CN102617731B - 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗猪圆环病毒卵黄抗体及其制备方法和应用。本发明的抗猪圆环病毒卵黄抗体包括以下方法制备得到：(1)用猪圆环病毒疫苗免疫非免疫产蛋母鸡；(2)收集免疫产蛋母鸡所产鸡蛋；(3)从所收集的鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体。本发明方法所制备的抗猪圆环病毒卵黄抗体水平高，卵黄抗体表达持续稳定、波动小，卵黄抗体效价最高可达1∶640，并且能够持续8周以上不下降。体外和体内中和试验证实，本发明所制备的抗猪圆环病毒卵黄抗体能够有效抑制猪圆环病毒，具有良好的免疫保护效力，能将其制备成用于预防或治疗由猪圆环病毒所引起疾病的药物或制剂。

Description

抗猪圆环病毒2型卵黄抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种卵黄抗体，尤其涉及一种抗猪圆环病毒2型卵黄抗体及其制备方法，本发明还涉及由该抗猪圆环病毒2型卵黄抗体制备而成的制剂以及它们在制备预防、治疗或诊断由猪圆环病毒2型所导致的各种疾病的药物或试剂中的用途，属于卵黄抗体的制备和应用领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)是近几年来发现的一种DNA病毒，是圆环病毒科圆环病毒属的成员之一，无囊膜，呈20面体对称，直径为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。猪圆环病毒能引起仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸疾病综合征、猪皮肤和肾病综合征等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVDs)。该病毒在猪的淋巴系统增殖，可引起免疫细胞的凋亡，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降，诱发多种病毒和细菌的混合感染和继发感染，死亡率多为10％-30％，严重时高达40％。

PCV包括两种基因型，PCV1和PCV2，其中PCV1没有致病性，但广泛存在于猪体内，PCV2具有致病性，而且感染非常普遍，几乎所有的猪群都感染了PCV2。PCV2可以与多种病原混合感染，造成多系统、多组织的损伤，与PCV2感染相关的疾病有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道疾病综合症(PRDC)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、PCV2相关繁殖障碍等。PCV2相关疾病最主要的是PMWS，被感染仔猪表现为衰弱、生长缓慢、呼吸困难、淋巴结肿大等症状。猪群中PMWS的发病率通常在4％-30％之间，死亡率在50％-90％之间，给养猪业造成了巨大的经济损失。自1991年首次在加拿大发生PMWS以来，现在全世界大多数国家都报道过该病。据估计，欧洲每年因为PMWS造成的损失高达6亿欧元。PCV2对中国造成的损失目前还没有权威的统计，但是，中国自2000年报道猪群中出现PCV2感染以来，各地陆续出现被感染案例，PCV2流行范围已经波及全国。

近年来，人们致力于PCV2疫苗的开发应用研究，国外的部分产品已经进行注册，并投入了应用，中国农业部也于2010年注册通过了圆环病毒疫苗，并且投入生产，PCV2疫苗已经在预防猪圆环病毒病上发挥了显著的效果。但是该病毒在体外培养不产生细胞病变，病毒繁殖能力低，难于获得高产量的病毒，使疫苗的制备存在一定的限制。

卵黄抗体是禽类的一种免疫球蛋白，IgY的形成和免疫作用受腔上囊控制，当机体受到外界特异性抗原的刺激，诱发一系列的免疫应答反应，刺激B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体逐步移行到卵巢和输卵管中，并在卵黄中蓄集形成卵黄免疫球蛋白。

特异性卵黄抗体(IgY)具有来源广泛、无毒副作用、易采集及稳定性好、经消毒还能保持力较高活性等特点，被广泛应用于疾病的诊断和防治。目前，国内应用IgY防治禽类疾病的种类很多，主要有传染性法氏囊病、小鹅瘟、鸡新城疫、鹅病毒性肝炎、蕃鸭细小病毒病、鸡减蛋综合症、禽脑脊髓炎、鸡传染性喉气管炎及鸭疫李氏杆菌病等。

卵黄抗体是通过对蛋鸡注射抗原获得。但是，免疫蛋鸡产生的免疫应答却并不能被预测。因为有很多因素影响免疫效果，最主要的影响因素有抗原(包括剂量和分子量)、佐剂的种类、免疫程序、免疫次数和免疫间隔等(Schade R，Calzado E G，SarmientoR，Chacana P A，Porankiewicz-Asplund J，Terzolo H R.Chicken egg yolk antibodies(IgY-technology)：a review of progess in production and use in research and human andveterinary medicine.ATLA.2005，33：129-154)。

在猪病防治方面，研究和应用比较成熟的是仔猪的大肠杆菌性腹泻卵黄抗体，卵黄抗体因其制备简单、易提取、性质均一等优点，在免疫技术、免疫临测、人畜疾病治疗方面有着很大的发展潜力。但是国内外关于抗猪圆环病毒卵黄抗体的制备相关研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗猪圆环病毒2型卵黄抗体；

本发明目的之二是提供一种制备抗猪圆环病毒2型卵黄抗体的方法；

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种抗猪圆环病毒卵黄抗体，其制备方法包括以下步骤：(1)用猪圆环病毒疫苗免疫非免疫产蛋母鸡；(2)收集免疫产蛋母鸡所产鸡蛋；(3)从所收集的鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体。

其中，步骤(1)中所述的免疫方式为胸肌注射；优选的，所述的胸肌注射的次数为五次；其中，五次免疫的间隔时间优选为：首免后间隔两周二免，二免后间隔两周三免，三免后间隔四周四免，四免后间隔两周五免。

本发明通过实验发现，前四次免疫注射由灭活的猪圆环病毒和佐剂乳化成的疫苗，第五免注射猪圆环病毒活病毒，所获得的抗猪圆环病毒卵黄抗体效价相对较高；其中，所述的佐剂优选为弗氏佐剂。更优选的，首次免疫注射由灭活的猪圆环病毒和弗氏完全佐剂乳化成的疫苗，第二次至第四次免疫注射由灭活的猪圆环病毒和弗氏不完全佐剂乳化成的疫苗。

本发明通过大量的试验进一步发现，在免疫过程中免疫剂量和佐剂对猪圆环病毒卵黄抗体的产生水平有着非常显著的影响：本发明通过实验首先发现，在进行免疫时仅注射圆环病毒(未加佐剂)，在首免后卵黄抗体水平会迅速升高，但随后下降也较快，再次免疫后，抗体水平又迅速升高，但是很快又降下来，波动较大，而且整体上抗体水平较低，相较而言，注射圆环病毒疫苗组(圆环病毒加佐剂)抗体水平持续而稳定，在五免之后，效价可达1∶640，并且至试验结束时，效价依然保持稳定，而仅注射圆环病毒组效价最高只能达到1∶320，抗体效价始终低于注射圆环病毒疫苗组(圆环病毒加佐剂)。

本发明还比较了免疫剂量变化与等量加强免疫产生抗体水平的变化趋势，发现免疫剂量变化产生的抗体水平较高，这可能是由于等量加强免疫，降低了蛋鸡对于疫苗的敏感性，而免疫剂量的变化，有助于抗体的激发。

本发明通过大量的试验最终发现，采用下述的免疫方案进行免疫，所产生的抗猪圆环病毒的抗体水平为最高，且能够持续、稳定的表达：

将灭活的猪圆环病毒抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后得到首免用灭活疫苗，用1ml该灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；将灭活的猪圆环病毒抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后得到二免、三免和四免用的灭活疫苗；首免后间隔两周二免，用2ml灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；二免后间隔两周三免，用4ml灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；三免后间隔四周四免，用2m灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；四免后间隔两周五免，用2ml猪圆环病毒活病毒胸肌注射产蛋母鸡。

本发明采用不同的免疫方案免疫产蛋母鸡，血清中均产生了特异性的抗体。不同的免疫方案在首免后的两周均已产生抗体，在二免(第四周)后抗体水平明显升高，随着三免(第六周)、四免(第十周)等加强免疫后，抗体的水平可持续长达12周不下降。总体来看，采用上述最优选的免疫方案，抗体水平较高，并且持续稳定，波动较小，到第12周时，卵黄抗体效价最高可达1∶640，并且能够持续8周以上不下降。

步骤(2)中三免后采用ELISA检测抗体效价，当卵黄抗体效价达到1∶256时，收集免疫产蛋母鸡所产鸡蛋。

卵黄中含有大量的蛋白质和脂肪，其中大部分的蛋白质和脂肪以脂蛋白的形式存在，不溶于水。这些物质增加了卵黄的粘稠度，未经处理的卵黄抗体，注射到动物体内吸收慢，可能会造成肌肉坏死，而且产生的刺激较大，为了避免这些缺点，需要采取一定的方法提取出纯度较高的卵黄抗体，也就是水溶性的γ卵黄球蛋白。从卵黄中得到卵黄抗需要经过分离、提取和纯化等步骤。

至于如何从所收集的鸡蛋中分离、提取并纯化卵黄抗体，这些方式均为本领域所属技术人员所通晓，例如，可以采用水稀释、硫酸铵盐析、透析、浓缩等手段从鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体；本发明采用上述提取和纯化方法，最终卵黄抗体的回收率为5.17mg/ml卵黄。

分离就是将卵黄中的脂肪和蛋白质除去，得到水溶性成分。其中水稀释法最为简单，符合相似相溶原理。水溶性组分溶于水中，而不溶于水的脂蛋白则以沉淀的形式分离出来，加盐酸调整pH至5.2左右，可以将不溶性组分完全分离开来，经离心，全部沉淀下来(Akita et al.，1992)。本试验即采用了这种方法。

提取是将γ卵黄球蛋白从水溶性组分中分离出来，常用的方法有无机物沉淀法和有机物沉淀法。蛋白质在中性盐溶液中的溶解度很低，不同的蛋白质在相同的溶液中溶解度不同，根据这个原理，我们选择合适的浓度，将卵黄抗体分离出来，本试验采用了硫酸铵两步盐析法，提取出了卵黄抗体。

本试验为了获得大量的卵黄抗体，采用水稀释法对IgY进行粗提，然后又用硫酸铵两步盐析提纯，透析袋除盐，之后进行浓缩获得卵黄抗体，取得了良好的效果，最终获得卵黄抗体的量为5.17mg/ml，较张文俊等人的提取量低，可能是由于硫酸铵饱和度不同引起的。从电泳结果来看，水稀释两步硫酸铵盐析法提纯的卵黄抗体杂带较少，纯度较高，并且在凉冻干燥后，抗体效价没有降低。

作为参考，本发明的一个从所收集的鸡蛋中分离、提取和纯化卵黄抗体的整体技术方案如下：

将所收集的鸡蛋消毒后，收集卵黄液，用蒸馏水稀释后，用0.1M盐酸调pH至5.2，搅匀后过夜；离心，取上清，用饱和硫酸铵盐析沉淀，加饱和硫酸铵溶液至55％饱和度，混匀，待完全溶解后过夜；离心，弃去上清，沉淀用含双抗200单位的生理盐水溶解，恢复至原卵黄液体积，再加入饱和硫酸铵至33％饱和度，混匀，置室温过夜；离心，除去上清液，将沉淀透析、浓缩，冷冻干燥即得。

本发明还可以进一步将所制备得到的抗猪圆环病毒卵黄抗体按照常规的兽用药的制剂方法制备成各种制剂，例如注射剂或口服制剂等，优选为注射剂。

作为参考，例如，可以将所制备的抗猪圆环病毒卵黄抗体用注射用生理盐水溶解后，调整IgY的浓度分装，该注射剂内含有效价≥256的抗猪圆环病毒的卵黄抗体，即得抗猪圆环病毒卵黄抗体注射剂。

本发明方法所制备的抗猪圆环病毒卵黄抗体水平高，卵黄抗体表达持续稳定、波动小，卵黄抗体效价最高可达1∶640，并且能够持续8周以上不下降。体外和体内中和试验证实，本发明所制备的抗猪圆环病毒卵黄抗体能够有效抑制猪圆环病毒，具有良好的免疫保护效力，能将其制备成用于预防或治疗由猪圆环病毒所引起的各种疾病的药物或制剂。

附图说明

图1蛋白含量测定标准曲线。

图2不同免疫方案免疫后血清抗体水平。

图3不同免疫方案免疫后IgY水平。

图4不同免疫方案免疫后血清抗体效价。

图5不同免疫方案免疫后IgY水平。

图6分离纯化组分聚丙烯酰受凝胶电泳图。

图7PCR检测结果；M.DL 2000DNA Marker；1.胸腺；2.心；3.肝；4.脾；5.肺；6.肾；7.淋巴结；8.阳性对照；9.阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1抗猪圆环病毒卵黄抗体及注制剂的制备

1.试验材料

1.1主要试剂

PCV2WH株购自国家兽医微生物菌种保藏中心；编号：CAU0673；

牛血清白蛋白(BSA)：购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司

弗氏完全佐剂：购自武汉鼎国生物技术有限公司

弗氏不完全佐剂：购自武汉鼎国生物技术有限公司

四甲基联苯胺二盐酸(TMB)：购自华美生物工程公司

辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY：购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司

蛋白marker：购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司

1.2试验动物及分组

选取32只22周龄海兰褐蛋鸡，分为四组，对照组和三个处理组，各8只，均单笼饲养，试验前预饲一个月，自由采食和自由饮水，定期清理卫生和消毒，待产蛋量达到稳定开始试验。

2试验方法

2.1免疫原制备

PCV2：PCV2WH株(购自国家兽医微生物菌种保藏中心；编号：CAU0673)与细胞液按1∶10的体积比例接种到新消化的细胞悬液中，37℃培养24h，待细胞长成单层后，按Tischer法加入300mmol D-氨基葡萄糖处理，37℃30min，弃去D-氨基葡萄糖，加入含3％胎牛血清的DMEM培养基继续培养48h，收获病毒，-20℃保存备用。

PCV2弗氏完全佐剂疫苗：取PCV2(病毒量为10⁷TCID₅₀/ml)，加入0.3％的甲醛，放置于37℃恒温培养箱24h进行灭活，期间摇动数次。加入等量的弗氏完全佐剂，用玻璃注射器进行乳化，制备成首免灭活疫苗，4℃保存备用。

PCV2弗氏不完全佐剂疫苗：将灭活PCV2与等量弗氏不完全佐剂乳化得到，制备好疫苗后于4℃保存备用。

2.2蛋鸡的免疫

产蛋鸡随机分成3个处理组和1个对照组，免疫方式均为胸肌注射，共免疫5次，首免后间隔两周二免，二免后间隔两周三免，三免后间隔四周四免，四免后间隔两周五免，具体免疫情况如下：

对照组：注射生理盐水，分别为1ml、2ml、4ml、2ml、2ml。

试验组1(免疫方案1)：首免1ml(弗氏完全佐剂灭活苗)，二免、三免、四免分别为2ml、4ml、2ml(弗氏不完全佐剂灭活苗)，五免2ml(PCV2)。

试验组2(免疫方案2)：首免2ml(弗氏完全佐剂灭活苗)，二免、三免、四免均为2ml(弗氏不完全佐剂灭活苗)，五免2ml(PCV2)。

试验组3(免疫方案3)：首免、二免、三免、四免、五免分别为1ml、2ml、4ml、2ml、2ml(PCV2)。

2.3样品的采集

首免后每隔两周对试验组和对照组的蛋鸡采血，从翼静脉采2ml血液，置于4℃冰箱过夜，之后放恒温箱1h，4000r离心5min，收集上清，置于-20℃冰箱备用。每隔两周收集鸡蛋，检测抗体效价，待卵黄抗体出现阳性，开始收集鸡蛋。

2.4IgY的分离、提取、纯化

收集对照组和处理组的鸡蛋，采用水稀释、硫酸铵盐析和透析袋透析方法纯化卵黄抗体。具体的过程如下：

(1)水稀释

取出要进行处理的鸡蛋，用水冲洗干净，然后用0.5％的新洁尔灭浸泡20min，自然晾干。用卵黄分离器分离蛋黄和蛋清，将蛋黄放在滤纸上滚动，将残留的蛋清去除，接着倒入烧杯中，挑破卵黄膜，收集卵黄，加入9倍卵黄体积的蒸馏水，用100mM HCL调整pH至5.2，磁力搅拌器混匀后4℃过夜，4℃10000r/min离心30min，收集上清，即为WSF。

(2)硫酸铵盐析

在收集的上清液中加入饱和硫酸铵溶液至55％饱和度，边加边搅拌混匀，上清液会从最初的清亮变为白色混浊，之后随着硫酸铵的加入再转为清亮，待完全混匀后4℃过夜，10000r/min离心15min，充去上清，保留沉淀，用生理盐水重悬至原体积，再加入饱和硫酸铵溶液至33％饱和度，搅拌混匀，4℃过夜，10000r/min离心15min，弃去上清，沉淀用生理盐水重悬至原体积，为二次盐析组分。

(3)透析袋除盐

把二次盐析获取的蛋白溶液装入透析袋内，将透析袋放入10倍体积的去离子水中进行透析72h，期间多次换水，用1％Bacl₂检测透析液中的硫酸铵，1％AgNO₃检测Nacl，判定透析是否完成，无沉淀代表透析完成，透析完成后用PEG 20000浓缩，提高抗体浓度，4℃保存备用，或-20℃冰箱冻存一晚上后，进行冷冻干燥，制备成卵黄粉，保存待用。

2.5抗体效价的检测

每隔两周用间接ELISA和胶体金两种方法检测血清抗体和卵黄抗体的效价。胶体金检测步骤：

(1)在检测卡的加样孔内加入2滴(100μl)待检血清或血液样品

(2)将检测卡平放于桌面上，在室温下静置20min内判定结果。超过20min的结果只能作为参考。

2.6抗原最佳包被浓度的确定

用完整的PCV2病毒颗粒作为抗原包被酶标板，采用方阵滴定法，包被前用BCA蛋白测定试剂盒测定病毒蛋白浓度为2.805mg/ml。阴阳性血清均用稀释液从1∶40倍开始稀释，稀释成5个梯度，抗原用抗原包被液从1∶50倍开始稀释，稀释成8个梯度。

2.7各提取步骤卵黄抗体蛋白含量测定

采用BCA蛋白含量测定试剂盒测定蛋黄中总蛋白质含量，具体步骤如下：根据试剂盒步骤，稀释一系列蛋白标准品，用酶标仪在562nm波长下测定OD值，以OD值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线，待测样品适当稀释，使样品的浓度在标准曲线的线性范围内，同样方法测定OD值，根据标准曲线，计算蛋白质浓度。标准曲线见图1。

3试验结果

3.1血清抗体方阵滴定结果

表1包被抗原和血清稀释度的确定(OD₄₅₀)

注明：P：阳性血清，N：阴性血清

通过方阵滴定法，当OD值为1.0时的抗原稀释度及血清稀释度为最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释度，故选择抗原的最佳稀释度为1∶400(7.013μg/ml)，血清的最佳稀释度为1∶160倍稀释(见表1-3)，经重复试验所得的结果基本一致。

3.2卵黄抗体方阵滴定结果

表2包被抗原和IgY稀释度的确定(OD₄₅₀)

注明：P：阳性血清，N：阴性血清

根据OD值为1.0时的抗原稀释度及IgY稀释度为最佳包被浓度和IgY稀释度，故选择抗原的最佳稀释度为1∶160(43.831μg/ml)，IgY的最佳稀释度为1∶10倍稀释，经重复试验所得的结果基本一致。

3.3不同免疫方案对鸡血清抗体水平变化的影响

采用不同的免疫方案免疫产蛋母鸡，血清中均产生了特异性的抗体。三种免疫方案在首免后的两周均已产生抗体，在二免(第四周)后抗体水平明显升高，随着三免(第六周)、四免(第十周)等加强免疫后，抗体的水平可持续长达12周不下降。免疫方案2因为首免剂量高于方案1，首免后产生的抗体效价高于方案1，但方案1在四免后血清抗体迅速升高，并且抗体水平始终高于方案2，方案3五次免疫注射的均为全病毒，首免后抗体效价上升幅度高于方案1，但随后很快下降，二免后又升高，随着三免继续升高，但随后又下降，五免后上升，整体上波动较大，并且抗体水平较另外两组低，可以看出，三种免疫方案中，免疫方案1，即采用弗氏佐剂、免疫剂量变化的免疫方法最好，抗体水平较高，并且持续稳定(图2)。

3.4不同免疫方案对鸡卵黄抗体变化的影响

采用不同的免疫方案免疫产蛋母鸡，均产生了特异性的卵黄抗体。在首免后两周免疫方案1没有产生抗体，免疫方案2和3已经产生抗体，这与血清抗体水平的结果相似，都是首免后免疫方案2和3抗体水平较方案1高，同样，从整体上看，免疫方案1产生的抗体水平高于方案2和3，卵黄抗体水平较血清抗体水平上升慢，到12周才达到平稳，但是抗体水平较平稳，波动较小(图3)。

3.5胶体金法检测血清抗体效价

用胶体金进行检测，血清抗体在10周之前抗体水平都较低，五免之后，抗体效价迅速升高，在第12周的时候，免疫方案1组血清抗体效价最高可达1∶10240，并且能够持续8周以上不下降。采用ELISA方法进行IgY效价测定，IgY效价为1∶256-1∶1280。用胶体金法和ELISA方法测定血清抗体效价，得到的结果相同，免疫方案1整体上产生的抗体水平最高(图4)。

3.6胶体金法检测卵黄抗体效价

用胶体金检测，可以看出卵黄抗体效价远远低于血清抗体效价，但依旧是免疫方案1产生的卵黄抗体水平高于方案2和3。到第12周时，免疫方案1组卵黄抗体效价最高可达1∶640，并且能够持续8周以上不下降(图5)。

3.7卵黄抗体纯度

表3IgY分离纯化各组分的产率

经过水稀释、硫酸铵一次盐析、硫酸铵二次盐析、透析、浓缩等步骤后，卵黄抗体的产率逐渐降低，每枚鸡蛋取10ml卵黄液提取卵黄抗体，最终只能获得51.67mg纯化的抗体。

SDS-PAGE结果显示(图6)，在水稀释后，杂蛋白比较多，出现很多杂带，一次硫酸铵盐析后，条带减少，二次盐析后卵黄抗体已经较纯，二次盐析和透析的条带一致，浓缩后抗体浓度增加，条带明显加深，与标准IgY相比，条带一致，IgY有两条带即重链(约67KD)和轻链(约23KD)。

试验例1猪圆环病毒2型卵黄抗体的体外中和试验

1、试验材料及试剂

1.1试验材料

猪肾传代细胞(PK-15细胞)：华中农业大学农业微生物国家重点实验室112赠；

PCV2WH株：购自国家兽医微生物菌种保藏中心；编号：CAU0673；

1.2试验试剂

胎牛血清(FCS)：GIBCL BRL公司

DMEM：GIBCO BRL公司

DMSO：中国医药集团上海化学试剂公司

胰蛋白酶：武汉生命科学技术公司

MTT：Fluka公司

异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG：北京博奥森生物技术有限公司

E.Z.N.A.Viral DNA Kit试剂盒：美国OMEGA公司

Genomic DNA Purification Kit MagExtractor试剂盒：日本

DL 2000Marker：TaKaRa公司

荧光定量PCR试剂盒：TOYOBO公司

1.3试验动物

8周龄SPF级BALB/c小鼠，购自武汉生物制品研究所。

2.试验方法

2.1卵黄抗体对细胞毒性的测定

在96孔细胞培养板中，将猪圆环病毒2型卵黄抗体(实施例1所制备)用培养基倍比稀释成不同浓度(最初浓度为7.2mg/ml)，100μl/孔，均加入长成良好的细胞，100μl/孔，每个浓度重复8孔，同时设置细胞对照组和病毒对照组，置37℃5％CO₂培养箱中培养48h，每天用倒置显微镜观察细胞病变(CPE)情况并记录结果。

2.2病毒感染滴度的测定

将收获的病毒用RPMI 1640培养基倍比稀释，100μl/孔，然后加入长势良好的PK-15细胞悬液，100μl/孔(细胞含量为4*10⁵个/ml)，同时设立细胞对照组，每个稀释浓度做8个重复，然后放入37℃5％CO₂培养箱中培养48h。PBS洗涤三次，用-20℃的无水乙醇固定细胞30min，弃去固定液，将96孔板自然晾干。将已经固定好的96孔板用PBS洗涤3次，每次5min，自然干燥。试验孔和对照孔均加入100μl PCV2Cap蛋白单克隆抗体，37℃培养箱放至1h，PBS洗涤3次。向试验孔和对照孔加入1∶100倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，50μl/孔，37℃30min，PBS洗3次。用荧光显微镜观察，按Reed-Muench两氏法计算半数细胞培养感染量(TCID₅₀)。

2.3抗猪圆环病毒2型卵黄抗体细胞体外中和试验

2.3.1细胞体外中和

在96孔细胞培养板中，将抗猪圆环病毒2型卵黄抗体(实施例1所制备)用培养基倍比稀释成不同浓度(最初浓度为7.2mg/ml)，50μl/孔，加入200TCID₅₀的病毒，50μl/孔，加入置37℃5％CO₂培养箱中中和1h，加入长成良好的细胞，每孔100μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养48h。反复冻融3次，收集细胞，用E.Z.N.A.Viral DNA Kit试剂盒提取细胞中的病毒DNA，通过荧光定量PCR测定细胞中病毒的拷贝数。

2.3.2细胞DNA提取

2.3.3实时荧光定量PCR

(1)设计一对引物，引物和探针序列如下：

PCV2F：5’-CCAGGAGGGCGTTCTGACT-3’(SEQ ID No.1)

PCV2R：5’-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3’(SEQ ID No.2)

TaqMan探针：5’-(FAM)AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCT(TAMRA)-3’(SEQ ID No.3)

(2)实时荧光定量PCR反应体系

荧光定量PCR反应体系为20μl：

反应在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行，反应条件：50℃2min；95℃1min；95℃15s；60℃1min；共40个循环。标准曲线为以10倍梯度稀释的已知拷贝数的PCV2阳性克隆质粒为模板。

2.4抗猪圆环病毒2型卵黄抗体小鼠体外中和试验

2.4.1试验动物的分组

选取30只8周龄SPF级BALB/c小鼠，随机分成三组，具体分组情况如下：

阴性对照组(10只)：每只小鼠腹腔注射0.5ml生理盐水。

试验组(10只)：取250mg实施例1所制备的抗猪圆环病毒2型卵黄抗体，加入2.5ml生理盐水稀释，与2.5ml猪圆环病毒混合后中和一个小时，之后每只小鼠腹腔注射0.5ml。

阳性对照组(10只)：每只小鼠腹腔注射0.5ml猪圆环病毒。

2.4.2血清抗体检测

在第7d、14d采集血液，分离血清，做1∶40倍稀释，用PCV2ORF2-ELISA试剂盒检测抗体效价。结果判定为：样品OD₆₃₀值大于0.42，判为阳性；样品OD₆₃₀值在0.38到0.42之间，判为可疑；样品OD₆₃₀值小于0.38，判为阴性。

2.4.3PCR检测

(1)血清中DNA的提取：

取第7d、14d采集血液提取DNA。

(2)组织中DNA的提取：

于第7d、14d剖杀小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、淋巴结等组织，提取DNA，组织DNA的提取用Genomic DNA Purification Kit MagExtractor试剂盒，购自日本TOYOBO公司，

2.4.4引物设计

上游引物(PCV2P1)：5’-CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT-3’(SEQ ID No.4)

下游引物(PCV2P2)：5’-CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC-3’(SEQ ID No.5)

该引物扩增出的片段大小为494bp。

2.4.5PCR扩增

PCR反应采用25μl反应体系：

按如下程序扩增：95℃变性5min，94℃1min，57℃1min，72℃40sec，35个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取10μl扩增产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，然后在凝胶成像仪上观察结果。

3试验结果

3.1卵黄抗体对细胞的毒性试验

IgY不引起细胞产生CPE，但是，当IgY浓度超过0.9mg/ml时，会促进细胞的生长，发生细胞堆积。IgY浓度为7.2mg/ml时，这种堆积现象最明显，随着浓度的降低，堆积现象逐渐减少，当IgY浓度为0.9mg/ml时，细胞生长与对照孔相同。

3.2抗猪圆环病毒2型卵黄抗体体外中和试验

表4细胞中病毒DNA实时荧光定量PCR结果

实时荧光定量PCR测定细胞中病毒的拷贝数结果见表4，可以看出，阴性对照组提取的抗体没有有效中和病毒，病毒的拷贝数使终保持在10⁸，试验组在卵黄抗体浓度为225μg/ml时，病毒的拷贝数从10⁸降至10⁷，且对照组和试验组细胞中病毒的拷贝数有显著差异，试验组IgY有效抑制了病毒的复制。

3.3抗猪圆环病毒2型卵黄抗体小鼠体内中和试验

3.3.1血清抗体测定结果

由表5可以看出，阴性对照组小鼠血清抗体始终显示阴性，试验组和病毒阳性对照组在攻毒后的第一周均有1只小鼠血清抗体转为阳性，其它4只小鼠血清显示阴性，第14天时，试验组和病毒阳性对照组均有4只小鼠血清转阳，阳性对照组的OD值较试验组略高，但差异不显著。

表5血清抗体结果

3.3.2血清PCR检测结果

通过对采集的30份血液提取DNA，PCR进行检测，均没有出现条带，小鼠没有出现病毒血症。

表6血清PCR检测结果

3.3.3组织PCR测定结果

通过提取组织DNA，扩PCR检测，只在阳性对照组的肝脏和胸腺两个部位扩出条带(见图7、表7)，试验组、阴性对照组小鼠各组织均未检测到PCV2。

对阳性对照组、阴性对照组和试验组的肝脏、胸腺、淋巴结等部位做实时荧光定量检测，结果见表8，可以看出在攻毒后的第7天，阳性对照组有4只小鼠肝脏中检测到病毒、5只小鼠胸腺中检测到病毒、5只小鼠淋巴结中检测到病毒，试验组小鼠肝脏、胸腺、淋巴结等部位分别有2只、3只、3只小鼠检测到病毒；攻毒后第14d，阳性对照组5只小鼠肝脏中均检测到病毒，4只小鼠胸腺中检测到病毒、5只小鼠淋巴结中检测到病毒，试验组小鼠肝脏、胸腺、淋巴结等部位分别2只、4只、3只检测到病毒。可以看出，阳性对照组PCV2的检出率明显高于试验组和阴性对照组。通过对检测到病毒的小鼠组织中病毒拷贝数进行比较，发现阳性对照组的小鼠在攻毒后第7d，肝脏和胸腺中病毒的拷贝数远远高于试验组和阴性对照组，淋巴结中病毒的拷贝数基本没有差异。攻毒后第14d三个组的小鼠肝脏、胸腺、淋巴结中的病毒拷贝数没有差异。

表7组织PCR检测结果

表8组织中病毒核酸实时荧光定量PCR结果

注：括号中分数的分子代表检测到病毒的小鼠只数，分母代表每组小鼠的总只数

                         序列表

 

<110>  华中农业大学 

 

<120>  抗猪圆环病毒2型卵黄抗体及其制备方法和应用

 

<130>  DQXL-0026

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  1

ccaggagggc gttctgact                                                    19

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  2

cgttaccgct ggagaaggaa                                                   20

 

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  3

aatggcatct tcaacacccg cctct                                             25

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  4

cacggatatt gtagtcctgg t                                                 21

 

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  5

cgcaccttcg gatatactgt c                                                 21

Claims (2)

1.一种抗猪圆环病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用猪圆环病毒疫苗免疫非免疫产蛋母鸡；所述的免疫方式为胸肌注射五次，其中，前四次免疫注射的方法如下：将灭活的猪圆环病毒抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后得到首免用灭活疫苗，用1ml该灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；将灭活的猪圆环病毒抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后得到二免、三免和四免用的灭活疫苗；首免后间隔两周二免，用2ml灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；二免后间隔两周三免，用4ml灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；三免后间隔四周四免，用2ml灭活疫苗胸肌注射产蛋母鸡；

第五次免疫注射方式如下：四免后间隔两周五免，用2ml猪圆环病毒活病毒胸肌注射产蛋母鸡；

（2）收集免疫产蛋母鸡所产鸡蛋；

（3）从所收集的鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中从所收集的鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体的方法包括：水稀释、硫酸铵盐析、透析或/和浓缩。

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