CN111378031A - 一种卵黄抗体的脱脂方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵黄抗体的脱脂方法，属于体外诊断试剂抗体原料领域。本发明收集合格的鸡蛋卵黄，对鸡蛋卵黄稀释及酸化脱脂后，再通过加入气相二氧化硅对酸化卵黄液进行彻底脱脂，使用这种方法脱脂程度完全，卵黄抗体品质高，适合工业大规模生产，本发明具有方法简单，易于操作，工艺程序简单，产品安全性高，不会造成环境化学试剂污染。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂抗体原料领域，特别是一种卵黄抗体的脱脂方法。
背景技术
鸡卵黄抗体是存在于卵黄中的免疫球蛋白，它是由母鸡血清中的免疫球蛋白转移而来。卵黄抗体可以应用于临床疾病的治疗，如鸡传染性法氏囊病、新城疫、鸭瘟、等等，在临床实践中，卵黄抗体的预防和治疗效果非常理想，同时卵黄抗体的制造工艺简单价廉，在养禽业生产中的用量很大，发挥十分重要的作用。
卵黄中35％左右的组分为脂类，实际生产应用中，卵黄抗体的纯化过程就是逐步去除脂类，最后获得高纯度的IgY的过程。在卵黄抗体应用于临床诊断试剂的应用中，对脂质残留要求极高，脱脂不完全会对后续应用产生巨大干扰，因此，脱脂程度是衡量诊断用卵黄抗体品质的重要指标。传统的脱脂方法有冻融法，聚乙二醇法，氯仿法，盐析法等，这些方法存在有的不适合工业化生产，有的对环境污染大，有的回收率低，因此需要一种方法用于适用工业化生产的经济环保卵黄抗体完全脱脂技术，去除卵黄抗体中的残留脂质。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是去除卵黄抗体中的残留脂质，实现卵黄产品的完全脱脂。
为解决上述技术问题，本发明所采取的方案是：一种卵黄抗体的脱脂方法，具体步骤如下：
第一步：强化免疫，用临床诊断指标免疫原，按照特定程序免疫鸡，鸡所产鸡蛋蓄积特定卵黄抗体；
第二步：效价检测，对鸡蛋卵黄抗体效价检测，收集合格所产鸡蛋卵黄；
第三步：酸化，鸡蛋卵黄用纯化水稀释、酸化，脱除大部分脂质；
第四步：脱脂，用脱脂技术彻底去除残留脂质。
优选的，第一步免疫鸡的强化方法为：每间隔7～20天进行强化免疫，按照抗原与佐剂等体积混合，多点注射鸡胸肌或翼下肌肉 0.5～1.5ml，每次抗原剂量为10～1000ug/只。
优选的，第一步中所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、天然来源佐剂、油乳佐剂、细胞因子佐剂、微生物佐剂、核酸佐剂、纳米佐剂等。
优选的，第二步鸡蛋卵黄抗体效价检测方法为:鸡蛋卵黄液用 0.85％生理盐水作梯度稀释，在鸡蛋卵黄检测效价超过1：64，收集所产鸡蛋，分离鸡蛋卵黄。
优选的，第二步中梯度稀释为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64， 1:128，1:256。
优选的，第三步鸡蛋卵黄稀释与酸化方法为：鸡蛋卵黄与纯化水为1:5～1:9进行稀释，调节pH至4.5～5.5进行酸化，充分搅拌混合均匀，4℃静置过夜，分离上清液，取上清液即为酸化卵黄液。
优选的，第四步脱脂技术为：酸化卵黄液加入质量浓度为1～20g/L 的气相二氧化硅混匀后，离心收集上清液，取上清液即为完全脱脂卵黄抗体液。
优选的，第三步或第四步中离心条件为在2～8℃，10000g，30 分钟。
本发明的有益效果是在卵黄抗体纯化工艺中，以简单便捷环保的方式实现了物料的完全脱脂，实用性好；完全脱脂的物料对卵黄抗体后续纯化工艺带来便捷，减轻了后续处理工艺难度和处理通量，同时降低了后续处理的耗材成本，经济性高；解决了卵黄抗体应用于体外试剂诊断原料时，由于脱脂不完全对胶乳交联和生化比浊干扰的问题，符合应用要求。
具体实施方式
下面以实例应用的方式对本发明的技术方案进行完整清晰的描述。
实施例1
1材料
1.1抗原
C反应蛋白(CRP)，购自SIGMA试剂。
1.2免疫用产蛋鸡
140日龄商品高产罗曼褐鸡，鸡场内常规饲养。
1.3试剂
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，气相二氧化硅香草醛、三油酸甘油酯购自美国Sigma公司；盐酸为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.4实验仪器
离心机为J6-MI大容量冷冻离心机，过滤装置为Millipore除菌过滤器。
2方法
第一步免疫鸡的强化方法为：
抗原初免剂量为10ug/只，每间隔10天进行强化免疫，按照抗原与弗氏完全佐剂(购自SIGMA试剂)等体积混合充分乳化，多点注射鸡胸肌0.5ml，在抗原初免后10天进行第一次强化免疫，抗原剂量为15ug/只，所用佐剂为弗氏不完全佐剂(购自SIGMA试剂) 等体积混合充分乳化，多点注射鸡胸肌0.5ml，在第一次强化免疫后 10天进行第二次强化免疫，抗原剂量为20ug/只，所用佐剂为弗氏不完全佐剂(购自SIGMA试剂)等体积混合充分乳化，多点注射鸡胸肌0.5ml。
第二步鸡蛋卵黄抗体效价检测方法为：
用0.85％生理盐水加入鸡蛋卵黄液中作梯度稀释，即稀释度为2 倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，128倍，256倍，在鸡蛋卵黄检测效价超过1：64，收集鸡蛋，分离鸡蛋卵黄。
第三步鸡蛋卵黄稀释与酸化方法为：
在鸡蛋卵黄液中加入9倍体积的纯化水，混合均匀后用盐酸缓慢滴加至混合液中，调节pH为5.0，充分混匀，搅拌匀浆，4℃静置过夜，将鸡蛋卵黄液加入至离心管中，配平完后置于离心机(J6-MI大容量冷冻离心机)中，离心机设置4℃，以10000g离心30分钟后用过滤器(Millipore除菌过滤器)过滤分离上清液，取上清液即为酸化卵黄液。
第四步脱脂技术为：
在酸化卵黄液中加入质量浓度为2g/l、比表面积为200-400m2/g、加入比例为2％的气相二氧化硅(购自SIGMA试剂，货号S5130)混匀后静置2～4小时，将酸化卵黄液加入至离心管中，配平完后置于离心机(J6-MI大容量冷冻离心机)中，离心机设置4℃，以10000g离心30分钟后用过滤器(Millipore除菌过滤器)过滤分离上清液，取上清液即为完全脱脂卵黄抗体液。
脂质含量测定
取1mg/ml三油酸甘油酯标准品工作液(0.025、0.05、0.1、0.2、 0.4ml)，取待检卵黄料液0.5ml，加入试管中，标准品工作液待其溶剂无水乙醇自然挥发后，补加0.5ml纯水(空白管中加入纯水0.5ml)；分别加入1.5ml浓硫酸，立即插入冰中，振荡混匀，沸水浴15分钟，冰浴水中冷却约5分钟；再加入6.5ml磷酸-香草醛溶液，振荡混匀，在(37±2)℃水浴中孵育15分钟；室温冷却5分钟，以空白管校零后，测定520nm的吸光度。以系列标准品工作液读数绘制标准曲线，得到回归方程，标准曲线相关系数r需大于0.99，将待检卵黄料液吸光度代入回归方程，计算出样本脂质含量。
对所获产品进行效果检测：
一、琼脂双向免疫扩散效价检测
取冻干的卵黄抗体产品用0.85％生理盐水复溶至冻干前体积，按照常规琼脂双向免疫扩散效价。结果见表1。
表1原始卵黄效价与纯化卵黄抗体产品效价
| 测定序号 | 01 | 02 | 03 | 04 | 05 | 06 |
| 原始卵黄 | 1:256 | 1:128 | 1:128 | 1:256 | 1:128 | 1:128 |
| 纯化卵黄抗体产品 | 1:128 | 1:64 | 1:64 | 1:128 | 1:64 | 1:64 |
表1结果显示：原始卵黄琼脂双向免疫扩散效价均大于收集标准 1:64，经过工艺纯化后，卵黄抗体效价效价最低为1:64，符合质量标准。
二、完全脱脂后脂质含量测定见表2：
表2结果显示黄抗体液在本发明下脱脂后，在该检测体系下脂质含量均未检出，认为卵黄物料液已经脱脂完全，卵黄中没有残留脂质，卵黄抗体品质高，可用于体外诊断试剂用原料。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域熟练技术人员应当理解，这些仅是举例说明，可以对本实施方式作出多种变更或修改，而不背离本发明的原理和实质，本发明的保护范围仅由所附权利要求书限定。
Claims (8)
1.一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：具体步骤如下：
第一步：强化免疫，用临床诊断指标免疫原，按照特定程序免疫鸡，鸡所产鸡蛋蓄积特定卵黄抗体；
第二步：效价检测，对鸡蛋卵黄抗体效价检测，收集合格所产鸡蛋卵黄；
第三步：酸化，鸡蛋卵黄用纯化水稀释、酸化，脱除大部分脂质；
第四步：脱脂，用脱脂技术彻底去除残留脂质。
2.按照权利要求1所述的一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：所述第一步免疫鸡的强化方法为：每间隔7~20天进行强化免疫，按照抗原与佐剂等体积混合，多点注射鸡胸肌或翼下肌肉0.5~1.5 ml，每次抗原剂量为10~1000 ug/只。
3.按照权利要求2所述的一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：所述第一步中所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、天然来源佐剂、油乳佐剂、细胞因子佐剂、微生物佐剂、核酸佐剂、纳米佐剂等。
4.按照权利要求1所述的一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：所述第二步鸡蛋卵黄抗体效价检测方法为:鸡蛋卵黄液用0.85%生理盐水作梯度稀释，在鸡蛋卵黄检测效价超过1：64，收集所产鸡蛋，分离鸡蛋卵黄。
5.按照权利要求4所述的一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：所述第二步中梯度稀释为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256。
6.按照权利要求1所述的一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：所述第三步鸡蛋卵黄稀释与酸化方法为：鸡蛋卵黄与纯化水为1:5~1:9进行稀释，调节pH至4.5~5.5进行酸化，充分搅拌混合均匀，4℃静置过夜，分离上清液，取上清液即为酸化卵黄液。
7.按照权利要求1所述的一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：所述第四步脱脂技术为：酸化卵黄液加入质量浓度为1~20 g/L的气相二氧化硅混匀后，离心收集上清液，取上清液即为完全脱脂卵黄抗体液。
8.按照权利要求6或7所述的一种卵黄抗体的脱脂方法，其特征在于：所述第三步或第四步中离心条件为在2~8℃，10000 g，30分钟。
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- 2018-12-28 CN CN201811631680.1A patent/CN111378031A/zh active Pending
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