CN104774791B - 一种鸡白痢沙门氏菌sp9905及其应用 - Google Patents

一种鸡白痢沙门氏菌sp9905及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡白痢沙门氏菌SP9905，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学；保藏日期：2014年10月15日；藏编号：CCTCC NO.M 2014478。本发明还提供了所述的鸡白痢沙门氏菌用于制备活疫苗的应用。本发明制得的疫苗具有活菌数高、冻干死亡率低的优点，产品安全可靠，免疫保护作用在第14天可产生坚强保护力，免疫保护率达100%，并且对其它血清型沙门氏菌（肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌）的攻击同样具有较好的保护能力（80%~100%）。

Description

一种鸡白痢沙门氏菌SP9905及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鸡白痢沙门氏菌SP9905，及其在制备活疫苗中的应用和制备方法。
背景技术
鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)引起的家禽常见多发性传染病。鸡白痢在我国的养鸡场普遍存在，表现在育雏、育成阶段死亡率升高，给生产者造成严重的经济损失。国内对于鸡白痢的控制通常采用抗菌药物来减轻其危害，但在选择药物种类、给药途径、方法、剂量与维持时间上比较混乱，存在相当程度的盲目性，滥用或浪费现象非常普遍。同时长期反复用药，不仅使饲养成本上升，而且导致细菌耐药性增强以及禽产品的药物残留等一系列问题。事实证明仅依赖药物控制不是防治鸡白痢的良策。相比之下，采用疫苗免疫，既没有抗生素造成的细菌耐药性与药物残留问题，又可以产生持久的免疫力，因而更容易被养殖者和消费者接受。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡白痢沙门氏菌SP9905以及其制备活疫苗的应用，具体为一种可通过饮水或采食途径口服免疫的鸡白痢沙门氏菌活疫苗，同时还提供了该鸡白痢沙门氏菌活疫苗的制备方法。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种鸡白痢沙门氏菌SP9905，是从历年来收集、保存的500余株自然病例所分离的鸡白痢沙门氏菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的一株测试结果为天然弱毒的鸡白痢沙门氏菌菌种。
鸡白痢沙门氏菌SP9905(Salmonella pullorum SP9905)已于2014年10月15日送中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)保藏，名称及鉴别特征：鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，株号：SP9905，保藏编号：CCTCC NO.M 2014478。
本发明的提供了所述的鸡白痢沙门氏菌用于制备活疫苗的应用。
本发明的另一目的，由鸡白痢沙门氏菌天然弱毒菌株SP9905制成鸡白痢沙门氏菌活疫苗，用于预防或治疗鸡白痢的用途。
本发明所述的鸡白痢沙门氏菌活疫苗的制备方法，包括如下具体步骤：
1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌天然弱毒株SP9905菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种平板固体培养基，37℃培养20h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
2)细菌培养：将种子菌液按培养基总体积的2.5～5.0％接种，经发酵罐37℃深层通气培养18～20h后，收集菌液；
3)疫苗制备：将菌液经4000r/min离心15min去上清，菌泥立即加入灭菌冻干保护剂，充分混匀，分装后经真空冷冻干燥制成鸡白痢沙门氏菌活疫苗，每羽份活菌数不低于2.5×107CFU。
所述的液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油10.0ml、硫代硫酸钠8.0g、山梨醇10.0ml、L-谷氨酸钠2.5g、可溶性淀粉1.2g、葡萄糖10.0g、水解乳蛋白5.0g。液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成固体培养基。
所述的冻干保护剂组成为：脱脂奶粉100g、甘露醇10g、海藻糖50g、蔗糖20g、L-谷氨酸钠1.5g，蒸馏水1000ml。
本发明的有益效果如下：
本发明方法所生产的鸡白痢沙门氏菌活疫苗，培养活菌数为449～517亿/ml，冻干死亡率为14.9～22.5％，具有菌数高、冻干死亡率低的优点。产品安全可靠，其安全剂量达200个免疫剂量。疫苗口服免疫后在第10天即可产生较好的免疫保护力，在第14天可产生坚强保护力，免疫保护率达100％，并且对其它血清型沙门氏菌(肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌)的攻击同样具有较好的保护能力(80％～100％)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
1)分离纯化与染色镜检
鸡白痢沙门氏菌SP9905株于1999年5月从江苏省扬州市某鸡场的11月龄狼山鸡盲肠内容物中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集盲肠内容物加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液中37℃过夜培养，再接种麦康凯琼脂37℃培养24小时，挑取直径为0.5mm-1.0mm、灰白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37℃培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
2)生化鉴定
从马丁琼脂平板上挑取菌落，进行生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照说明书进行操作。结果菌株的各项生化指标(见表1)均符合鸡白痢沙门氏菌生化特性。
表1鸡白痢沙门氏菌生化鉴定结果
菌株 靛基质 尿素 氰化钾 赖氨酸 鸟氨酸 甘露醇 山梨醇
SP9905 - - - + + + -
菌株 水杨苷 丙二酸盐 ONPG 卫矛醇 葡萄糖 麦芽糖 乳糖
SP9905 - - - - + + -
菌株 蔗糖 阿拉伯糖 伯胶糖 鼠李糖 酒石酸 硫化氢 运动性
SP9905 - + + + - + -
3)血清学分型
从马丁琼脂平板上挑取菌落至生理盐水中，用比浊法调整细菌浓度至每毫升1.0×1010CFU，采用玻片凝集的方法对菌株进行血清学分型鉴定。具体操作方法如下：取洁净玻片1张，用微量移液器吸取25μl沙门氏菌阳性血清(除O122和O123购自中国兽医药品检查所外，其余血清均购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取25μl生理盐水做对照，然后吸取25μl菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀。轻轻摇动载玻片，2min后判定结果。检测结果如表2：SP9905为标准型菌株。
表2鸡白痢沙门氏菌血清学分型结果
菌株 A-F O1 O2 O4 O7 O8 O9
SP9905 ++++ ++ - - - - +++
菌株 O10 O11 O15 O19 O122 O123
SP9905 - - - - + ++++
注：“++++”代表100％凝集，“+++”代表75％凝集，“++”代表50％凝集，“+”代表25％凝集，“-”代表未发生凝集
下面结合具体实施例说明成鸡白痢沙门氏菌制备活疫苗的应用。
A.培养基配置
液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油10.0ml、硫代硫酸钠8.0g、山梨醇10.0ml、L-谷氨酸钠2.5g、可溶性淀粉1.2g、葡萄糖10.0g、水解乳蛋白5.0g。液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成固体培养基。
冻干保护剂组成为：脱脂奶粉100g、甘露醇10g、海藻糖50g、蔗糖20g、L-谷氨酸钠1.5g，蒸馏水1000ml。
B.试验方法
鸡白痢沙门氏菌活疫苗的制备方法，包括如下具体步骤：
1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌天然弱毒株SP9905菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种平板固体培养基，37℃培养20h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
2)细菌培养：将种子菌液按培养基总体积的2.5～5.0％接种，经发酵罐37℃深层通气培养18～20h后，收集菌液；
3)疫苗制备：将菌液经4000r/min离心15min去上清，菌泥立即加入灭菌冻干保护剂，充分混匀，分装后经真空冷冻干燥制成鸡白痢沙门氏菌活疫苗，每羽份活菌数不低于2.5×107CFU。
实施例2
将鸡白痢沙门氏菌SP9905菌种经复壮后，选取典型菌落扩大培养后制成种子菌液。将种子菌液按培养基总量的2.5％接种于液体培养基，37℃深层通气培养20h后收集菌液，4000r/min离心15min去上清，将菌泥立即加入灭菌冻干保护剂中充分混匀，分装后经真空冷冻干燥制成鸡白痢沙门氏菌活疫苗。检测结果表明，每毫升培养基含有活菌448.76亿，冻干死亡率为14.9％。
实施例3
将鸡白痢沙门氏菌SP9905菌种经复壮后，选取典型菌落扩大培养后制成种子菌液。将种子菌液按培养基总量的5％接种于液体培养基，37℃深层通气培养18h后收集菌液，4000r/min离心15min去上清，将菌泥立即加入灭菌冻干保护剂中充分混匀，分装后经真空冷冻干燥制成鸡白痢沙门氏菌活疫苗。检测结果表明，每毫升培养基含有活菌517.43亿，冻干死亡率为22.5％。
实施例4
按实施例2所述制备方法制成的鸡白痢沙门氏菌活疫苗对5日龄健康白来航雏鸡进行大剂量安全性测试，分饮水口服与肌肉注射2种途径实施。从接种之日起观察接种鸡生长情况，在15天时扑杀，观察其脏器变化情况。
结果见表3，由表可见，试验鸡按100-200倍免疫剂量口服接种或肌肉注射接种后，在15天的观察期内均健康存活，无明显脏器病变。上述结果表明，鸡白痢沙门氏菌SP9905活疫苗产品安全可靠。
表3鸡白痢沙门氏菌活疫苗的安全性检验结果
实施例5
按实施例2所述制备方法制成的鸡白痢沙门氏菌活疫苗经饮水途径免疫7日龄的健康白来航雏鸡，每羽份含活菌数不低于2.5×107CFU，同时设非免疫对照组。在免疫后的3d、7d、10d和14d，免疫组和对照组分别取20只鸡攻击致死剂量的鸡白痢沙门氏菌CVCC520，单独饲养14d，记录发病死亡情况。
结果见表4，由表可见，免疫组的试验雏鸡在免疫后3d、7d、10d和14d的攻毒存活率分别为20％、60％、85％和100％，而非免疫对照组的存活率分别为5％、10％、15％和10％。上述结果表明，鸡白痢沙门氏菌SP9905活疫苗在免疫后的第10天即可产生较好的免疫保护力，在第14天可产生坚强保护力，免疫保护率达100％。
表4鸡白痢沙门氏菌活疫苗的免疫效力检验结果
实施例6
按实施例2所述制备方法制成的鸡白痢沙门氏菌活疫苗经饮水途径免疫7日龄的健康白来航雏鸡，每羽份含活菌数不低于2.5×107CFU，同时设非免疫对照组。在免疫后的14d，分别用三种不同血清型沙门氏菌进行攻击，继续饲养14d后记录发病死亡情况，结果见表3。
由表5可见，免疫雏鸡对鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的攻毒保护率分别为100％、100％和80％。上述结果表明，鸡白痢沙门氏菌SP9905活疫苗不仅对同型菌株的攻击具有坚强的保护力，对其它血清型沙门氏菌的攻击同样具有较好的保护能力。
表5鸡白痢沙门氏菌活疫苗的交叉保护试验结果

Claims (2)

1.一种鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)SP9905，其特征在于：该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学；保藏日期：2014年10月15日；保藏编号：CCTCC NO.M 2014478。
2.由权利要求1所述的一种鸡白痢沙门氏菌SP9905制备的活疫苗，其特征在于：通过以下方法制备：
1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP9905菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种平板固体培养基，37℃培养20h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37℃培养24h后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；所述的液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油10.0ml、硫代硫酸钠8.0g、山梨醇10.0ml、L-谷氨酸钠2.5g、可溶性淀粉1.2g、葡萄糖10.0g、水解乳蛋白5.0g；所述的固体培养基通过液体培养基中加入1.5％的纯化琼脂粉制成；
2)细菌培养：将种子菌液按培养基总体积的2.5～5.0％接种，经发酵罐37℃深层通气培养18～20h后，收集菌液；
3)疫苗制备：将菌液经4000r/min离心15min去上清，菌泥立即加入灭菌冻干保护剂，充分混匀，分装后经真空冷冻干燥制成鸡白痢沙门氏菌活疫苗，每羽份活菌数不低于2.5×107CFU；所述的冻干保护剂组成为：脱脂奶粉100g、甘露醇10g、海藻糖50g、蔗糖20g、L-谷氨酸钠1.5g，蒸馏水1000ml。
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