CN101948538A - 一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，首先采用甲醛、硫柳汞及白油佐剂培养制备抗原溶液，然后将抗原溶液在健康鸡上进行免疫，收集免疫鸡蛋，然后从免疫鸡蛋中提取卵黄抗体，然后采用硫酸铵进行纯化得到抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体。本发明抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体，采用首先收集菌毛，然后通过鸡机体免疫后收集鸡卵黄中的抗大肠杆菌抗体。其中本发明在从免疫鸡蛋都收集抗大肠杆菌抗体时采用硫酸铵溶液进行纯化，经试验证实，得到的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体的效价得到了明显的提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法。
背景技术
仔猪大肠杆菌腹泻是由猪致病性大肠杆菌引起的一种常见性传染病，容易造成发育迟缓或死亡，严重的危害养猪业的发展，但是对于仔猪腹泻病，我们至今仍然停留在当猪发病后就表现出的症状大量用药被动治疗的水平上，导致病菌产生耐药性，不仅费工费力，效果不理想，而且还存在药物残留问题，严重影响畜产品的质量，给人类的健康带来隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种效价较高的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其步骤如下：
1）菌毛抗原的制备：
取大肠杆菌菌株，在TSB液体培养基中培养至对数期，离心，弃去上清，用生理盐水洗涤沉淀，重复离心、洗涤2次，收集菌体，按照菌体体积的0.45%加入甲醛，灭活，加入含甲醛菌体体积0.01%的柳硫汞；按照菌体：白油佐剂为1：1的比例加入白油佐剂，研磨制成均一的油包水型抗原溶液；
2）抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的制备：
A免疫：采用抗原溶液对健康鸡进行免疫，免疫后收集免疫鸡蛋；
B抗大肠杆菌鸡卵黄的分离及处理：
将收集的免疫鸡蛋用清水洗净后，再用新洁尔灭浸泡30min，晾干，分离蛋黄；将分离的蛋黄按照1：7-8的比例加入生理盐水稀释，再用盐酸调节稀释好的蛋黄液pH至5-5.5，搅拌，静置，收集上清弃去脂蛋白沉淀，离心，除去大量的脂类，收集上清，将上清进行连续的超滤膜分离，得到浓缩截留液，再用0.45μm膜过滤除菌；将过滤后收集的上清液再加入等体积的pH为7.4 PBS（磷酸盐缓冲液）稀释，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，弃去上清，再用pH为7.4的PBS溶解沉淀至完全溶解，混合均匀后再加入饱和硫酸铵，静置，离心，弃去上清保留沉淀，加入pH为7.4的PBS至沉淀恰好溶解并过量0-20%，即得抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体溶液。
步骤1）中灭活条件为37℃灭活24h。
步骤1）所述离心条件为4℃，5000r/min。
步骤2）A所述具体免疫步骤为：选用健康产卵非免疫产蛋鸡隔离饲养，鸡胸肌两侧分别注射500ul浓度为410ug/ml的抗原溶液进行首次免疫，22周龄胸肌两侧再分别注射500ul浓度为620ug/ml的抗原溶液进行二次免疫，二次免疫一周后开始收集免疫鸡蛋；
步骤2）B调节pH的盐酸的浓度为0.1%。
步骤2）B中饱和硫酸铵的加入量为PBS体积的33%。
步骤2）B中静置和离心的条件为：4-10℃静置2-6h，10000r/min离心15-30min。
步骤2）B中所述新洁尔灭的浓度为0.5%。
本发明抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体，采用首先收集菌毛，然后通过鸡机体免疫后收集鸡卵黄中的抗大肠杆菌抗体。其中本发明在从免疫鸡蛋都收集抗大肠杆菌抗体时采用硫酸铵溶液进行纯化，经试验证实，得到的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体的效价得到了明显的提高。
附图说明
图1为菌群测定试验的结果示意图，其中1 为标准高分子量蛋白质，2为标准低分子量蛋白质，3为IgY电泳图。
具体实施方式
实施例
本实施例以大肠杆菌K88、K99、987P菌株为例，制备抗大肠杆菌K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体。其具体如下步骤：
1）菌毛抗原的制备：
取大肠杆菌K88、K99、987P菌株，在TSB液体培养基中培养至对数期，4℃ 5000r/min离心，弃去上清，用生理盐水洗涤沉淀，重复离心、洗涤2次，收集菌体，按照菌体体积的0.45%加入甲醛，37℃灭活24h，加入含甲醛菌体体积0.01%的柳硫汞；按照菌体：油佐剂1：1的比例加入白油佐剂，研磨制成均一的油包水型抗原溶液；
2）抗大肠杆菌K88、K99、987P鸡卵黄抗体的制备：
A免疫：选用健康产卵非免疫产蛋鸡隔离饲养，鸡胸肌两侧分别注射500ul浓度为410ug/ml的抗原溶液进行首次免疫，22周龄胸肌两侧再分别注射500ul浓度为620ug/ml的抗原溶液进行二次免疫，二次免疫一周后开始收集免疫鸡蛋；
B抗大肠杆菌鸡卵黄的分离及处理：
将收集的免疫鸡蛋用清水洗净后，再用0.5%的新洁尔灭浸泡30min，晾干，分离蛋黄；将分离的蛋黄按照1：7-8的比例加入生理盐水稀释，再利用0.1%的盐酸调节蛋黄液pH至5-5.5，搅拌15min，4-10℃静置2-6h，收集上清弃去脂蛋白沉淀，10000r/min水平离心30min，除去大量的脂类，收集上清，将上清进行连续的超滤膜分离，得到浓缩截留液，再用0.45μm膜过滤除菌；将过滤后收集的上清液再加入等体积的pH为7.4 PBS（磷酸盐缓冲液）稀释，再加入pH为6.0-7.0的饱和硫酸铵溶液（占PBS体积的33%），4-10℃静置2-6h，10000r/min离心15min，弃去上清，再用pH为7.4的PBS溶解沉淀至完全溶解，混合均匀后再加入饱和硫酸铵（占第二次PBS体积的33%），4-10℃静置2-6h，10000r/min离心15min，弃去上清，保留沉淀，加入pH为7.4的PBS至沉淀恰好溶解并过量0-20%，即得抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体溶液。
实验例
采用本发明实施例得到的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体进行实验，检测其各项性能及参数。
1、菌群的测定
分子量的测定：SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度5%，电流11mA，电压200V，时间3.5h，Marker采用低相对分子质量标准蛋白质，取下凝胶用于常规考马斯亮兰染色，如图1所示，结果在180KD处出现一条清晰的电泳带，其分子量约为180KD。
纯度分析：双向免疫扩散法，结果出现一条沉淀线（试验结果的沉淀线与背景色差较小，很难拍摄制成照片，一般只能用肉眼观察到），说明抗体纯度高。
安全检验：随机抽取健康10只小鼠，每只接种0.5ml，观察10天，每天记录接种后小鼠的异常情况。结果显示：10只小鼠健活。
2、无菌检验
取卵黄抗体接种于普通营养琼脂培养基和厌氧肉汤培养基上，37℃培养箱内培养48h。结果没有菌落生长。
3、活性检测
A. ELISA间接法 活性检测采用ELISA间接实验，其操作方法按照常规的ELISA间接法，每孔加100ul实施例制备的抗原溶液，按照常规方法进行包板。将制备好的包板加入100ul的PBS用洗板机洗涤5次，然后再每孔加100ul被测的抗体，37℃孵育1h，用PBS洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的羊炕鸡IgY（工作浓度为1:3000）100ul，37℃孵育1h，用PBS洗涤5次，加入100ul TBM底物显色液，反应10min，最后加入100ul终止液硫酸，用酶联免疫检测仪吸光值492nm下测定OD值。结果显示：精制的抗大肠杆菌K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的效价为：16000-17000。
B. 琼脂扩散法 按照通常的方法进行，结果显示此方法测得的抗体效价可达1：256。
4动物攻毒中和试验
随机抽取未吃初乳的仔猪10头，随机分为两组。攻毒组共度剂量为1.0×108CFU/头，随时观察仔猪的情况。在刚出现腹泻症状时就饲喂精制卵黄抗体溶液4ml，每日2次；对照组饲喂等量蒸馏水，观察仔猪的症状，以粪便指数、精神状况和死亡率为指标来反映卵黄抗体的疗效。
试验结果显示：攻毒后8-12h仔猪就出现不同程度的腹泻，口服卵黄抗体16h症状有所减轻，精神状况也有所好转，36h后仔猪粪便变为粘稠，60h后基本恢复正常，精神也恢复正常；而饲喂蒸馏水组的仔猪粪便呈现水样，精神极度沉郁，40-60h出现死亡，死亡率为40-85%。
5、热稳定的测定
在50℃、60℃时抗体的效价没有什么损失，还在17000、70℃加热15min，抗体的抗菌活性损失很小，抗体效价在16000以上，说明抗体有很好的热稳定性；在-20冻融3次，抗体仍然有很好的抗菌活性，测试其效价仍在16000以上。
Claims (8)
1.一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：其步骤如下：
1）菌毛抗原的制备：
取大肠杆菌菌株，在TSB液体培养基中培养至对数期，离心，弃去上清，用生理盐水洗涤沉淀，重复离心、洗涤2次，收集菌体，按照菌体体积的0.45%加入甲醛，灭活，加入含甲醛菌体体积0.01%的柳硫汞；按照菌体：白油佐剂为1：1的比例加入白油佐剂，研磨制成均一的油包水型抗原溶液；
2）抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的制备：
A免疫：采用抗原溶液对健康鸡进行免疫，免疫后收集免疫鸡蛋；
B抗大肠杆菌鸡卵黄的分离及处理：
将收集的免疫鸡蛋用清水洗净后，再用新洁尔灭浸泡30min，晾干，分离蛋黄；将分离的蛋黄按照1：7-8的比例加入生理盐水稀释，再用盐酸调节稀释好的蛋黄液pH至5-5.5，搅拌，静置，收集上清弃去脂蛋白沉淀，离心，除去大量的脂类，收集上清，将上清进行连续的超滤膜分离，得到浓缩截留液，再用0.45μm膜过滤除菌；将过滤后收集的上清液再加入等体积的pH为7.4 PBS（磷酸盐缓冲液）稀释，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，弃去上清，再用pH为7.4的PBS溶解沉淀至完全溶解，混合均匀后再加入饱和硫酸铵，静置，离心，弃去上清保留沉淀，加入pH为7.4的PBS至沉淀恰好溶解并过量0-20%，即得抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体溶液。
2.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：步骤1）中灭活条件为37℃灭活24h。
3.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：步骤1）所述离心条件为4℃，5000r/min。
4.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：步骤2）A所述具体免疫步骤为：选用健康产卵非免疫产蛋鸡隔离饲养，鸡胸肌两侧分别注射500ul浓度为410ug/ml的抗原溶液进行首次免疫，22周龄胸肌两侧再分别注射500ul浓度为620ug/ml的抗原溶液进行二次免疫，二次免疫一周后开始收集免疫鸡蛋。
5.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：步骤2）B调节pH的盐酸的浓度为0.1%。
6.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：步骤2）B中饱和硫酸铵的加入量为PBS体积的33%。
7.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：步骤2）B中静置和离心的条件为：4-10℃静置2-6h，10000r/min离心15-30min。
8.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法，其特征在于：步骤2）B中所述新洁尔灭的浓度为0.5%。
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