgatcgagtggcgcaattaactattggcaactccaccatcacc1020

acgcaagaagcggctaacatcatagtcggttatggtgagtggccttcctattgctcagat1080

tctgacgctacagcagtggataaaccaacgcgcccggatgtttcagtgaacaggttttac1140

acattggacactaaattgtgggagaaatcgtctaagggatggtactggaagttcccggat1200

gtgttaactgaaactggggtttttgggcaaaatgcacaattccactacctctaccggtca1260

gggttctgcatccacgtgcagtgcaatgccagtaaattccaccaaggagcactcctagtc1320

gctgtcctaccagagtatgttattgggacagtggcaggcggcacagggacggaagacacc1380

caccccccttacatacagactcaacccggtgccgatggcttcgagttgcaacacccgtac1440

gtgcttgatgctggtatcccaatatcacagttaacagtgtgcccacaccagtggatcaat1500

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tctgccttgaatcattgcaactttggcctgttagttgtgcctattagcccactagattac1620

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ttcgcaggtcttaggcaggcagtcacgcaagggttccctaccgagctaaaacctggcaca1740

aatcaatttttaaccaccgatgatggcgtttcagcacctattctaccaaacttccacccc1800

actccgtgtatccacatacctggtgaggttaggaacttgctagagttatgccaggtggag1860

accattctggaggttaacaatgtgcccacgaatgccactagcttaatggagagactgcgc1920

ttcccggtctcagcacaagcagggaaaggtgagctgtgtgcggtatttagagccgatcct1980

gggcgagatggaccatggcaatccaccttactgggtcagttgtgcggatactacacccaa2040

tggtcaggatcattggaagttaccttcatgtttactggatccttcatggccaccggtaag2100

atgctcatagcctatacaccgccaggaggtcctctgcccaaggaccgggcgaccgccatg2160

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cttgcatggcaaaccgccactaacccctcagtttttgtcaagctgtcagaccctccagcg3000

caagtttcagtgccattcatgtcacctgcgagtgtttatcaatggttttatgacggatat3060

cccacattcggagaacacaaacaggagaaagatcttgaatacggggcatgtcctaataac3120

atgatgggcacgttctcagtgcggactgtggggacctccaagtccaagtaccctttagtg3180

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cagaactacctattcaaagccaacccaaattatgctggcaactccattaagccaactggt3300

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gtttgggaagacagctctcgcgacttgctcgtgtcatccaccaccgcccaaggttgtgat3480

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tacccagttagtttttcaaagcccagtctggtttatgtagaagctagcgagtattaccca3600

gccaggtatcaatcacatctcatgctcgcgcagggtcactcagaacctggtgattgcggt3660

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gttggctttgcagacgtcagagacctcttgtggttagatgaagaagctatggaacagggc3780

gtgtccgactacattaagggtctcggagacgcttttggaacaggcttcactgacgcagtc3840

tcaagggaggttgaagctctcaagaactatcttatagggtctgaaggagtagttgagaag3900

atcttgaaaaatcttattaaactaatctctgcactggtgattgtgatcagaagtgattac3960

gacatggttaccctcactgcaaccttagcgctgataggttgtcatggcagtccttgggct4020

tggatcaaagccaaaacagcctccatcttaggcatccctatcgcccaaaagcagagcgct4080

tcctggctcaagaagttcaatgatatggccaacgccgctaaaggactagagtgggtttcc4140

aacaagatcagcaaatttattgattggcttaaggaaaaaatagtaccagcagccagggaa4200

aaggttgaattcctaaataacttgaaacagctaccactgctagagaatcagatctcaaac4260

ttggaacaatctgctgcctcacaagaggaccttgaagtcatgtttgggaatgtgtcgtac4320

ctggctcacttctgtcgcaagttccaaccgctatacgccacggaagctaaaagagtctac4380

gccctggagaagagaatgaataactatatgcagttcaagagcaaacaccgaattgaacct4440

gtatgtctcattattaggggctcaccaggcactgggaagtctctagccactggtattatt4500

gctcgagcaatcgctgacaagtaccactccagcgtgtactcgctcccaccagacccggat4560

cattttgacggttacaagcaacaggtggttacagtgatggatgatttgtgccaaaacccc4620

gatggtaaggatatgtctttattctgtcaaatggtgtccaccgtagacttcatcccacca4680

atggcttctcttgaggagaagggagtttccttcacctctaagtttgtcatcgcatccact4740

aatgccagtaatatcatagtaccaactgtgtctgattctgacgctattcgccgcaggttc4800

tacatggactgtgacattgaagtgacagactcgtacaaaacagatctaggtagactggat4860

gcagggcgagccgctaaactgtgctctgaaaacaacaccgcaaatttcaaacgttgcagc4920

ccattagtgtgtgggaaagctatccaacttagagatagaaagtctaaagtcagatacagt4980

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acaatcgaggctcttttccaaggtccacccaaattcaggccaattaggattagccttgaa5100

gaaaaaccagccccagacgctattagcgatctccttgctagcatagatagtgaagaagtg5160

cgccagtactgcagggatcaaggctggattattcctgaagctcccactaatgtagagcgg5220

caccttaatagagcggtgcttgtcatgcaatccatcgccacagtagtggcggttgtctcg5280

ttggtgtatgtcatctacaagctctttgcagggtttcagggtgcgtattctggtgctcct5340

aagcaagtgcttaagaaacctgctcttcgcacagcaacagtgcagggcccgagccttgac5400

tttgctctctccctactgagaaggaacatcagacaagtccaaacagaccagggccatttc5460

accatgttgggtgttagggatcgcttagcagtcctcccacgccactcacaacctggcaaa5520

actatttggattgagcacaaactcgtgaacgtccttgatgcagttgaactggtggatgag5580

caaggagtcaacctggaattaaccctcatcactcttgacaccaacgaaaagtttagggat5640

atcaccaaattcatcccagaaaatattagcactgctagtgatgccaccctagtgatcaac5700

acggaacacatgccatcaatgtttgtcccagtgggtgacgttgtgcagtatggctttttg5760

aacctcagtggtaagcctacccatcgcaccatgatgtacaacttccctactaaagcagga5820

cagtgtggaggagtggtgacatctgttgggaaggttgtcggtattcacattggtggcaat5880

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atccagtgggttaagcccaataaagaaactggaaggctcaacattaatggaccaacccgc6000

accaagttagaacctagtgtattccatgacatcttcgagggaaataaagaaccagctgtc6060

ttgcacagtaaagacccccgacttgaggtagattttgaacaggccctgttctctaaatat6120

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aaccaattaaagcaactagaaattaatacctctcaaatgagcatggaggaggcctgctac6240

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ctggggataaagaaaagagacatcttaaaccctaccaccagggacgtgagtagaatgaag6360

ttctacatggacaagtatggtcttgatcttccttactccacttatgtcaaggacgagctg6420

cgctcgattgataaaatcaagaaagggaagtcccgtctgatcgaggccagtagtctaaat6480

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gggacgataactggatcagccgtggggtgtaaccctgacacattctggagcaagctgcca6600

attttgctccctggttcactctttgcctttgactactcaggttatgatgccagccttagc6660

cctgtctggttcagagcattagaattggttcttagggagatagggtatagtgaagaggca6720

atctcactcattgaggggatcaatcacacacatcatgtatatcgtaataagacctattgt6780

gtgcttggtgggatgccctcaggctgttcggggacatccattttcaactcaatgatcaat6840

aacattattatcagagcactgctcataaaaacatttaagggcattgatttggacgagctc6900

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gaactagcaaagactggtaaggaatatggtctgaccatgactcctgctgataaatctcct7020

tgctttaatgaggtcaattggggtaatgcgaccttcctcaaaaggggctttttgcccgat7080

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cgatggaccaaggacgcacgaaacactcaagatcatgtgcggtccttgtgcctcctagca7200

tggcataatggtaaacaagaatatgagaagtttgtgagcacaattaggtctgttccagta7260

ggaagagcgttagctatcccaaattatgaaaatcttagacgcaattggctcgaattattt7320

tagaggttatacacacctcaaccccaccagaaatctggtcgtgaatgtgactggtggggg7380

taaatttgttataaccagaatagca7405

<210>2

<211>2193

<212>PRT

<213>肠道病毒71型

<400>2

MetGlySerGlnValSerThrGlnArgSerGlySerHisGluAsnSer

151015

AsnSerAlaThrGluGlySerThrIleAsnTyrThrThrIleAsnTyr

202530

TyrLysAspSerTyrAlaAlaThrAlaGlyLysGlnSerLeuLysGln

354045

AspProAspLysPheAlaAsnProValLysAspIlePheThrGluMet

505560

AlaAlaProLeuLysSerProSerAlaGluAlaCysGlyTyrSerAsp

65707580

ArgValAlaGlnLeuThrIleGlyAsnSerThrIleThrThrGlnGlu

859095

AlaAlaAsnIleIleValGlyTyrGlyGluTrpProSerTyrCysSer

100105110

AspSerAspAlaThrAlaValAspLysProThrArgProAspValSer

115120125

ValAsnArgPheTyrThrLeuAspThrLysLeuTrpGluLysSerSer

130135140

LysGlyTrpTyrTrpLysPheProAspValLeuThrGluThrGlyVal

145150155160

PheGlyGlnAsnAlaGlnPheHisTyrLeuTyrArgSerGlyPheCys

165170175

IleHisValGlnCysAsnAlaSerLysPheHisGlnGlyAlaLeuLeu

180185190

ValAlaValLeuProGluTyrValIleGlyThrValAlaGlyGlyThr

195200205

GlyThrGluAspThrHisProProTyrIleGlnThrGlnProGlyAla

210215220

AspGlyPheGluLeuGlnHisProTyrValLeuAspAlaGlyIlePro

225230235240

IleSerGlnLeuThrValCysProHisGlnTrpIleAsnLeuArgThr

245250255

AsnAsnCysAlaThrIleIleValProTyrIleAsnAlaLeuProPhe

260265270

AspSerAlaLeuAsnHisCysAsnPheGlyLeuLeuValValProIle

275280285

SerProLeuAspTyrAspGlnGlyAlaThrProValIleProIleThr

290295300

IleThrLeuAlaProMetCysSerGluPheAlaGlyLeuArgGlnAla

305310315320

ValThrGlnGlyPheProThrGluLeuLysProGlyThrAsnGlnPhe

325330335

LeuThrThrAspAspGlyValSerAlaProIleLeuProAsnPheHis

340345350

ProThrProCysIleHisIleProGlyGluValArgAsnLeuLeuGlu

355360365

LeuCysGlnValGluThrIleLeuGluValAsnAsnValProThrAsn

370375380

AlaThrSerLeuMetGluArgLeuArgPheProValSerAlaGlnAla

385390395400

GlyLysGlyGluLeuCysAlaValPheArgAlaAspProGlyArgAsp

405410415

GlyProTrpGlnSerThrLeuLeuGlyGlnLeuCysGlyTyrTyrThr

420425430

GlnTrpSerGlySerLeuGluValThrPheMetPheThrGlySerPhe

435440445

MetAlaThrGlyLysMetLeuIleAlaTyrThrProProGlyGlyPro

450455460

LeuProLysAspArgAlaThrAlaMetLeuGlyThrHisValIleTrp

465470475480

AspPheGlyLeuGlnSerSerValThrLeuValIleProTrpIleSer

485490495

AsnThrHisTyrArgAlaHisAlaArgAspGlyValPheAspTyrTyr

500505510

ThrThrGlyLeuValSerIleTrpTyrGlnThrAsnTyrValValPro

515520525

IleGlyAlaProAsnThrAlaTyrIleIleAlaLeuAlaAlaAlaGln

530535540

LysAsnPheThrMetLysLeuCysLysAspAlaSerAspIleLeuGln

545550555560

ThrGlyThrIleGlnGlyAspArgValAlaAspValIleGluSerSer

565570575

IleGlyAspSerValSerArgAlaLeuThrHisAlaLeuProAlaPro

580585590

ThrGlyGlnAsnThrGlnValSerSerHisArgLeuAspThrGlyLys

595600605

ValProAlaLeuGlnAlaAlaGluIleGlyThrSerSerAsnAlaSer

610615620

AspGluSerMetIleGluThrArgCysValLeuAsnSerHisSerThr

625630635640

AlaGluThrThrLeuAspSerPhePheSerArgAlaGlyLeuValGly

645650655

GluIleAspLeuProLeuGluGlyThrThrAsnProAsnGlyTyrAla

660665670

AsnTrpAspIleAspIleThrGlyTyrAlaGlnMetArgArgLysVal

675680685

GluLeuPheThrTyrMetArgPheAspAlaGluPheThrPheValAla

690695700

CysThrProThrGlyGluValValProGlnLeuLeuGlnTyrMetPhe

705710715720

ValProProGlyAlaProLysProAspSerArgGluSerLeuAlaTrp

725730735

GlnThrAlaThrAsnProSerValPheValLysLeuSerAspProPro

740745750

AlaGlnValSerValProPheMetSerProAlaSerValTyrGlnTrp

755760765

PheTyrAspGlyTyrProThrPheGlyGluHisLysGlnGluLysAsp

770775780

LeuGluTyrGlyAlaCysProAsnAsnMetMetGlyThrPheSerVal

785790795800

ArgThrValGlyThrSerLysSerLysTyrProLeuValValArgIle

805810815

TyrMetArgMetLysHisValArgAlaTrpIleProArgProMetArg

820825830

AsnGlnAsnTyrLeuPheLysAlaAsnProAsnTyrAlaGlyAsnSer

835840845

IleLysProThrGlyAlaSerArgThrAlaIleIleThrLeuGlyLys

850855860

PheGlyGlnGlnSerGlyAlaIleTyrValGlyAsnPheArgValVal

865870875880

AsnArgHisLeuAlaThrHisThrAspTrpAlaAsnLeuValTrpGlu

885890895

AspSerSerArgAspLeuLeuValSerSerThrThrAlaGlnGlyCys

900905910

AspThrIleAlaArgCysAspCysGlnThrGlyValTyrTyrCysAsn

915920925

SerMetArgLysHisTyrProValSerPheSerLysProSerLeuVal

930935940

TyrValGluAlaSerGluTyrTyrProAlaArgTyrGlnSerHisLeu

945950955960

MetLeuAlaGlnGlyHisSerGluProGlyAspCysGlyGlyIleLeu

965970975

ArgCysGlnHisGlyValValGlyIleValSerThrGlyGlyAsnGly

980985990

LeuValGlyPheAlaAspValArgAspLeuLeuTrpLeuAspGluGlu

99510001005

AlaMetGluGlnGlyValSerAspTyrIleLysGlyLeuGlyAsp

101010151020

AlaPheGlyThrGlyPheThrAspAlaValSerArgGluValGlu

102510301035

AlaLeuLysAsnTyrLeuIleGlySerGluGlyValValGluLys

104010451050

IleLeuLysAsnLeuIleLysLeuIleSerAlaLeuValIleVal

105510601065

IleArgSerAspTyrAspMetValThrLeuThrAlaThrLeuAla

107010751080

LeuIleGlyCysHisGlySerProTrpAlaTrpIleLysAlaLys

108510901095

ThrAlaSerIleLeuGlyIleProIleAlaGlnLysGlnSerAla

110011051110

SerTrpLeuLysLysPheAsnAspMetAlaAsnAlaAlaLysGly

111511201125

LeuGluTrpValSerAsnLysIleSerLysPheIleAspTrpLeu

113011351140

LysGluLysIleValProAlaAlaArgGluLysValGluPheLeu

114511501155

AsnAsnLeuLysGlnLeuProLeuLeuGluAsnGlnIleSerAsn

116011651170

LeuGluGlnSerAlaAlaSerGlnGluAspLeuGluValMetPhe

117511801185

GlyAsnValSerTyrLeuAlaHisPheCysArgLysPheGlnPro

119011951200

LeuTyrAlaThrGluAlaLysArgValTyrAlaLeuGluLysArg

120512101215

MetAsnAsnTyrMetGlnPheLysSerLysHisArgIleGluPro

122012251230

ValCysLeuIleIleArgGlySerProGlyThrGlyLysSerLeu

123512401245

AlaThrGlyIleIleAlaArgAlaIleAlaAspLysTyrHisSer

125012551260

SerValTyrSerLeuProProAspProAspHisPheAspGlyTyr

126512701275

LysGlnGlnValValThrValMetAspAspLeuCysGlnAsnPro

128012851290

AspGlyLysAspMetSerLeuPheCysGlnMetValSerThrVal

129513001305

AspPheIleProProMetAlaSerLeuGluGluLysGlyValSer

131013151320

PheThrSerLysPheValIleAlaSerThrAsnAlaSerAsnIle

132513301335

IleValProThrValSerAspSerAspAlaIleArgArgArgPhe

134013451350

TyrMetAspCysAspIleGluValThrAspSerTyrLysThrAsp

135513601365

LeuGlyArgLeuAspAlaGlyArgAlaAlaLysLeuCysSerGlu

137013751380

AsnAsnThrAlaAsnPheLysArgCysSerProLeuValCysGly

138513901395

LysAlaIleGlnLeuArgAspArgLysSerLysValArgTyrSer

140014051410

ValAspThrValValSerGluLeuIleArgGluTyrSerAsnArg

141514201425

SerAlaIleGlyAsnThrIleGluAlaLeuPheGlnGlyProPro

143014351440

LysPheArgProIleArgIleSerLeuGluGluLysProAlaPro

144514501455

AspAlaIleSerAspLeuLeuAlaSerIleAspSerGluGluVal

146014651470

ArgGlnTyrCysArgAspGlnGlyTrpIleIleProGluAlaPro

147514801485

ThrAsnValGluArgHisLeuAsnArgAlaValLeuValMetGln

149014951500

SerIleAlaThrValValAlaValValSerLeuValTyrValIle

150515101515

TyrLysLeuPheAlaGlyPheGlnGlyAlaTyrSerGlyAlaPro

152015251530

LysGlnValLeuLysLysProAlaLeuArgThrAlaThrValGln

153515401545

GlyProSerLeuAspPheAlaLeuSerLeuLeuArgArgAsnIle

155015551560

ArgGlnValGlnThrAspGlnGlyHisPheThrMetLeuGlyVal

156515701575

ArgAspArgLeuAlaValLeuProArgHisSerGlnProGlyLys

158015851590

ThrIleTrpIleGluHisLysLeuValAsnValLeuAspAlaVal

159516001605

GluLeuValAspGluGlnGlyValAsnLeuGluLeuThrLeuIle

161016151620

ThrLeuAspThrAsnGluLysPheArgAspIleThrLysPheIle

162516301635

ProGluAsnIleSerThrAlaSerAspAlaThrLeuValIleAsn

164016451650

ThrGluHisMetProSerMetPheValProValGlyAspValVal

165516601665

GlnTyrGlyPheLeuAsnLeuSerGlyLysProThrHisArgThr

167016751680

MetMetTyrAsnPheProThrLysAlaGlyGlnCysGlyGlyVal

168516901695

ValThrSerValGlyLysValValGlyIleHisIleGlyGlyAsn

170017051710

GlyArgGlnGlyPheCysAlaGlyLeuLysArgSerTyrPheAla

171517201725

SerGluGlnGlyGluIleGlnTrpValLysProAsnLysGluThr

173017351740

GlyArgLeuAsnIleAsnGlyProThrArgThrLysLeuGluPro

174517501755

SerValPheHisAspIlePheGluGlyAsnLysGluProAlaVal

176017651770

LeuHisSerLysAspProArgLeuGluValAspPheGluGlnAla

177517801785

LeuPheSerLysTyrValGlyAsnThrLeuHisGluProAspGlu

179017951800

TyrIleArgGluAlaAlaLeuHisTyrAlaAsnGlnLeuLysGln

180518101815

LeuGluIleAsnThrSerGlnMetSerMetGluGluAlaCysTyr

182018251830

GlyThrGluAsnLeuGluAlaIleAspLeuHisThrSerAlaGly

183518401845

TyrProTyrSerAlaLeuGlyIleLysLysArgAspIleLeuAsn

185018551860

ProThrThrArgAspValSerArgMetLysPheTyrMetAspLys

186518701875

TyrGlyLeuAspLeuProTyrSerThrTyrValLysAspGluLeu

188018851890

ArgSerIleAspLysIleLysLysGlyLysSerArgLeuIleGlu

189519001905

AlaSerSerLeuAsnAspSerValTyrLeuLysMetAlaPheGly

191019151920

HisLeuTyrGluValPheHisAlaAsnProGlyThrIleThrGly

192519301935

SerAlaValGlyCysAsnProAspThrPheTrpSerLysLeuPro

194019451950

IleLeuLeuProGlySerLeuPheAlaPheAspTyrSerGlyTyr

195519601965

AspAlaSerLeuSerProValTrpPheArgAlaLeuGluLeuVal

197019751980

LeuArgGluIleGlyTyrSerGluGluAlaIleSerLeuIleGlu

198519901995

GlyIleAsnHisThrHisHisValTyrArgAsnLysThrTyrCys

200020052010

ValLeuGlyGlyMetProSerGlyCysSerGlyThrSerIlePhe

201520202025

AsnSerMetIleAsnAsnIleIleIleArgAlaLeuLeuIleLys

203020352040

ThrPheLysGlyIleAspLeuAspGluLeuAsnMetValAlaTyr

204520502055

GlyAspAspValLeuAlaSerTyrProPheProIleAspCysLeu

206020652070

GluLeuAlaLysThrGlyLysGluTyrGlyLeuThrMetThrPro

207520802085

AlaAspLysSerProCysPheAsnGluValAsnTrpGlyAsnAla

209020952100

ThrPheLeuLysArgGlyPheLeuProAspGluGlnPheProPhe

210521102115

LeuIleHisProThrMetProMetArgGluIleHisGluSerIle

212021252130

ArgTrpThrLysAspAlaArgAsnThrGlnAspHisValArgSer

213521402145

LeuCysLeuLeuAlaTrpHisAsnGlyLysGlnGluTyrGluLys

215021552160

PheValSerThrIleArgSerValProValGlyArgAlaLeuAla

216521702175

IleProAsnTyrGluAsnLeuArgArgAsnTrpLeuGluLeuPhe

218021852190

Claims

1.一株EV71病毒，其全基因组长7405bp，其序列如SEQIDNO：1所示。

2.根据权利要求1所述的EV71病毒，其特征在于：该病毒株的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

3.权利要求1所述的EV71病毒在制备EV71疫苗中应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述EV71疫苗为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、VLPs、基因工程疫苗、DNA疫苗。