CN103468626B

CN103468626B - 制备特异性沙门氏菌h:6诊断血清的工程菌株及构建方法

Info

Publication number: CN103468626B
Application number: CN201310446593.XA
Authority: CN
Inventors: 冯露; 蒋新蕾; 王磊
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: CN103468626A

Abstract

本发明公开了一种能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株及其构建方法，它是利用现代分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，构建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；将不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到适合表达的载体中，并转入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遗传背景，含有不同病原微生物特异性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。利用上述技术体系能够构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗体库。该抗体库可补充现有抗血清种类，同时也可为其他免疫学技术的应用提供基础。

Description

制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株及构建方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，涉及能够制备特异性沙门氏菌系列诊断血清的工程菌株，更具体说是一种能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株及构建方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，是革兰氏阴性菌。沙门氏菌广泛分布于自然环境及动物的肠道中，大多数能引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，有些菌株能造成人类的食源性疾病。

鞭毛是负责细菌运动的器官，对细菌致病性也有重要影响。细菌的鞭毛蛋白具有强的免疫原性，构成了细菌的鞭毛抗原(Hantigen)。鞭毛蛋白与细菌的致病机理、生物膜的形成有密切的关系，也是被内在的免疫系统通过Toll-like5受体所识别的一种与致病性相关的分子。鞭毛抗原（H抗原）是沙门氏菌等革兰氏阴性菌表面的主要抗原之一，其血清学水平上的变异在种内分型上有重要意义。鞭毛相位变异（选择性表达2个不同的鞭毛蛋白基因）是细菌的一种重要机制，可以使细菌适应不只一种生存环境，尤其是可以逃避宿主免疫系统。沙门氏菌有两种表面抗原：O-抗原和鞭毛蛋白（H-抗原）。沙门氏菌的鞭毛蛋白是由fliC或fljB基因所编码的，约1.5kb。沙门氏菌的H抗原分为第一相和第二相。一相由fliC编码，二相由fljB编码，这两个基因通过变位机制协同表达。目前，已经确定了沙门氏菌46种O抗原和114种H抗原，在不同的组合下，产生2523种血清型。

研制沙门氏菌诊断血清一直是生物制品领域的热门课题。传统制备诊断血清的方法包括免疫原及免疫血清的制备，吸收与检定及稳定性试验等相关步骤已经非常成熟。但传统方法耗时长，工作量大。且获得的是多克隆血清，其特异性不高，常发生一些交叉反应。本发明致力于改造传统的多克隆抗体制备体系，利用当今生物学领域最经典的现代分子生物学技术，如基因缺失、克隆构建等技术实现了快速制备特异性的沙门氏菌诊断血清。利用本发明的技术能够生产用传统方法很难生产的血清，同时还可以构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗原库。利用该抗原库能够建立包含多种沙门氏菌特异抗体的抗体库，该抗体库可补充现有抗血清种类。

发明内容

本发明的目的是构建能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株；

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其特征在于：它是将含有编码鞭毛抗原6基因的重组质粒pTrc99a-fljB(6)，转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌中得到的能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株。

更具体地说是将fliC基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，得到相应的缺失菌株G4831△fliC△fljB，然后再将构建的重组质粒pTrc99a-fljB(6)转入其中，筛选得到能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株。

本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC，缺失后基因大小为1100bp（氯霉素乙酰转移酶基因），其序列为SEQIDNO：1。

本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB，缺失后基因大小仍为1500bp（卡那霉素抗性基因），其序列为SEQIDNO：2。

本发明进一步公开了能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831△fliC△fljB)的构建；

(2)重组质粒pTrc99a-fljB(6)的构建；

(3)含有重组质粒pTrc99a-fljB(6)的克隆菌株的构建。

本发明利用现代分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，构建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；将不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到适合表达的载体中，并转入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遗传背景，含有不同病原微生物特异性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。用制备的工程菌抗原免疫动物，用具有相同遗传背景但不含鞭毛抗原的宿主菌吸附除去非目的抗体，能够实现交叉反应的有效去除和抗体制备的标准化和工程化。利用本发明的技术可以获得能够制备特异性H:k,H:r,H:y,H:z,H:z6,H:z10,H:z13,H:z15,H:z28,H:z29,H:v,H:w,H:6等多种沙门氏菌诊断血清的工程菌株。

本发明更加详细的构建方法如下：

1、表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831△fliC△fljB)的构建

本发明选用本实验室编号为G4831（格罗斯出浦沙门氏菌）为目的菌株，利用噬菌体λ的Red重组系统介导鞭毛基因fliC和fljB的缺失。现针对fliC基因说明一下主要过程，先合成一对引物，每一条引物的5′端有39bp与fliC基因同源，3′端与抗氯霉素基因同源（用于筛选），以抗氯霉素模板质粒pKD3(GenebankAY048742)的氯霉素乙酰转移酶基因为模板，通过PCR扩增获得中间为一个约1033bp的氯霉素乙酰转移酶基因，其两端为39bp同源臂的线性打靶DNA片段，通过切胶回收纯化得到该片段。将该线性打靶DNA片段电击转化到提前导入Red重组系统的G4831中诱导Red重组系统适量表达，λ核酸外切酶结合到线性打靶DNA片段两39bp同源臂末端，酶切产生游离3′单链DNA区段，从而使两同源臂和G4831染色体间以链侵入的方式发生重组。线性打靶DNA片段插入到G4831染色体上fliC基因两同源臂之间，而G4831染色体上两同源臂间的fliC基因序列被其置换，从而完成了fliC基因的缺失，得到的fliC基因缺失菌株。

本发明中的Red重组系统由pSim质粒完成，需要提前导入到目的菌株中。pSim质粒载有适用于很多肠道细菌的DNA重组系统，是一种温度敏感性质粒，在42℃时表达，温度高于32℃时即丢失。

fljB基因的缺失是在fliC基因缺失菌株基础上引入另一个抗性筛选片段完成的，和fliC基因的缺失的原理相同。经过上述两次缺失，得到fliC基因和fljB基因均缺失的菌株。

2、重组质粒pTrc99a-fljB(6)的构建

本发明通过比对ncbi上和鞭毛抗原6相关的fljB基因序列，经过比对分析设计fljB基因通用扩增引物，在两条引物的5′端分别加入Nco和BamH的酶切位点。

本发明选用pTrc99a这一低拷贝质粒作为克隆载体，以本实验室编号为G4819（伦敦沙门氏菌）基因组为模板，用fljB基因通用扩增引物PCR扩增fljB基因（鞭毛抗原6基因），用Nco和BamH做双酶切，与同样经过双酶切的载体连接，得到含有鞭毛抗原6基因的重组质粒。

3、含有重组质粒pTrc99a-fljB(6)的克隆菌株的构建

将经过酶切和PCR鉴定正确的重组质粒电转化入fliC基因和fljB基因均缺失的菌株中，经过抗性筛选转化子和菌落PCR鉴定，得到含有能够表达鞭毛蛋白6的重组质粒的克隆菌株。

4、验证克隆表达实验：

利用细菌动力实验和血清学实验验证重组质粒的表达情况。

细菌动力实验具体是利用细菌鞭毛的游动性原理，长鞭毛的细菌能在半固体培养基中游动，不长鞭毛的细菌则无法游动，如果重组质粒能够表达出鞭毛蛋白，同时该鞭毛蛋白可以组装到鞭毛缺失菌的表面，使其长出鞭毛，恢复动力。本发明将利用克隆菌株在半固体培养基上的游动情况验证重组质粒的表达情况。

血清学实验具体是利用鞭毛抗原与相应抗体的特异性结合反应，有鞭毛的细菌能和相应的抗体发生凝集反应，没有鞭毛的细菌则不能，如果重组质粒能够表达出鞭毛蛋白，该鞭毛蛋白能够组装到鞭毛缺失菌的表面，使其长出鞭毛，就可以用血清来检测鞭毛抗原的存在情况。本发明将利用克隆菌株与相应血清有无凝集反应这一情况来验证重组质粒的表达情况。

本发明制备的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株与现有技术相比，具有如下优点

1、可行性好：本发明利用实验室最基本的分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，通过做缺失，建克隆等途径得到能够有效表达鞭毛蛋白6的菌株，从而获得特异性的沙门氏菌H:6诊断血清，方法实用，可行；

2、实用性强：通过本发明制备特异性的沙门氏菌H:6诊断血清。和传统方法相比减少了大量的吸收去除工作，更省时，且工作量降低，生产的血清特异性高，交叉少，大大降低了生产血清的成本；

3、灵活性好：利用本发明的技术能够生产用传统方法很难生产的血清，同时还可以构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗原库。利用该抗原库能够建立包含多种沙门氏菌特异抗体的抗体库，该抗体库可补充现有抗血清种类，同时也可为其他免疫学技术的应用提供基础。

附图说明

图1是本发明所使用的噬菌体λRed重组系统的原理示意图；

图2是本发明fliC基因缺失菌G4831△fliCPCR筛选电泳结果图；图中M：DNAMarker(DL2000)；1、ddH₂Ocontrol；2、野生型strainG4831；3-5、G4831△fliCmutants；

图3是本发明fljB基因缺失菌G4831△fliC△fljBPCR筛选电泳结果图；图中M：DNAMarker(DL2000)；1、ddH₂Ocontrol；2、野生型strainG4831；3-5、G4831△fliC△fljBmutants；

图4是本发明制备的沙门氏菌缺失菌株G4831△fliC△fljB的fliC和fljB的缺失的遗传稳定性鉴定，M：DNAMarker(DL2000)；1和6、ddH₂Ocontrol；2和7、野生型strainG4831；3-5、threegenerationsofG4831△fliCmutant；8-10、threegenerationsofG4831△fliC△fljBmutant；

图5是本发明构建的表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB的生长曲线；

图6是本发明中重组质粒pTrc99a-fljB(6)构建的流程图；

图7是本发明中构建的重组质粒pTrc99a-fljB(6)的物理图谱；

图8是对重组质粒的鉴定，其中：图8A：是重组质粒pTrc99a-fljB(6)的酶切鉴定结果，图中M：DNAMarker(DL2000Plus)；1-3、pTrc99a-fljB(6)/Nco+BamH；图8B：是重组质粒pTrc99a-fljB(6)的PCR鉴定结果，图中M：DNAMarker(DL2000)；1、ddH₂Ocontrol；2-4、PCRproductofpTrc99a-fljB(6)；

图9为本发明野生型G4831与G4831△fliC△fljB缺失菌动力板对比图；

图10为本发明G4831△fliC△fljB缺失菌与所建克隆菌株G4831△fliC△fljB(pTrc99a-fljB(6))动力板对比图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件。本发明所用到的各种试剂均有市售。

本发明所用菌株编号和来源见下表：

实验室编号	原编号	中文名称	来源
				G4819	50106	伦敦沙门氏菌	CMCC
G4831	50752	格罗斯出浦沙门氏菌	CMCC

本发明所用质粒来源见下表：

实施例1：

缺失菌株的构建

先将pSim质粒转化进目的菌株(G4831)，然后利用pSim细菌DNA重组系统将fliC基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，最终得到相应的缺失菌株G4831△fliC△fljB。

具体的步骤如下：

1、fliC基因的缺失

(1)目的菌株：

实验室现有菌株G4831(6,8:z10:e,n,z15)；

(2)fliC基因缺失引物的设计：

用于fliC基因（约1.5kb）缺失的引物以pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因为PCR模板，并分别在上、下游引物的5′端添加对应fliC基因上、下游的同源序列约39bp，扩增出来的线性打靶DNA长约1.1kb；所述引物（英潍捷基（上海）贸易有限公司合成）序列如下：

5′-atggcacaagtcattaatacaaacagcctgtcgctgttGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3′

5′-ttaacgcagtaaagagaggacgttttgcggaacctggttCATATGAATATCCTCCTTAG-3′

鉴定引物的选取位置在fliC基因起始与末端位置：

5′-ATGGCACAAGTCATTAATACAAAC-3′

5′-TTAACGCAGTAAAGAGAGGACGT-3′

(3)pKD3质粒的提取；

①从E.coliDH5α–pKD3甘油保存管中接菌于100mL2YT液体培养基（Tryptone16g，YeastExtract10g，NaCl5g，加蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min）中，加入氨苄青霉素（生工生物工程（上海）有限公司）至终浓度100μg/mL，37℃，180r/min，过夜振荡培养；②将菌液加入到96深孔板中，每孔1ml，3700rpm，离心5min；③加入150μL预冷的溶液（50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris-HCl；10mmol/LEDTA；pH8.0）和1μL100mg/ml的RNaseA（生工生物工程（上海）有限公司），重悬菌体；③加入150μL新配的溶液（1%SDS；0.2mol/LNaOH，现用现配），压紧缓慢翻转10次，菌液澄清透明；④加入150μL预冷的溶液（3mol/L醋酸钾；2mol/L乙酸），出现白色沉淀，压紧翻转10次，静置于冰水混合物中20min，此时预冷离心机；⑤将深孔板于4℃，3100rcf，离心30min，取上清300μL，转96孔截流板中2000rpm，1min除蛋白；⑥加入150μL异丙醇，充分翻转混匀，静置10min，3000rcf，离心20min，弃去上清；⑦加入150μL70%乙醇洗涤，3700rpm，离心5min，弃去上清；⑧将深孔板倒置于吸水纸上，300rpm，离心2s；⑨室温烘干，每孔加入30μL去离子水回溶，置于-40℃冰箱中备用。

(4)以pKD3为模板的扩增、产物纯化；

用于fliC基因缺失的氯霉素乙酰转移酶基因片段以pKD3为模板扩增，扩增出来的线性打靶DNA长约1.1kb，产物经过琼脂糖凝胶电泳后，用切胶纯化试剂盒（SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒生工生物工程（上海）有限公司）对1.1kb的片段进行纯化。

(5)G4831感受态细胞的制备及pSim质粒的转化、筛选；

G4831感受态细胞的制备:

①从G4831甘油保存管中接菌于10mL2YT液体培养基中，37℃，180r/min，过夜振荡培养；②按1:100的比例转接至200mL2YT液体培养基中，37℃，250r/min，振荡培养至OD600约0.4-0.6，约2.5h；③将菌液转移至4个无菌的50mL离心管中，4℃，5000r/min，离心5min；④倒掉上清，每管加入50mL无菌10%甘油（预冷）洗涤，充分重悬沉淀，4℃，5500rpm，离心5min；⑤倒掉上清，每管加入25mL无菌10%甘油（预冷）洗涤，充分重悬沉淀，将两管离心管中的菌液合成一管，4℃，5500rpm，离心5min；⑥倒掉上清，每管加入50mL无菌10%甘油（预冷）洗涤，充分重悬沉淀，4℃，5500rpm，离心5min；⑦倒掉上清，每管加入25mL无菌10%甘油（预冷）洗涤，充分重悬沉淀，将两管离心管中的菌液合成一管，4℃，5500rpm，离心5min；⑧倒掉上清，加入800μL的无菌10%甘油（预冷），充分重悬沉淀，分装至0.5mL无菌离心管中，80μL/管，于-80℃保存。

pSim质粒的转化、筛选：

取1μLpSim质粒加入到80μL感受态细胞中，用枪头轻轻混匀，加入到预冷的电转化杯中，1.8KV电击，然后立刻将200μL2YT加入到电转化杯中；将菌液涂布于含有灭瘟素(MDBio,Inc)200μg/mL的SOB（称取Tryptone20g，YeastExtract5g，NaCl0.5g，KCl0.186g，MgCl₂·6H₂O2.03g，加蒸馏水定容至1L，105℃灭菌15min，固体SOB培养基添加1.5%琼脂粉）平板上，30℃培养过夜后选取转化子；

将单克隆的转化子接种于含有灭瘟素200μg/mL的4mLSOB液体培养基中，30℃，180r/min，过夜振荡培养；

提取质粒进行鉴定：对于鉴定正确的转化子，取800μL菌液加入含有200μL无菌甘油的甘油保存管中，充分混匀，放置于-80℃保存。

(6)抗性片段的转化、筛选及鉴定；

①取10μL氯霉素乙酰转移酶基因扩增产物加入到80μL感受态细胞中，用枪头轻轻混匀，加入到预冷的电转化杯中，1.8KV电击；②将电转化杯中的菌液吸出，加入到1mLSOB培养基中，30℃180r/min震荡复苏2h；③将菌液涂布于含有氯霉素（生工生物工程（上海）有限公司）15μg/mL的SOB平板上，30℃培养过夜后选取转化子；④挑取单克隆接种于含有氯霉素25μg/mL的SOB平板上保存，并接种于20μL去离子水中，99℃煮菌15min；⑤取加热后的菌液进行PCR鉴定，野生型菌株(G4831)作为对照：

野生型菌株(G4831)和fliC缺失菌株(G4831△fliC)条带大小分别为1.5kb和1.1kb（具体见图2）。

(7)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将条带大小正确的菌株的PCR产物用切胶纯化试剂盒进行纯化，送测序鉴定；

(8)将测序正确的转化子(G4831△fliC)接种于含有氯霉素25μg/mL的10mLSOB液体培养基中，37℃，180r/min，过夜振荡培养；

(9)取800μL菌液加入含有200μL无菌甘油的甘油保存管中，充分混匀，放置于-80℃保存。

2、fljB基因的缺失

(1)目的菌株：上述构建△fliC缺失菌株G4831△fliC；

(2)用于fljB基因（约1.5kb）缺失的引物以pKD4上的卡那霉素抗性基因为PCR模板，并分别在上、下游引物的5′端添加对应fljB基因上、下游的同源序列约39bp；所述引物序列如下：

5′-atggcacaagtaatcaacactaacagtctgtcgctgttGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3′

5′-ttaacgtaacagagacagcacgttctgcgggacctggttCATATGAATATCCTCCTTAG-3′

鉴定引物的选取位置在fljB基因起始位置和卡那霉素抗性基因内部；

5′-ATGGCACAAGTAATCAACAC-3′

5′-CGGTGCCCTGAATGAACTGC-3′

(3)pKD4质粒的提取；

同上

(4)以pKD4为模板的扩增、产物纯化；

用于fljB基因缺失的kan基因片段以pKD4为模板扩增，扩增出来的线性打靶DNA长约1.5kb，产物经过琼脂糖凝胶电泳后，用切胶纯化试剂盒对1.5kb的片段进行纯化。

(5)G4831△fliC感受态细胞的制备及pSim质粒的转化、筛选；

同上

(6)抗性片段的转化、筛选及鉴定；

同上

(7)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将条带大小正确的菌株，用基因两端引物做PCR，用切胶纯化试剂盒进行纯化，送测序鉴定（具体见序列表2）；

野生型菌株(G4831)和fljB缺失菌株(G4831△fliC△fljB)条带大小分别为“-”和518bp（具体见图3）。

(8)将测序正确的转化子(G4831△fliC△fljB)接种于含有氯霉素25μg/mL，卡那霉素（生工生物工程（上海）有限公司）50μg/mL的10mLSOB液体培养基中，37℃，180r/min，过夜振荡培养。

实施例2：

表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB的生物学特性分析

(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB的遗传稳定性分析

将缺失菌株在LB固体培养基上连续传10代，每代都用fliC、fljB鉴定引物鉴定遗传稳定性，结果显示连续传10代，都只能扩增出1.1kb和518bp的片段。说明本发明制备的沙门氏菌缺失菌株G4831△fliC△fljB的fliC和fljB的缺失很稳定的（具体见图4）。

(2)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB的生长特性分析

缺失菌株G4831△fliC△fljB在0.3%的半固体平板上呈现明显的不动状态（具体见图9）。且不会从U形管的一端游到另一端。将野生型菌株和缺失菌株分别接于LB液体培养基中培养24小时，每隔一小时取样测OD600值，绘制生长曲线。结果显示，缺失菌株和野生型菌株生长情况基本一致（具体见图5），说明鞭毛基因的缺失对细菌的生长影响不大，缺失菌株的生长是很稳定的。

实施例3：

重组质粒pTrc99a-fljB(6)的构建

1、flagellinantigen6，fljB基因，扩增自实验室现有菌株G4819(3,10:1,v:1,6)。

2、由于fljB基因两端高度保守，从ncbi上下载相关鞭毛抗原6基因，经过比对，设计fljB基因通用扩增引物。

3、克隆载体：质粒pTrc99a，选择的酶切位点：Nco和BamH。

4、PCR扩增目的基因。

1)扩增引物：两端分别设计Nco和BamH酶切位点，扩增长度1.5kb左右；

Primer1：5′-CATGCCATGGCACAAGTAATCAACAC-3′(Nco)

Primer2：5′-CGGGATCCTTAACGTAACAGAGACAGCAC-3′(BamH)

2)PCR体系(50μL)：

10×PfubufferwithMgSO₄(ThermoScientific)5μL

MgSO₄(ThermoScientific)2μL

dNTP4μL

genome(G4819)1μL

Primer11μL

Primer21μL

PfuDNAPolymerase(ThermoScientific)0.5μL

ddH₂O35.5μL

3)PCR程序：

95℃3min

95℃30s

45℃30s

72℃3min30s共30cycles

72℃10min

4℃

5、PCR产物切胶回收

6、酶切

反应体系(30μL)

10×NEBBuffer3.1(NEB)3μL

fljB(6)25.2μL

Nco(NEB)0.75μL

BamH(NEB)0.75μL

10×BSA(NEB)0.3μL

10×NEBBuffer3.1(NEB)3μL

pTrc99a25.2μL

Nco(NEB)0.75μL

BamH(NEB)0.75μL

10×BSA(NEB)0.3μL

37℃酶切过夜

7、目的基因酶切产物柱纯，质粒酶切产物切胶回收，电泳检测浓度：

SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）

8、连接

连接体系(20μL)

T4DNALigase(Promega)1μL

Ligase10×Buffer(Promega)2μL

pTrc99a3μL

fljB(6)14μL

室温连接3-4小时

9、8uL连接产物加入80uLDH5α感受态中电转，加入1mLSOC（每100mLSOB培养基中加入1M葡萄糖溶液混匀即是）培养基中复苏1小时，4000rpm离心5min后涂Amp抗性平板，37℃培养过夜。

10、挑取单克隆接96孔板(2YT+Amp)，180r/min，37℃培养过夜。

11、提取质粒pTrc99a-fljB(6)。

12、酶切鉴定。

重组质粒的酶切条带大小分别为4.1kb和1.5kb左右（具体见图8）。

实施例4

克隆菌株的构建

1、制备G4831△fliC△fljB感受态细胞。

2、1uLpTrc99a-fljB(6)加入80uLG4831△fliC△fljB感受态中电转，加入1mLSOC培养基中复苏1小时，4000rpm离心5min后涂Amp抗性平板，37℃培养过夜。

3、挑取单克隆菌落PCR鉴定。

4、保菌G4831△fliC△fljB(pTrc99a-fljB(6))。

实施例5：

血清学实验

1、验证克隆表达实验

(1)取甘油管里的菌G4831△fliC△fljB(pTrc99a-fljB(6))3uL分别接于2支平行的盛有0.5%半固体培养基的U形管中，置37℃过夜培养，该菌均能从U形管的一端长到另一端，G4831△fliC△fljB则不能；

(2)取甘油管里的菌G4831△fliC△fljB(pTrc99a-fljB(6))1uL分别接于2个平行的0.3%的半固体平板中，37℃过夜培养，平板上的菌落均有鞭毛长出（具体见图10），G4831△fliC△fljB则没有。

2、血清验证实验

吸取(1)中长到U形管另一端的菌液5μL，或挑取(2)中半固体平板上的鞭毛转接于5mL摇管中置37℃静止培养至OD值为0.4-0.6时，5500rpm，离心5min收菌，倒掉上清后，加入200uL无菌生理盐水振荡重悬。

玻片凝集试验：吸取血清10μL于无菌载玻片上，加入5μL重悬的菌液于血清中，混匀，一分钟内即可用肉眼观察凝集结果，呈3+及以上凝集现象即为阳性，注意要用PBS溶液作为对照。

分别采用本发明所建克隆菌株和传统方法玻片凝集试验对比：

结论：

(1)克隆菌株与SalmonellaH:6发生凝集反应，且反应澄清透明，凝集颗粒较多、较大，反应强度为4+，且与SalmonellaH:Lcomplex和SalmonellaH:v无凝集反应；

(2)根据《中国生物制品规程》（2000年版）中的“沙门氏菌属诊断血清制造及检定规程”，血清的制备过程分为免疫抗原的制备、免疫抗原检定、免疫、采血、用免疫菌测定血清效价、吸收去除非目的抗体等步骤最终得到血清。本发明分别用工程菌G4831△fliC△fljB(pTrc99a-fljB(6))和传统方法G4819(3,10:1,v:1,6)经过以上步骤免疫家兔后采血，分离血清，在吸收这一步中，用工程菌免疫家兔分离到的血清与相应的一相抗原吸收菌几乎不发生凝集反应，只需吸收掉二相的1因子即可获得抗血清6，而通过传统方法得到的血清需经过大量的吸收工作才能得到特异性的抗血清6。

(3)利用本发明的技术能够获得特异性的沙门氏菌诊断血清，且耗时短，成本低。

实施例5：

应用实例

利用本发明的技术可以制得大部分的沙门氏菌H抗原诊断血清：

这些血清可用于沙门氏菌H抗原的鉴定，还可用于由患者粪便或其他材料分离的革兰氏阴性杆菌，经初步生化检查，疑似是沙门氏菌属的菌株的鉴定。

具体使用方法如下：细菌经过半固体培养基穿刺一次，挑取已生长到培养基顶部的菌落，转接到固体培养基上，过夜培养，先分别用各种多价血清做玻片凝集试验，阳性反应时，再与相应的单价血清做玻片凝集试验，作出诊断。在洁净玻片上用接种环滴加两滴彼此分离的生理盐水。

从营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，分别与玻片上的生理盐水混匀。

用接种环滴加1～2滴血清(10-15uL)于玻片上一个菌落与生理盐水的混合液中，另一个菌落与生理盐水的混合液中加入一滴生理盐水作为对照。

用接种环分别混匀玻片上的两种混合液。

轻轻摇动玻片1分钟，观察。于1分钟内呈2+及以上凝集现象为阳性，1分钟内呈现2+以下凝集现象为阴性。

凝集结果判断标准如下：

反应强度	判别依据
		4+	反应澄清透明，凝集颗粒较多、较大
3+	反应澄清透明，凝集颗粒较多、较小
		2+	反应有些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集
1+	反应非常混浊，只有少许颗粒状凝集
		-	反应完全混浊，未出现任何凝集

SEQUENCELISTING

<110>南开大学

<120>制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株及构建方法

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1112

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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<211>1537

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

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cttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcaagatccc120

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Claims

1.一种能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其特征在于：它是将含有编码鞭毛抗原6基因的重组质粒pTrc99a-fljB(6)，转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌G4831△fliC△fljB中得到的能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株；其中鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC，缺失后基因大小为1100bp，氯霉素乙酰转移酶基因，其序列为SEQIDNO：1；鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB，缺失后基因大小仍为1500bp，卡那霉素抗性基因，其序列为SEQIDNO：2；

其中所述G4831菌株的CMCC保藏编号为50752，所述的G4831△fliC△fljB构建方法是：先将pSim质粒转化进目的菌株G4831，然后利用pSim细菌DNA重组系统将fliC基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，最终得到相应的缺失菌株G4831△fliC△fljB；

所述重组质粒pTrc99a-fljB(6)是指将鞭毛抗原6相关的fljB基因序列插入pTrc99a载体所获得的重组质粒。

2.权利要求1所述的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其特征在于：它是将fliC基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，得到相应的缺失菌株G4831△fliC△fljB，然后再将构建的重组质粒pTrc99a-fljB(6)转入其中，筛选得到能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株。

3.一种能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌的构建方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB的构建；

(2)重组质粒pTrc99a-fljB(6)的构建；

(3)含有重组质粒pTrc99a-fljB(6)的克隆菌株的构建。