CN101434928A - 表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌及其构建方法与应用。该菌株导入了鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因重组质粒，通过如下步骤构建：1.鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因及各功能性基因的PCR扩增；2.重组质粒的构建。此外，本发明还公开了一种鸡大肠杆菌重组菌毛基因工程疫苗。本发明的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其表达产物为菌毛突起形态，具有良好的免疫原性，且其培养表达的产量高，成本低，易于实现疫苗产业化生产。

Description

表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)所引起。本病有很多临床表现，最常见的表现是气囊炎、心包炎、肝周炎和死亡。随着集约化养禽业的发展，致病性大肠杆菌带来的危险性不断增长，使本病难以控制，以至世界范围内造成重大损失。虽然抗生素的使用可获得暂时的保护，但细菌产生的耐药性反而成为一种潜在的危害。因此，迫切需要一种安全、有效的免疫原作为疫苗。大肠杆菌1型菌毛是鸡大肠杆菌病的一种重要的致病因子，是细菌表面的一种丝状蛋白质突起，兼有毒力因子及免疫原的特点，因而菌毛一直是国内外科技工作者感兴趣的研究对象之一。1型菌毛主要起粘附作用，它可与鸡气管粘膜及气囊上皮上的甘露糖受体结合，这种结合对大肠杆菌在鸡呼吸道的定居起到至关重要的作用。大多数鸡致病性大肠杆菌带有1型菌毛。1型菌毛由操纵子基因控制的，有fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG和fimH等基因组成，其中fimA和fimH为结构基因，菌毛蛋白99.99％为fimA所编码。1型菌毛作为一种由蛋白主体装配而成的丝状物具有良好的免疫原性。近些年来亚单位菌苗的研究越来越多，Gyimah等用鸡大肠杆菌O1菌株天然菌毛制成油乳剂苗免疫雏鸡后发现，免疫鸡能很强地耐受同源O1菌株对气囊的攻击，用O1、O2及O78菌体菌毛制成的多价疫苗则具有显著的交叉保护效果。我国学者也相继报道了鸡大肠杆菌菌毛疫苗免疫的效果，但该类产品保护范围有限，对其它血清型的致病菌保护力有限。用天然菌毛制成的疫苗虽然保护力高，但由于表达量不大，加上提取菌毛繁杂，增加了疫苗的成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌，以提高免疫的效果，降低防治鸡大肠杆菌病疫苗的生产成本。

本发明的另一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌的构建方法。

本发明还有一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。

本发明的再一目的是提供一种鸡大肠杆菌1型菌毛基因工程疫苗。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其导入了鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因重组质粒。

其中，受体菌株为TG1或HB101(fim^-)。

上述表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，包括如下步骤：

1、鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因及各功能性基因的PCR扩增；

2、能够呈现表达1型菌毛的重组质粒的构建。

其中，步骤1所述的鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的PCR扩增包括如下步骤：

a、引物的设计与合成；

b、染色体的提取；

c、鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的分段扩增、连接、转化与表达。

其中，步骤2所述的重组质粒的构建方法包括如下步骤：鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的各个PCR扩增产物的连接、质粒构建和操纵子基因表达质粒的连接、构建与鉴定、以及表达的1型菌毛的抗原制备、疫苗制备与免疫效果检验。

其中，步骤2中所使用的质粒为pUC18或pUCm-T。

通过上述方法构建的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌属于重组大肠杆菌(带1型菌毛)，菌株保藏号为：CCTCC M 208033，日期2008年3月11日；保藏地点为：武汉，中国典型培养物保藏中心。

表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。

一种鸡大肠杆菌1型菌毛基因工程疫苗，它是通过如下方法制得：将表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的表达菌毛产物与吐温-80按体积比94:6混匀作为水相，司本-80与10号白油按体积比6:94加热溶解作为油相，油相与水相按体积比3:1的比例乳化。

有益效果：本发明的表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌通过基因重组的方法大量表达1型菌毛，与别的表达不同的是，本发明的表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌表达具有天然1型菌毛突起状蛋白，而不是包涵体表达蛋白，因而免疫原性很强，且其培养表达的产量高，成本低，易于实现疫苗产业化生产。

附图说明

生物材料保藏情况：日期2008年3月11日，单位中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，编号M208033。

图1为大肠杆菌1型菌毛基因结构及引物相对位置。

图2为片段BEA PCR扩增产物电泳，其中，1为λ-HindIII digest DNA Marker，2为BEA PCR扩增产物约3300bp。

图3为片段IC，D PCR扩增产物，其中，1为λ-HindIII digest DNA Marker，2为ICPCR扩增产物约2050bp，3为D PCR扩增产物约2150bp。

图4为片段D’，FGH PCR扩增产物，其中，1为λ-HindIII digest DNA Marker，2为D’PCR扩增产物约2150bp，3为FGH PCR扩增产物约2300bp。

图5为SOE PCR扩增产物，其中，1为DFGH PCR扩增产物约4300bp，2为1KbpDNALadder Marker。

图6为质粒pBEA酶切电泳，其中，1，2为pBEAEcoR1+Kpn1双酶切，3，4为pBEAEcoR1单酶切，5为λ-HindIII digest DNA Marker。

图7为质粒pUCm-IC双酶切电泳，其中，1为λ-HindIII digest DNA Marker，2，3，4为pUCm-IC/Kpn1+BamH1。

图8为质粒pUCm-D双酶切电泳，其中，1为1KbpDNA Ladder Marker，2，3为pUCm-D/BamH1+Sal1。

图9为pBC酶切电泳，其中，1为pBC BamH1单酶切，2为pBC Kpn1+BamH1双酶切，3为λ-HindIII digest DNA Marker。

图10为pBD酶切电泳，其中，1为λ-HindIII digest DNA Marker，2为pBD BamH1单酶切，3为pBD BamH1+Sal1双酶切。

图11为pBH酶切电泳，其中，1为λ-HindIII digest DNA Marker，2为pBH BamH1单酶切，3为pBH BamH1+Sal1双酶切。

图12为表达的菌毛电镜，其中A为HB101(pBC)，B为HB101(pBH)。

具体实施方式

以下实施例中使用的材料如下：

1、宿主菌：受体菌株TG1和HB101(fim^-)，由金陵科技学院动物医学系保存。

2、质粒：pUC18、pUCm-T质粒载体由金陵科技学院动物医学系保存。

实施例1：鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的分段PCR扩增

1、引物设计

根据GenBank上发表的序列，运用Primer 5.0设计四对引物，送Invitrogen公司合成。引物用超纯水稀释成20pmol/L，置于-20℃冻存。引物序列如下：

P1：5’-GGGAATTCAGTGACCAAAGCCATATTTACC-3’

P2：5’-GGGGTACCTGGGTAGGTTATTGATACTG-3’

P3：5’-AAGGTACCGGGACGTCATTACGGGCAG-3’

P4：5’-GGGCCCCCAATCCGATTCTGTACACTA-3’

P5：5’-CTGACGATCCCTCAGGCATTTATGAG-3’

P6：5’-AAGTCGACACGCCCCCTTAACGACATTC-3’

P7：5’-AAGGTTTGTTTCTCATCACGCCCCC-3’

P8：5’-CGTCGATTTAGATAACGCGGTTGCTAACG-3’

P9：5’-ATGTCGACTGGCCTACAAAGGGCTAACGTG-3’

鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因结构及引物相对位置见图1。

2、细菌模板的制备

①细菌培养：冻干保存的O18菌株划LB平板，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种LB液体培养基，200rpm振荡培养16-18h，通过血凝及甘露糖敏感性血凝试验确定1型菌毛生长，如无血凝继续培养，直至有血凝。

②煮沸法制备PCR模板：取适量细菌培养物离心，沉淀用100μl灭菌超纯水悬浮，煮沸5min，冰上放置，冷却后4℃，10000rpm离心2min，取上清-20℃保存备用。

3、PCR反应体系及各片段扩增程序

①片段BEA(fimB+fimE+fimA)的扩增

整个反应体系如下(50μl)：

TaKaRa LA Taq(5U/μl)                         0.5μl

10×LA PCR Buffer II(Mg2+free)                5μl

MgCl2(25mM)*1                                 5μl

dNTP Mixture(各25mM)                          8μl

模板DNA                                       2μl

P1                                            1μl

P2                                            1μl

ddH2O           upto                          50μl

PCR循环参数：模板DNA 94℃变性1min后，按94℃(30sec)-59℃(40sec)-72℃(3min30sec)共进行30个循环，然后72℃再延伸10min，4℃保存。

②片段IC(fimI+fimC)、D(fimD)的扩增

整个反应体系如下(50μl)：

TaKaRa Ex Taq(5U/μl)               0.5μl

10×LA PCR Buffer II(Mg2+free)     5μl

MgCl2(25mM)*1                      5μl

dNTP Mixture(各25mM)               6μl

模板DNA                            2μl

P3 or P5                           1μl

P4 or P                   61μl

ddH2O          upto       50μl

PCR循环参数：模板DNA94℃变性2min后，按94℃(20sec)-59℃(30sec)-72℃(2min30sec)共进行30个循环，然后72℃再延伸10min，4℃保存。

③SOE PCR扩增片段DFGH(fimD+fimF+fimG+fimH)

1)片段D’、FGH的PCR扩增

整个反应体系如下(20μl)：

TaKaRa Ex Taq(5U/μl)                 0.2μl

10×LA PCR Buffer II(Mg2+free)        2μl

MgCl2(25mM)*1                         2μl

dNTP Mixture(各25mM)                  3μl

模板DNA                               1μl

P5 or P8                              0.5μl

P7 or P9                              0.5μl

ddH2O              upto               20μl

PCR循环参数：模板DNA 94℃变性2min后，按94℃(20sec)-58℃(30sec)-72℃(2min30sec)共进行30个循环，然后72℃再延伸10min，4℃保存。

2)片段DFGH扩增

以上述PCR产物为模版，P5，P9为引物，以SOE方式连接片段D’和片段FGH。

反应体系如下(20μl)：

TaKaRa Ex Taq(5U/μl)                   0.2μl

10×LA PCR Buffer II(Mg2+free)          2μl

MgCl2(25mM)*1                           2μl

dNTP Mixture(各25mM)                    3μl

片段D’                                 0.5μl

片段FGH                                 0.5μl

P5                                      0.5μl

P9                                      0.5μl

ddH2O             upto                  20μl

PCR循环参数：模板DNA 94℃变性2min后，按94℃(30sec)-56℃(1min)-72℃(4min10sec)共进行30个循环，然后72℃再延伸10min，4℃保存。

4、PCR产物的电泳鉴定与纯化回收

①琼脂糖凝胶电泳

取PCR产物5μl，与1μl 6×loading buffer(0.25％ Bromophenol blue，0.25％Xylencyanol，15％Ficoll)混匀，1.0％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/ml)电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE(5.5g Tris-HCl，2.75g硼酸，2ml 0.5M EDTA，加蒸馏水至1L)恒压100V，90min后，在凝胶成像系统中观察结果。

②DNA片段的纯化回收

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳之后，切下目的条带，按胶回收试剂盒说明书回收片段，最后溶于40μl TE，-20℃保存备用。

实施例2：PCR产物的克隆

①感受态细胞的制备及转化

采用CaCl₂法制备感受态细胞TG1，用于重组质粒的转化，实验操作如下。

将片段BEA的PCR产物用EcoR I、Kpn I酶切消化，电泳鉴定切胶回收，融于30μlTE，-20℃保存备用。pUC18经EcoR I、Kpn I酶切消化后，再经CIAP去磷酸化，苯酚/氯仿等抽提后溶于20μlTE，-20℃保存备用。按3：1的量将目的片段与酶切后的载体混合，在16℃下用T4 DNA连接酶连接过夜，并转化感受态细胞TG1，通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆。

②片段IC、D的T/A克隆

片段IC、D各6μl分别与1μl pUCm-T载体混合，在16℃下用T4 DNA连接酶连接过夜，并转化感受态细胞TG1，通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆，以构建质粒pUCm-IC、pUCm-D。

结果显示，利用设计的引物以O18菌株基因组DNA为模版，成功地扩增出了特异性的目的条带，其大小均与预计大小一致。

实施例3：鸡大肠杆菌的1型菌毛操纵子基因表达载体的构建

①pBC的构建

将质粒pBEA与pUCm-IC经Kpn1和BamH1双酶切，电泳鉴定切胶回收，分别溶于30μlTE，-20℃保存备用。取回收的pBEA3μl，回收的片段IC8μl，加入T4 DNALigase1μl，T4 DNALigase Buffer 2.5μl，加去离子水至25μl，16℃连接过夜。取连接产物10-15μl转化感受态细胞TG1，通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆，构建载体pBC。

②pBD的构建

将质粒pBC与pUCm-D经BamH1和Sal1双酶切，电泳鉴定切胶回收，分别溶于30μlTE，-20℃保存备用。取回收的pBC3μl，回收的片段D8μl，加入T4 DNALigase 1μl，T4 DNALigase Buffer 2.5μl，加去离子水至25μl，16℃连接过夜。取连接产物10-15μl转化感受态细胞TG1，通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆，构建载体pBD。

③pBH的构建(即1型菌毛操纵子基因表达载体构建)

将质粒pBC或pBD与SOE PCR产物片段DFGH经BamH1和Sal1双酶切，电泳鉴定切胶回收目的片段，分别溶于30μlTE，-20℃保存备用。取回收的pBC3μl，回收的片段D8μl，加入T4 DNALigase 1μl，T4 DNALigase Buffer 2.5μl，加去离子水至25μl，16℃连接过夜。取连接产物10-15μl转化感受态细胞TG1，通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆，构建载体pBH。

④重组质粒酶切鉴定

从转化的平板上挑取单个菌落，接种4mlLB(Amp+)液体培养基，37℃，230rpm振荡培养过夜，用碱裂解法小提质粒。用25μl体系进行酶切，质粒各6μl，10×buffer2.5μl，限制性内切酶各0.5μl，添加超纯水至25μl，37℃消化3h后经1.0％琼脂糖电泳鉴定阳性克隆。

重组质粒pBC、pBD、pBH酶切鉴定证实扩增片断正确。

本试验根据国内外已发表的人源大肠杆菌1型菌毛操纵子基因序列和GenBank中fim基因簇的部分片段序列信息，利用DNAstar和Primer 5.0软件分析设计了九条引物，利用PCR技术以YR10(O18)菌株基因组DNA为模板，分段扩增出包含fim基因簇的各片段BEA、IC、D、D’和FGH，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，各PCR产物均与预期大小相符，并将编码大肠杆菌1型菌毛表达的必需序列的片段BEA、IC和D分别克隆到pUC18或pUCm-T载体，经酶切鉴定，成功地构建了质粒pBEA、pUCm-IC和pUCm-D。然后利用相应的限制性内切酶切下pUCm-IC和pUCm-D中的fim基因片段，依次连接到pBEA中，构建了质粒pBC和pBD，其中pBD编码禽大肠杆菌1型菌毛表达的必需序列。最后通过SOE PCR将片段D’和FGH连接起来，并克隆到质粒pBC中以构建包含鸡大肠杆菌1菌毛完整操纵子基因的质粒pBH(所有构建质粒见表1)。

采用PCR方法从基因组DNA直接扩增目的片段并定向克隆到相应的载体中与构建文库相比更具目的性，避免了盲目而繁琐的筛选工作，可以很快地得到目的基因，继续下一步工作，节省了大量的时间和精力。

本试验所构建的质粒包含了禽大肠杆菌1型菌毛不同fim基因簇，是研究禽大肠杆菌1型菌毛fim基因所编码的各亚单位的功能及相互关系的基础。

表1 鸡大肠杆菌1菌毛基因的质粒

实施例4：禽大肠杆菌1型菌毛表达及亚单位功能探究

1、感受态细胞的制备与转化

采用CaCl2法制备感受态细胞HB101，用于重组转化。具体操作按文献[7]实验步骤进行。

2、大肠杆菌1型菌毛的表达

①大肠杆菌1型菌毛抗血清的制备

②野生型大肠杆菌1型菌毛的提取

鸡大肠杆菌O18，O78，TK3菌株第三代LB培养物经血凝及甘露糖敏感性血凝试验证实已大量表达1型菌毛后，分别取4000ml培养物于4℃，3600rpm离心30min，沉淀悬浮于冰水预冷的100ml10mmol/L Tris-Cl(PH7.5)，该悬浮液至磁力搅拌器上冰浴搅拌15min，所得菌液于4℃，3600rpm离心30min，收获上清，沉淀再同样处理2-3次，收集上清。向该上清液中加入等量饱和硫酸铵，4℃过夜。于4℃，14000rpm离心1h，取沉淀，用2mlPBS洗涤透析过夜，4℃保存备用。

③抗血清的制备

常规制备3种提纯的菌毛的菌毛油乳苗。抗菌毛血清用新西兰大白兔制备，每种血清型用两只，免疫前各采5ml血，析出血清置-20℃保存。兔子每周注射1次，背部皮下多点注射，共免疫三次，每次免疫剂量各500μg。末次免疫后10天从耳静脉采血测琼扩效价，达1：64以上后心脏采血，收集血清，置-20℃保存。由于菌毛在18℃不表达，因此，每种血清型样品取5ml于56℃处理30min后，加入相应血清型的18℃培养的细菌沉淀，混合物于4℃强烈振荡过夜，离心后去除菌体沉淀，再重复吸收1次，上清于-20℃保存备用。正常兔血清亦作同样处理。

④重组菌毛的表达鉴定

1)阳性质粒转化HB101(fim-)

将酶切鉴定的阳性质粒pBEA、pBC、pBD和pBH分别转化HB101(fim-)，用氨苄抗性及酶切鉴定筛选阳性克隆。

2)重组菌的血凝(HA)及血凝抑制(HI)反应

将鉴定后的HB101(含pBC，pBD或pBH)阳性克隆接种5mlLB(Amp+)培养基，37℃，230rpm培养8-10小时，取菌液50μl，与等量的1％鸡红细胞混合，轻轻振荡，进行玻板凝集反应，观察血凝情况，筛选血凝阳性菌。

取血凝阳性菌菌液50μl，与等量抗血清混合，室温静置5-10min，再加50μl1％鸡红细胞混匀，观察血凝抑制情况。

3)重组菌的抗体凝集反应

用菌毛抗血清鉴定重组菌毛的表达情况。将鉴定后的HB101(含pBC，pBD或pBH)阳性克隆接种5mlLB(Amp+)培养基，37℃，230rpm培养8-10小时，分别取菌液50μl与等量的菌毛抗血清混合，通过抗体凝集反应鉴定菌毛的表达。

4)重组菌的甘露糖敏感性血凝(MSHA)

取HA阳性菌50μl，与等体积含D-甘露糖混合，室温作用10min，再加入50μl红细胞混匀，轻轻摇晃玻片3-10min观察结果，以确定甘露糖能否抑制血凝。

5)细菌与酵母菌的吸附及甘露糖抑制吸附试验

取重组菌HB101(pBH)和TK3各50μl与玻片上，再分别加入50μl酵母菌混匀，轻轻摇晃玻片3-10min观察结果；

取重组菌HB101(pBH)和TK3各50μl与玻片上，分别加入50μl D-甘露糖混匀，室温静置5-10min，再分别加入50μl酵母菌混匀，轻轻摇晃玻片3-10min观察结果。

6)显微镜下观察凝集结果

为了更加清楚直观地判断凝集效果，将凝集试验的玻片置于倒置显微镜下观察，并拍照保存。

7)SDS-PAGE电泳鉴定

将分别含质粒pBEA，pBC，pBD和pBH的重组菌进行SDS-PAGE电泳。按照产品说明安装电泳装置，制备15％分离胶，5％浓缩胶。将细菌沉淀用PBS悬浮，与2×SDS加样缓冲液混匀，沸水煮沸5min变性蛋白，10000rpm离心10min，取上清，每孔上样量10μl。另设YR10(O18)、TK3作为阳性对照，以同样方法处理，同时以小分子量标准蛋白作分子量对照。先80V，40min；然后120V，1h。电泳结束后取下凝胶，考马斯兰R250室温染色2h，用脱色液脱色至背景清晰，拍照保存。

8)重组菌毛的电镜观察

将重组菌HB101(pBC)、HB101(pBD)、HB101(pBH)分别接种于LB(Amp+)，37℃，200rpm振荡培养过夜，10000rpm离心2min，沉淀用PBS洗涤悬浮。吸取少量菌液滴于玻板上，将铜网正面向下浮于菌液表面，约10min后取出铜网，用磷钨酸负染5min，白炽灯下烘干，电镜下观察并拍照保存；阳性对照TK3亦作同样处理。

实施例5：重组表达菌毛油乳剂疫苗制备

将纯化的重组菌毛作为抗原液，抗原液与吐温-80按体积比94:6混匀作为水相，司本-80与10号白油按体积比6:94加热溶解作为油相。油相:水相按体积比3:1的比例乳化。乳化时，先加入油相，低速搅拌，缓慢加入水相后，再高速乳化2min，置4℃备用。疫苗中最后的重组蛋白含量为400μg/ml。

实施例6：免疫试验

将3周龄健康罗曼小公鸡分成4组，第1组和第2组每雏分别皮下注射0.5ml的O18天然菌毛疫苗和重组菌毛疫苗；第3组不免疫作为攻毒对照；和第4组不免疫也不攻毒作为阴性对照组。各组隔离饲养至7周龄。分别用同源菌株O18经后胸气囊攻毒，每只鸡的剂量是4.3×10⁸CFU。持续观察一周，记录发病死亡情况。对死亡的和未死亡的鸡均予解剖，观察气囊、肝脏和心包的病变，根据病变程度打等级分，并作记录、统计。实验结果见表2。

表2 鸡大肠杆菌重组与野生1型菌毛疫苗免疫保护试验结果

注：病变结果判定标准：

0＝无病变；1＝轻度气囊炎、心包炎、性肝炎；2＝中度气囊炎、心包炎、肝炎；3＝两侧性气囊炎、广泛心包炎、肝炎；4＝严重广泛性纤维性气囊炎、心包炎、肝炎。

从试验结果看，重组表达菌毛与天然菌毛在免疫攻毒保护衰及病理表现方面均无明显差异，保护率均在90％以上。

Claims (7)

1、一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其特征在于所述菌株导入了鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因重组质粒。

2、根据权利要求1所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其特征在于所述的菌株为TG1或HB101(fim^-)。

3、权利要求1所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因及各功能性基因的PCR扩增；

(2)能够呈现表达1型菌毛的重组质粒的构建。

4、根据权利要求3所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，其特征在于步骤(1)所述的鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的PCR扩增包括如下步骤：

(a)引物的设计与合成；

(b)染色体的提取；

(c)鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的分段扩增、连接、转化与表达。

5、根据权利要求3所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，其特征在于步骤(2)中所使用的质粒为pUC18或pUCm-T。

6、表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。

7、一种鸡大肠杆菌1型菌毛基因工程疫苗，其特征在于它是通过如下方法制得：将表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的表达菌毛产物与吐温-80按体积比94:6混匀作为水相，司本-80与10号白油按体积比6:94加热溶解作为油相，油相与水相按体积比3:1的比例乳化。

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