CN108570424B - 一组适合黄羽肉鸡临床应用的鸡白痢沙门氏菌抗原 - Google Patents

一组适合黄羽肉鸡临床应用的鸡白痢沙门氏菌抗原 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽医诊断技术领域，尤其是一组适合黄羽肉鸡临床应用的鸡白痢沙门氏菌抗原，鸡白痢沙门氏菌LHSP001、LHSP016均已于2017年8月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为CGMCC No.14486和CGMCC No.14487。鸡白痢沙门氏菌凝集抗原，由上述的鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016制成。本发明制备的凝集抗原，可在临床上高效检测出黄羽肉种鸡中，国内参考抗原无法检测出的鸡白痢感染阳性鸡，提高黄羽肉种鸡养殖企业的鸡白痢净化效率。

Description

一组适合黄羽肉鸡临床应用的鸡白痢沙门氏菌抗原
技术领域
本发明涉及兽医诊断技术领域，具体领域为一组适合黄羽肉鸡临床应用的鸡白痢沙门氏菌抗原。
背景技术
鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的传染病，主要侵害雏鸡，以白痢、衰竭和败血症为特征，常导致大批死亡。成年鸡感染后多呈慢性经过或不显症状成为隐性感染者，隐性感染者可将病原垂直传播给下一代使得雏鸡感染发病甚至死亡。从上个世纪八十年代提出“两白一支”开始，我国养禽企业开展鸡白痢沙门氏菌净化已有三十多年了。然而，由于净化需要高额的财力和人力投入，企业在净化过程中，持续性和严格性均存在较大不足。欧美主要养禽发达国家已完成鸡白痢净化工作，中国目前只有少数公司通过从国外已净化种禽公司引种实现鸡白痢净化，其它绝大多数养禽公司尤其是黄羽肉鸡养殖企业，尚未实现鸡白痢的净化。
鸡白痢沙门氏菌感染种鸡后，可在其巨噬细胞内长期存活，待种鸡性成熟后在卵巢、输卵管、睾丸等性器官定殖，并产生持续高水平的凝集抗体。在种鸡性成熟后采用鸡白病凝集抗原检测血清抗体，淘汰阳性种鸡，可以有效减少传染源。
目前，大部分黄羽肉种鸡养殖场的鸡白痢沙门氏菌阳性率较高，净化工作难度大。血清或全血凝集反应是鸡白痢净化过程中最重要的技术，然而该技术还存在的主要问题有：
(1)对黄羽肉种鸡的临床血清样品进行大量检测，发现国外商业化公司的参考抗原与国内的参考抗原的检测结果存在一定的不符合率；
(2)近几年，从黄羽肉种鸡中新分离到了一些沙门氏菌菌株，这些菌株所产生的阳性血清不在国内参考抗原的反应谱之内。鉴于上述问题，在实际生产中，有可能存在阳性鸡未得到及时检出和淘汰，这影响了鸡白痢净化效率，给养禽企业带来一定的损失。
因此，迫切需要适合黄羽肉鸡的、可在临床上稳定高效检测出鸡白痢沙门氏菌阳性鸡只的凝集抗原或凝集抗原组合。
发明内容
本发明的目的在于提供一组适合黄羽肉鸡临床应用的鸡白痢沙门氏菌抗原，以解决现有技术中阳性鸡未得到及时检出和淘汰，进而影响鸡白痢净化效率的问题。
本发明从黄羽肉种鸡上持续分离鸡白痢沙门氏菌，根据其凝集反应特性，筛选出性能稳定、反应谱广的凝集抗原菌株，并制备凝集抗原组合。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一组鸡白痢沙门氏菌菌株，鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016均已于2017年8月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为CGMCCNo.14486和CGMCC No.14487。
一种鸡白痢沙门氏菌凝集抗原，由鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016制成。
一种鸡白痢沙门氏菌凝集抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养48h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养48h后用PBS洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
(2)抗原原液制备：将种子菌液按培养基体积的0.5％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养44h后取出，用含2％福尔马林的PBS溶液洗下菌苔；振荡摇匀，静置自然沉淀7天，吸弃上清后离心弃酒精留沉淀；采用PBS进行重悬，并用滤膜进行过滤制得抗原原液；
(3)抗原制备：调整抗原原液浓度至2.5×1010CFU/ml，分别加入结晶紫和甘油，进行匀质处理。
本发明所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原的制备方法，其中，所述液体培养基的组成为氯化镁孔雀绿肉汤，其中每升肉汤包括胰蛋白胨4.5g，氯化钠7.2g，磷酸二氢钾1.44g，氯化镁36.0g和孔雀绿0.036g。
本发明所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原的制备方法，其中，所述固体平板培养基、固体斜面培养基和固体扁瓶培养基的组成为T.G.甘油培养基，其配方为牛肉汤1000ml，蛋白胨20g，甘油20g，硫代硫酸钠5g，氯化钠5g和琼脂粉20g，pH为7.0。
本发明还提供了所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原在鸡白痢检测中的应用。
本发明尤其还提供了所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原在黄羽肉鸡中的临床应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)使用本发明的凝集抗原组合对黄羽肉种鸡的临床血清样品进行大批量检测，发现该凝集抗原组合具有高效、广谱的特性，适合在大型黄羽肉种鸡养殖场推广应用。
(2)本发明制备的凝集抗原，可在临床上高效检测出黄羽肉种鸡中，国内参考抗原无法检测出的鸡白痢感染阳性鸡，提高黄羽肉种鸡养殖企业的鸡白痢净化效率。
微生物保藏信息
编号CGMCC No.14486和CGMCC No.14487，命名Salmonella pullorum，2017年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
鸡白痢沙门氏菌菌株的分离鉴定
在江苏立华牧业股份有限公司的雪山草鸡中分离得到，并在江苏立华牧业股份有限公司兽医中心保存。
通过选择性培养、生化试验、血清学试验、相关基因的核酸鉴定、动物致病性回归试验及细菌再分离，对菌种进行鉴定，确定为鸡白痢沙门氏菌。临床共分离到菌株63株，最终筛选到2株用于本发明中的凝集抗原制备。
1、细菌分离纯化
鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016是2014年11月从公司孵化21d的雪山草鸡死胚中进行分离得到。
具体分离方式：无菌采集卵黄液100μL接种到3mL氯化镁孔雀绿肉汤(MM)中37℃培养过夜，采用一次性接种环蘸取增菌后的菌液在沙门氏菌XLD培养基上划线培养，将平皿放到培养箱中37℃培养48h。挑取在沙门氏菌XLD培养基(XLD培养基每升琼脂包括：酵母浸粉3.0g，L-赖氨酸5.0g，乳糖7.5g，蔗糖7.5g，木糖3.75g，氯化钠5.0g，硫代硫酸钠6.8g，柠檬酸铁铵0.8g，去氧胆酸盐2.5g，苯酚红0.08g，琼脂15.0g，pH值7.4±0.2)上生长为黑色，直径1～2mm的菌落，接种到T.G.甘油培养基37℃培养24h。
2、染色镜检
挑取T.G.甘油培养基纯培养物，在玻璃板上涂布均匀并在酒精灯上烘干。参考革兰氏染色方法分别使用草酸结晶紫、碘液、酒精和沙黄染色液分别染色1min，脱色30s和复染1min，烘干。采用光学显微镜使用油镜镜检，典型鸡白痢沙门氏菌形态为两端稍圆的短小杆菌，多单个存在。
3、PCR鉴定
采用菌落PCR的方法，挑取微量T.G.甘油培养基纯培养物进行两重PCR扩增，SG上游引物5’-gat ctg ctg cca gct caa-3’，下游引物5’-gcg ccc ttt tca aaa cat a-3’，SGP上游引物5’-cgg tgt act gcc cgc tat-3’，下游引物5’-ctg ggc att gac gca aa-3’，如SEQ ID NO:1-4所示。鸡白痢沙门氏菌阳性菌株在参考Marker250bp位置有一条带。
4、生化鉴定
对于T.G.甘油培养基纯培养物，挑取少量菌苔进行生化鉴定。生化鉴定反应管够自杭州滨和微生物试剂有限公司，具体使用方法参考厂家推荐说明书操作。主要选取鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的部分重要区分指标进行鉴定，LHSP001和LHSP016鉴定结果见下表1。
表1 鉴定结果
LHSP001 LHSP016
半固体培养基 - -
H<sub>2</sub>S + +
赖氨酸脱羧酶 + +
鸟氨酸脱羧酶 + +
尿素 - -
卫矛醇 - -
TSI葡萄糖(产酸) + +
TSI葡萄糖(产气) + +
TSI乳糖 - -
TSI蔗糖 - -
TSI硫化氢 + +
5、致病性试验
挑取T.G.甘油培养基纯培养物，接入到生理盐水中，采用酶标仪测定OD值的方法调节菌液浓度值5*1011cfu/mL，按照10倍比稀释的方法分别稀释成5*1010cfu/mL、5*109cfu/mL，每组7只8日龄的雪山草鸡，每只鸡口服0.2mL菌液，7d后剖杀记录病变结果。如表2所示。结果显示两株菌都有很强的致病性，能够引起鸡明显发病，同时与对照组相比体重明显偏低。
表2 病变结果
实施例2
鸡白痢沙门氏菌凝集抗原制备
(1)培养基组配置：
液体培养基：氯化镁孔雀绿肉汤(MM)每升肉汤包括：胰蛋白胨4.5g，氯化钠7.2g，磷酸二氢钾1.44g，氯化镁36.0g和孔雀绿0.036g。
固体培养基：T.G.甘油培养基：牛肉汤1000ml，蛋白胨20g，甘油20g，硫代硫酸钠5g，氯化钠5g和琼脂粉20g，pH为7.0。
(2)种子菌液的制备：将实验室保存的鸡白痢沙门氏菌经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养48h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养48h后用PBS洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
(3)抗原原液制备：将种子菌液按培养基体积的0.5％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养44h后取出，用含2％福尔马林的PBS溶液洗下菌苔；加菌液2倍体积的酒精充分振摇，静置自然沉淀7天，吸弃上清后离心弃酒精留沉淀；采用PBS进行重悬，并用滤膜进行过滤制得抗原原液；
(4)抗原制备：调整抗原原液浓度至2.5×1010CFU/ml，分别加入结晶紫和甘油，进行匀质处理。
凝集对比试验
(1)玻板凝集试验
采用玻板凝集法，对样品进行检测，具体操作方法如下：
1)用滴管在洁净的玻璃板上加上一排抗原(10个)，加抗原时保持滴管垂直滴加，每次滴加2滴，抗原在使用前需摇匀；
2)从第一个抗原开始依次加入血清，并将血清与抗原混合均匀；
3)在10个血清加好后轻轻晃动玻板，让血清充分混合反应；
4)摇匀抗原加下一排抗原(保证1min之内)；
5)下一排抗原加好后开始对前一排结果进行判定；
(2)凝集对比试验
用分离鉴定的鸡白痢沙门氏菌制备SPF源多克隆血清，分别与本发明制备的凝集抗原、中国参考抗原和美国参考抗原进行凝集对比试验。检测结果如表3所示：
表3
“++++”代表100％凝集；“+++”代表75％凝集；“++”代表50％凝集；“+”代表25％凝集；“-”代表未发生凝集；N/A表示未进行检测。
50％及以上凝集，代表阳性。25％凝集，代表可疑。不凝集，代表阴性。
结果显示，美国标准抗原检测阳性率为65.2％，中国标准抗原检测阳性率为26.1％，自制抗原组合(A+B)检测阳性率为100％。从结果可以看出，美国标准抗原的检测结果与中国标准抗原的检测结果(阳性率)存在39.1％的差异，中国标准抗原的检测阳性率比自制抗原组合的阳性率低73.9％，这也说明，这些阳性血清不在国内标准抗原的反应谱之内。尤其值得注意的是，本发明的抗原组合可高效凝集上述阳性血清。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏立华牧业股份有限公司
江苏兴牧农业科技有限公司
<120> 一组适合黄羽肉鸡临床应用的鸡白痢沙门氏菌抗原
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatctgctgc cagctcaa 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgccctttt caaaacata 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggtgtactg cccgctat 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgggcattg acgcaaa 17

Claims (7)

1.一组鸡白痢沙门氏菌菌株，其特征在于：鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016均已于2017年8月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为CGMCC No.14486和CGMCC No.14487。
2.一种鸡白痢沙门氏菌凝集抗原，其特征在于：由权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016制成。
3.一种鸡白痢沙门氏菌凝集抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌LHSP001和LHSP016经液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37℃培养48h，挑选典型菌落接种固体斜面培养基，37℃培养48h后用PBS洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液；
(2)抗原原液制备：将种子菌液按培养基体积的0.5％接种固体扁瓶培养基，经37℃培养44h后取出，用含2％福尔马林的PBS溶液洗下菌苔；加菌液2倍体积的酒精充分振摇，静置自然沉淀7天，吸弃上清后离心弃酒精留沉淀；采用PBS进行重悬，并用滤膜进行过滤制得抗原原液；
(3)抗原制备：调整抗原原液浓度至2.5×1010CFU/ml，分别加入结晶紫和甘油，进行匀质处理。
4.根据权利要求3所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原的制备方法，其特征在于：所述液体培养基为氯化镁孔雀绿肉汤，其中，每升肉汤包括胰蛋白胨4.5g，氯化钠7.2g，磷酸二氢钾1.44g，氯化镁36.0g和孔雀绿0.036g。
5.根据权利要求4所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原的制备方法，其特征在于：所述固体平板培养基、固体斜面培养基和固体扁瓶培养基为T.G.甘油培养基，其配方组成为牛肉汤1000ml，蛋白胨20g，甘油20g，硫代硫酸钠5g，氯化钠5g和琼脂粉20g，pH为7.0。
6.权利要求2所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原在鸡白痢检测中的应用。
7.权利要求2所述的鸡白痢沙门氏菌凝集抗原在黄羽肉鸡中的临床应用。
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